1 Самарский государственный медицинский университет Кафедра медицинской

1

Самарский государственный медицинский университет Кафедра медицинской биологии, генетики и экологии тема: «Современные методы диагностики наследственных болезней» Заведующая кафедрой доктор биологических наук, профессор Лидия Николаевна Самыкина лекция № 7 ноябрь 2014 года

ДНК-диагностика – совокупность методов по выявлению
изменений в структуре генома с целью диагностики наследственных заболеваний. 3

Генетический груз

Моногенные болезни • Частые наследственные заболевания – 1: 10 000 и чаще • Редкие наследственные заболевания – 1: 100 000 и реже • Каждый человек – гетерозиготный носитель 5 и более мутаций

ДНК-диагностика Изучает непосредственную причину заболевания Наиболее адекватная и тонкая диагностика Возможна даже в тех случаях, когда неизвестен ген, ответственный за заболевание 6

ВИДЫ ДНК-ДИАГНОСТИКИ • ПОДТВЕРЖДАЮЩАЯ • ПРЕСИМПТОМАТИЧЕСКАЯ • ДИАГНОСТИКА НОСИТЕЛЬСТВА • ПРЕНАТАЛЬНАЯ

ПОДТВЕРЖДАЮЩАЯ: биохимическая картина не ясна, никакая биохимия не позволяет выяснить гетерозиготное носительство. Врач сомневается в диагнозе. Эта диагностика ничего не может исключить, а только подтвердить.

ПРЕСИМПТОМАТИЧЕСКАЯ: заболевания Хорея Гентингтона, болезнь Альцгеймера. Данные анализа отдаются только врачу, так как возможен суицид. Хорея Гентингтона - болезнь экспансии. Пренатальная диагностика с 1992 г. позволила уменьшить число суицидов.

ДИАГНОСТИКА НОСИТЕЛЬСТВА, сцепленного с Х–хромосомой (гемофилия, миодистрофия Дюшенна). Если женщина – носитель, то все мальчики будут больны, а девочки здоровы.

ПРЕНАТАЛЬНАЯ: прогноз потомства, т. к для большинства наследственных болезней лечения не существует. Материал – ворсинки Хориона, хориоцентез на 9 -12 неделе беременности. Если хориоцентез не успели, то берется кордоцентез (до 22 недель, после 22 недели нельзя).

Типы ДНК-диагностики ПРЯМАЯ Определение мутации в гене, являющейся непосредственной причиной заболевания КОСВЕННАЯ Определение хромосомы, несущей поврежденный ген при семейном анализе 12

ПРЯМАЯ ДНК-ДИАГНОСТИКА + 100%-ная точность; + возможна при сомнительном диагнозе; + возможна при полилокусных заболеваниях; + возможна беспробандная диагностика; - необходимо знание структуры гена; - информативна не для всех семей. 13

Информативность прямой диагностики Заболевание Информативность Ген (локализация) диагностики Фенилкетонурия РАН (12 q 22 -q 24. 1) Муковисцидоз CFTR (7 q 31. 2) Миодистрофия Дистрофин (Хр21. 2) Дюшенна/Беккера 80% 72% 60% 14

Прямая ДНК-диагностика предполагает непосредственное выявление мутации в исследуемом гене. Методические подходы, используемые при прямой ДНКдиагностике того или иного наследственного заболевания, зависят от характера мутаций и молекулярной организации соответствующего гена. 15

Методы прямой ДНК-диагностики: § Количественная флюоресцентная ПЦР; § Real-time ПЦР; § Анализ кривой плавления; § MLPA-анализ (количественная лигазная реакция); § Ресеквенирование.

