1 Обмен соединений азота 2 Синтрофию азота в

1 Обмен соединений азота

2 Синтрофию азота в биосфере выражает схема к занятию 16 нашего учебно-методическо-го пособия. Там же дана дополнительная литература по теме и описан парадокс между инертной молекулой азота и универсальной потребностью организмов в его атомах для: биосинтеза аминокислот, белков, нуклеиновых кислот, порфиринов и прочих низкомолекулярных веществ, часть которых объединяют термином витамины. Эту задачу решили nif-гены, ответственные за экспрессию Е восстановления азота и главный из них – нитрогеназу. Они широко распространены у прокариот-азотфиксаторов, включая архебактерии, Сyanobacter и Azotobacter. Так как у эукариот nif-гены отсутствуют, то переводя N2 атмосферы в доступный другим таксонам NH4+, азотфикса-торы делают его вслед за углеродом, основой синтрофии = совместного питания организмов. Подробней об азотфиксаторах – в курсе микробиологии, а об их симбиотических клетках-продуцентах – в курсе физиологии растений.

3 Азотистый обмен в клетках и организмах консументов включил лишь часть способностей продуцентов. Поэтому основной для них источник азота - пищевые белки, доступней и чаще растительные. Поедая растения, животные получают 10 аминокислот и витамины: биотин = Н, никотинамид = РР = В5, тиамин = В1, рибофлавин = В2, пиридоксин = В6, фолевую к-ту = В9 и коррины = В12, как незаменимые соединения азота. Важно учитывать, что: 1. В стеблях белка мало. 2. Эффективно разрушать полисахаридные оболочки клеток растений, могут лишь жвачные. 3. Белки злаков бедны: лизином, триптофаном и метионином. 4. Фибриллярные белки животных плохо растворимы в воде и с трудом перевариваются, лишь после частичного гидро-лиза. Самый доступный из них – коллаген, составляет 10-20 % массы мяса. Он беден ароматическими, диамино- и серусодержащими аминокислотами.

4 Таким образом, 1. Круговорот азота в природе - важнейшее звено в биогеохимических циклах Земли. 2. Все пластические нужды биоты лимитируют соединения азота, форма усвоения которого зависит от положения клетки или таксона в пищевых цепях. 3. Основная форма потребления азота клетками-консументами – аминокислоты. 4. Витамины – вещества, чаще азотсодержа-щие, синтезируемые продуцентами и незаменимые в метаболизме консументов.

5 Макс Рубнер (1854 — 1932). Германский физиолог и гигиенист. Доказал применимость к биоте закона сохранения энергии. Создал представления о вариантах азотистого баланса у организмов и популяций. Установил нормы потребления азота для взрослых людей: 16-20 г N2/сут., что в пересчете на эмпирический коэффициент 6,25, дает 100-120 г пищевых белков. Т.к. 8-10 дней голодовки вызывают у людей отрицательный азотистый баланс с распадом 23,2 г белка или 530 мг азота/сутки на кг массы тела - назвал эту константу: коэффициентом износа.

6 Одинаковые нормы питания рядовых и офицеров в армиях Европы и США вводят с конца XVIII в. Чтобы еды хватало всем, сержанты и офицеры едят после солдат, а командир – последним. Сравните с нашей армией, где и сейчас разные нормы и порядок питания рядовых, офицеров и генералов. Из мемуаров гл. редактора «Красной звезды» генерала Д. И. Ортенберга. «Сорок второй». 1990. Зима 1941-1942 гг. Оборона Москвы. В 4-х армиях Калинин-ского фронта потери от дистрофии больше, чем от дей-ствий противника!!! Комиссия Маленкова нашла причину в таблице заменителей. Ссылаясь на эту справку, интенданты без лишних хлопот кормят людей яичным порошком, поступавшим из США по ленд-лизу. Но заметить признаки развития дистрофии неко-му, т.к. командующий фронтом, армиями и т.д., вместе с политработниками и чекистами питались совсем по другим нормам!

7 К сожалению, ученики М. Рубнера привели нормы белкового питания и санитарии в соответствие с расовой теорией нацизма, чем вызвали гибель миллионов военнопленных и жителей оккупированных территорий. За это Германия до сих пор и расплачивается. Понятно, что в обоих случаях, как Германия, так и СССР подтвердили правоту президента США Авраама Линкольна (1809-1865): «Нет плохих вещей. Бывают злоупотребления хорошими вещами»!

8 С позиций диетологии: 20 протеиногенных аминокислот обычно делят на 2 равных группы: заменимых и незаменимых. Отсюда понятия полноценных и неполноценных белковых продуктов, с предпочтением бобовых и производных молока. Переваривание белков пищи и всасывание аминокислот мы уже разбирали. Все это освоить самостоятельно, по учебникам биохимии и физиологии. Важно, что раннее отнятие от груди с переводом детей на растительную пищу, снижает интеллект, вплоть до маразма = слабоумия и вызывает дистрофию до кахексии = квашиоркор.