• Из методов прямой ДНК-диагностики чаще всего используется количественная флюоресцентная ПЦР. • MLPA-анализ (количественный анализ копий). Ошибка - 16%. • Real-time ПЦР для определения моногенных заболеваний нам не нужна, так как точность меньше чем в MLPA, и ошибка составляет 25%. 17

MLPA. Количественный анализ копий хромосомы Х человека Мужчина X Женщина ХХХ MRC-Holland (www. mrc-holland. com)

Анализ наиболее частых мутаций в гене PAH методом MLPA

Анализ наиболее частых мутаций в гене PAH методом ПДРФ А) одна пара праймеров и две эндонуклеазы рестрикции IVS 12+1 g>a Norm R 252 W R 261 Q R 408 W Norm Б) две пары праймеров и одна эндонуклеаза рестрикции 11 ex Norm IVS 10 -11 g>a 3 ex Norm I 65 T 1 2 3 P 281 L 7 ex Norm R 158 Q 5 ex Norm

Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) в гене РАН (12 q 24. 1) – ФКУ. • Изменчивость нуклеотидной последовательности ДНК, которую обнаруживают с помощью переваривания ДНК ферментами рестрикции по образованию фрагментов разной длины, выявляемых с помощью электрофореза и переноса на плотную среду с гибридизацией меченой пробой. 21

В настоящее время большинство протоколов прямой ДНК-диагностики базируется на полимеразной цепной реакции (ПЦР). Изящность, простота исполнения, непревзойденные показатели чувствительности и специфичности принесли новому методу небывалую популярность. За короткое время ПЦР-анализ распространился по всему миру, быстро выйдя из лабораторий научных институтов в сферу практического клинического использования. 22

Разработка принципов ПЦР стала
поистине революционизирующим этапом в развитии
молекулярной генетики, что нашло свое отражение в
присуждении ее автору Кэри Муллису Нобелевской премии
за 1993 год в области химии. Этот метод находится в постоянном развитии, с появлением все новых и новых модификаций, существенно расширяющих его диагностические и исследовательские возможности. 23

Кэри Муллис родился в городке Леноир в Северной Каролине 28 декабря 1944 года в семье фермера. Муллис окончил Технологический институт Джорджии в 1966 году и защитил диссертацию по биохимии в Университете Калифорнии в Беркли в 1972 году, где он изучал структуру и синтез белка. После диссертации Муллис временно ушёл из науки. Он писал фантастику, но вскоре вернулся в биохимию и провёл 2 года в школе медицины Канзасского университета, а затем перешёл в биотехнологическую корпорацию. Работая в компании, Муллис разработал метод полимеразной цепной реакции, который революционизировал 24 молекулярную биологию и медицину. В 1993 году он получил за это Нобелевскую премию по химии.

Диагностика наследственных заболеваний, инфекционных заболеваний, в том числе: • вызванных агентами, трудно поддающимися культивированию, • генотипирование микроорганизмов, • оценка их вирулентности, • определение устойчивости микрофлоры к антибиотикам, • генодиагностика и • генетическая дактилоскопия, • пренатальная диагностика, • биологический контроль препаратов крови - вот далеко не полный перечень направлений медицины, где с успехом применяется полимеразная цепная реакция (ПЦР). 25

• Принцип действия ПЦР заключается в амплификации (лат. amplificatio — усиление, увеличение), последовательностей ДНК совершенно невероятным способом. 26

Основы ПЦР Мы начинаем с фрагмента ДНК, который хотим амплифицировать для получения множества копий. Что нам для этого нужно? 1) Нам нужно несколько молекул ДНК, включающих фрагмент ДНК, который мы хотим амплифицировать. Назовем такую молекулу «матрица» , а интересующий нас фрагмент назовем «заданная последовательность» . 27

Матрица ДНК для ПЦР Двунитевая ДНК Заданная последовательность 28

2) Нам потребуется два праймера ПЦР. Праймеры представляют собой короткие фрагменты однонитевой ДНК, совпадающие с последовательностями обоих концов нашего заданного фрагмента ДНК. Они нужны для запуска синтеза ДНК. 29

Праймеры для ПЦР 30

• Таким образом, в реакционную смесь вносятся два праймера: один для "+"-цепи, второй для "-"-цепи. • Присоединившись к противоположным цепям молекулы ДНК, праймеры ограничивают собой тот ее участок, который будет в дальнейшем многократно удвоен или амплифицирован. • Длина такого фрагмента, который называется ампликоном, обычно составляет несколько сот нуклеотидов. 31

3) Фермент для производства копий ДНК. Мы используем Tag полимеразу из Thermus aguaticus (грамотрицательная палочковидная экстремально-термофильная бактерия обитает в гейзерах). Термостабильные ферменты (в особенности термостабильная Taq-полимераза) используются как инструменты в молекулярногенетических исследованиях. 32

• Дальнейший анализ продуктов ПЦР в процессе
прямой ДНК-диагностики предполагает исследование
конкретных особенностей амплифицированного участка гена (дополнительной копии гена). • Так, при заболеваниях, обусловленных экспансией тринуклеотидных повторов (хорея Гентингтона), продукты амплификации различаются по своей длине. Благодаря
этому достигается четкое электрофоретическое разделение нормальных и мутантных аллелей и точное определение патологически удлиненного фрагмента, т. е. ДНК-диагностика болезни. 33

• Тип наследования хореи Гентингтона – аутосомно-доминантный с полной пенетрантностью. Это означает, что половина детей больного (независимо от их пола) унаследуют от него мутантный ген и заболевают по достижении возраста дебюта заболевания. • Ген гентингтина – НТТ (IT 15), повреждение которого приводит к болезни Гентингтона, картирован в локусе 4 р16. 3. В 5’ – области этого гена содержится нестабильная последовательность тринуклеотидных повторов (САG). 34

35

• Для быстрой диагностики носительства делеций в гене дистрофина у больных прогрессирующей мышечной дистрофией Дюшенна и Бекера проводится одновременная амплификация набора наиболее часто мутирующих экзонов данного гена. Поскольку эти заболевания наследуются по Xсцепленному рецессивному типу и связаны с повреждением у мальчиков единственной Xхромосомы, в случае протяженной делеции при электрофорезе продуктов реакции будет выявлено отсутствие одного или нескольких фрагментов ДНК (экзонов), что может служить молекулярным подтверждением диагноза. 36

Таким же сравнительно простым путем с помощью анализа размеров продуктов ПЦР на электрофореграмме может проводиться прямая детекция
делеций и вставок в составе амплифицированного участка гена. Протяженные делеции, захватывающие целые экзоны, могут быть выявлены по изменению длины. 37

Количественный анализ экзонов гена дистрофина Гомозиготная делеция шести экзонов гена DMD 1 3 4 здоровый контроль 6 6 3 5 1 2 2 5 4 38

Количественный анализ экзонов гена дистрофина Гетерозиготная делеция экзонов 1 -6 2 гена DMD 3 5 4 1 Здоровый контроль 1 5 4 3 6 2 6 39

• При отсутствии делеций амплифицированные фрагменты после электрофоретического разделения и окрашивания можно наблюдать в виде отдельных полос. Выбирая определенные участки гена для амплификации, можно оценить размер делеции с точностью до экзона и определить её локализацию внутри гена. 40

• Более сложную задачу представляет собой выявление точковых мутаций (чаще всего нуклеотидных замен) в определенных сайтах. Для этой цели метод ПЦР используется в комбинации с другими методами молекулярно-генетического анализа. 41

• Моногенных болезней с наличием четко определенных мутаций важных для ДНК- диагностики сравнительно немного. • Примером такого рода является муковисцидоз. • Ген CFTR расположен 7 q 31. 2. • При муковисцидозе с очень высокой частотой в ряде популяций встречается одна и та же мутация в 10 -м экзоне гена CFTR (делеция трех нуклеотидов в позиции 508). 42

Существует большое число модификаций метода
ПЦР, разработанных для быстрого сканирования и поиска известных генных мутаций. Среди них более подробного упоминания заслуживают следующие подходы: 43

• Метод сайт-направленной модификации амплифицированной ДНК — основан на использовании в ПЦР так называемого mismatch (мисматч)-nраймера (не полностью комплементарного матрице), который отличается от матричной ДНК-последовательности на один нуклеотид и взаимодействует с мутантным нуклеотидом. 44

• В дальнейшем проводят электрофоретический анализ меченых однонитевых фрагментов ДНК. • ПЦР нормального и мутантного аллеля отличаются друг от друга: • у здорового (нет мутации) на электрофореграмме будет 1 фрагмент, у больных - 2 дополнительных фрагмента (ПЦР сайт-направленного мутагенеза). Используется для диагностики муковисцидоза. 45

• Метод обратно-транскриптазной ПЦР (RT-PCR) — используется в тех случаях, когда в качестве объекта исследования удобнее использовать не геномную ДНК, а более компактную и информационно “насыщенную” к. ДНК, получаемую после соответствующей обработки образцов тканей, например, биопсийного материала или клеточных линий лимфоцитов, фибробластов и т. д. Важным условием здесь является экспрессия (хотя бы в минимальной степени) нужного гена в исследуемой ткани. Суть метода показана на рисунке. 46

47

к. ДНК (комплементарная) – одноцепочная молекула, полученная путем обратной транскрипции на м. РНК и содержащая только экзоны (кодирующие участки гена). 48

На первом этапе проводится обратная транскрипция м. РНК, и получаемые молекулы к. ДНК служат матрицей для полимеразной цепной реакции. Последний метод особенно эффективен для детекции мутаций, ведущих к синтезу “усеченного” белка (нонсенс-мутации, мутации сплайсинга, крупные делеции) — так называемый РТТ-анализ (Protein Truncation Test). 49

Мутационный скрининг гена Для обнаружения неизвестных нуклеотидных замен в анализируемом участке (участках) гена возникает необходимость проведения секвенирования - определения точной нуклеотидной последовательности определенного фрагмента ДНК. На практике наиболее широкое распространение получило секвенирование по классическому методу Сэнгера. 50

• Особенностью скрининговых технологий является то обстоятельство, что после предварительного отбора аномальных образцов наличие мутации подтверждается секвенированием. • В конкретных популяциях мутационный поиск при том или ином наследственном заболевании может быть существенно упрощен в связи с высокой частотой так называемых мажорных мутаций, т. е. мутаций, которые являются преобладающими и обусловливают значительный процент всех случаев заболевания в данной популяции. 51

52

Косвенная ДНК-диагностика и анализ генетического сцепления Принцип косвенной ДНК-диагностики Если непосредственное определение мутаций в анализируемом гене невозможно или затруднено, для определения генетического статуса консультируемых лиц в семье, отягощенной наследственным заболеванием, может быть использована косвенная (непрямая) ДНК-диагностика. Она возможна в том случае, если ген заболевания достаточно картирован, т. е. локализован в конкретном и достаточно узком участке определенной хромосомы. 53

Важно подчеркнуть, что косвенная ДНК-диагностика может проводиться даже в тех случаях, когда какая-либо другая информация о гене болезни, помимо его хромосомного расположения, отсутствует (т. е. когда неизвестны структура и размер гена, характер мутаций в нем, кодируемый геном белок и т. д. ). 54

Сущность косвенной ДНКдиагностики заключается в анализе наследования у больных и здоровых членов семьи полиморфных (гипервариабельных) генетических маркеров, расположенных в изучаемой хромосомной области и, следовательно, сцепленных с геном болезни. 55

Генетические маркеры – различные типы полиморфизмов белков и ДНК, которые используются в популяционных исследованиях при картировании генов. 56

В качестве полиморфных маркеров выступают участки ДНК, существующие в виде нескольких возможных аллельных вариантов и различающиеся у разных лиц по тем или иным структурным особенностям (например, по нуклеотидным заменам в определенном сайте или по числу копий ди- и тетрануклеотидных повторов). 57

Термин “сцепление” (один из ключевых терминов клинической и молекулярной генетики) означает, что анализируемый маркер располагается в непосредственной близости от патологического гена, в связи с чем маркер и ген болезни после кроссинговера остаются в составе одного хромосомного сегмента и передаются потомству как единое целое. 58

Благодаря вариабельности состава таких маркерных участков ДНК обычно удается дифференцировать материнское или отцовское происхождение конкретного маркерного аллеля при анализе ДНК обследуемого лица (т. е. определить фазу сцепления). Анализ полиморфных генетических маркеров имеет целью проследить в ряду поколений наследование каждой из родительских хромосом. 59

На практике для повышения точности и информативности косвенной ДНК-диагностики обычно используют несколько маркеров, расположенных в изучаемой хромосомной области. Идеальным является использование внутригенных маркеров в комбинации с тесно сцепленными маркерами, фланкирующими изучаемый ген с теломерной и центромерной сторон. 60

Таким образом, для каждого из хромосомных локусов можно установить и графически реконструировать последовательную серию аллелей изучаемых генетических маркеров. Такая комбинация аллелей различных локусов на одной хромосоме носит название гаплотип. 61

62

При невозможности обнаружения конкретных нуклеотидных изменений в гене проводится косвенная ДНК-диагностика с вне- или внутригенными маркерами, позволяющая оценивать сегрегацию патологического участка Х-хромосомы у матери, больного ребенка и плода и тем самым с высокой вероятностью определять генетический статус плода. 63

Косвенная ДНК-диагностика некоторых заболеваний, для которых прямая очень дорога и/или трудоемка • Гемофилия A, B - Хq 27 -28 • Синдром Марфана – 15 q 21. 1 • Рецессивный поликистоз почек– 6 p 21. 1– p 12 64

Если в настоящее время лабораторные исследования в большинстве случаев проводятся уже при развившейся болезни и начатом лечении, то молекулярнобиологическая лабораторная информация даст возможность выявить наклонность человека к некоторым видам патологии и степени чувствительности к некоторым лекарствам. Это позволит обосновать предсказательный, профилактический и персонализированный характер медицины будущего. 65

Косвенная ДНК-диагностика обладает тремя основными недостатками: 1) Для ее проведения требуется анализ ДНК нескольких членов семьи, как правило, из двух-трех поколений; таким образом, в неполных (неинформативных) семьях такая диагностика невозможна. 2) Для проведения косвенной ДНКдиагностики у лиц из группы риска необходимо предварительно диагностировать заболевание хотя бы у одного индивида в родословной; следовательно, косвенный подход неприменим для ДНК-диагностики единичных (спорадических) случаев заболевания. 67

3) При проведении косвенной ДНК-диагностики всегда существует вероятность ошибки, связанная с возможной рекомбинацией в мейозе между геном болезни и исследуемым маркером, в результате чего “патологический” маркерный аллель и ген болезни у потомка разойдутся по разным хромосомам. Для известных на сегодня генетических маркеров, используемых в косвенной ДНКдиагностике наследственных заболеваний, вероятность расхождения с геном болезни в мейозе (т. е. вероятность ошибки) не превышает 1 -3%; таким образом, точность косвенной ДНКдиагностики болезни составляет обычно >=97%. 68

• л 6 • ДНК-диагностика гемофилии В проводится как косвенным, так и прямым методом. Косвенная диагностика основана на анализе с помощью ПЦР внутри -генных полиморфных сайтов: Taq 1 (в положении 11109 -11113); инсерционного полиморфизма в интроне А (рестриктазы Яш/1 и Dde 1); Taql в интроне F в положении /z. метод идгч^-анализа информативен примерно у 60— 70% всех семей с гемофилией В [Aseev et al. , 1994]. Прямая диагностика гемофилии В включает амплификацию геномных фрагментов гена F 9 с последующей детекцией изменений в последовательностях ПЦР продуктов методом СМС (химического расщепления) (см. гл. 2) и прямое секвенирование фрагментов для определения точной молекулярной природы мутаций.

• л 6 • Прямая диагностика гемофилии В включает амплификацию геномных фрагментов гена F 9 с последующей детекцией изменений в последовательностях ПЦР продуктов методом СМС (химического расщепления) и прямое секвенирование фрагментов для определения точной молекулярной природы мутаций.