9 Схема обмена аминокислот в цитозоле

10 Обмен > 50 типов малых азотистых молекул сложен и разнообразен, но: О протеолизе говорили в лекциях по пищеварению. Кроме пептидгидролаз ЖКТ, упоминали их эволю- ционных предшественников – катепсины лизосом и фаголизосом, завершающих эндоцитоз и внутриклеточное пищеварение. Они очень активны в гранулоцитах. См. курсы цитологии и гистологии. 3. Наконец протеасомы, в которых с участием АТФ и убиквитина происходит гидролиз собственных, «изношенных» белков цитозоля:

11 Схема убиквитинзависимого протеолиза (по H.Lodisch et al.,2004)

12 Также, в разделе «Матричные биосинтезы» уже рассматривали: Транскрипцию, трансляцию и варианты фолдинга полипептидов. Даже обмен кетокислот обсуждали в лекции по метаболону ЦТК. Т.е. пока не затронули: 1. Обмен аминогрупп. 2. Использование NH3. 3. Обмен небелковых азотсодержащих веществ: медиаторов, нуклеотидов и гема. 6 способов дезаминирования = распада аминокислот: http://orgchem2.city.tomsk.net/n_met/ornitin.htm В учебниках биохимии Т.Т. Березова и Б.В. Коровкина для мединститутов. 3. В курсе микробиологии.

13 Принципиально важны для клеток эукариот: 1. Непрямое дезаминирование = пере- или трансаминирование, когда аминогруппа переносится с аминок-ты на кеток-ту, с образованием новых кето- и аминокислоты. 2. Прямое окислительное дезаминирова-ние, с выделением кетокислоты и NH3, дающим в водной среде NH4+.

14 Александр Евсеевич Браунштейн (1902-1986). Открыл и всю жизнь изучал химию и биологи-ческую роль переамини-рования аминокислот. Вместе с М.М. Шемяки-ным разработал общую теорию пиридоксалевых кофакторов и Е. Академик АМН (1945) и АН СССР (1964).

15 АКП аминотрансфераз Установили в ин-те биоорганической химии в Москве, под руковод-ством уже академика АН СССР Ю.А. Овчинникова. Для 70-х гг. прошлого века – работа мирового класса.

16 Аминотрансферазы: Имеют 2 активных центра с пиридоксалевыми кофакторами - производными пиридоксина = витамина В6. В одном из них кофактор находится в форме пиридоксальФ = ПАЛФ, а в другом – пиридоксаминФ = ПАМФ. Соответственно, первый реагирует с любой аминокислотой, амином или амидом. Параллельно, в другом АЦ ПАМФ взаимодействует с ПВК, ЩУК, но чаще всего с 2-кетоглу-таратом = α-КГ.

17 Например, (по http://orgchem2.city.tomsk. net/n_met/ornitin.htm).

18 Смысл переаминирования в том, что аминогруппы, собранные с полусотни разных веществ, концентрируют-ся в глутаминовой кислоте, как центре азотистого обмена. Соответственно, возникшие из бывших азотистых соединений кетокислоты, могут превращаться в углеводы и липиды, а потом – окисляться в ЦТК. Либо, при нужде, пере-аминируясь с Глу, кетокислоты снова превращаются в заменимые аминокислоты.

19 Схема биологической роли переаминирования:

20 Аминогруппы, собранные с десятков разных веществ, Концентрируются в глутаминовой кислоте, как центре азотистого обмена. Кетокислоты, возникшие из бывших амино- соединений могут превращаться в углеводы и липиды, а потом – окисляться в ЦТК. Либо, при нужде, переаминируясь с Глу, кетокислоты снова превращаются в заменимые аминокислоты. Глу, с помощью АТФ и Глн-синтазы превращается в Глн и обе аминок-ты могут включаться в белки. Избыток Глу, поступая в митозоль окисляется с образованием NH3 и дает НАДН2 в дыхательную цепь.

21 Окислительное дезаминирование глутамата = Глу Глу – единственная аминокислота, способная проникать через ВММ в митозоль и окисляться там с отщеплением аминогруппы в виде NH3.

22 Окислительное дезаминирование глутамата = Глу Глу – единственная аминокислота, способная проникать через ВММ в митозоль и окисляться там с отщеплением аминогруппы в виде NH3.

23 2-оксоглутарат: 1. Может окисляться в ЦТК, давая клетке до 10-15 % энергии. 2. Свободно проходит ВММ в направлении изнутри - наружу, вновь используясь в реакциях трансамини-рования в цитозоле. Т.е. он образует еще один челночный механизм, обеспечивающий транспорт аминогрупп.

24 Та же реакция возможна и в обратном направлении: Глутаматдегидрогеназа α-КГ Глу +NH4 Н2О НАДФН2 НАДФ Процесс восстановительного аминирова-ния кетокислот широко распространен в клетках-продуцентах. У животных - ограничен биосинтезом Глу.

25 Окислительное дезаминирование d-аминокислот, аминов и др. БАВ с NH2-группами, идет в пероксисо- мах, аналогично глюкозооксидазной реакции, с к оторой вы уже знакомы: R аминооксидаза R R CH-NH2 C=NH C=O COOH COOH COOH ФАД ФАДН2 Н2О NH4+ О2 Н2О2

26 Свойства аммиака = NH3 (по Ю.В. Карякин, И.И. Ангелов. Чистые химические вещества. М. «Химия», 1974). Малая молекула - 17 Да, tпл. -80 С, tкип. -36 С. Газ с сильным характерным запахом и хорошей растворимостью в воде, где находится в виде гидрата: NH3. Н2О. В природе образуется при разложении азотсодержащих органических в-в. Врачи XIX в. называли судорожным ядом. Вызывает раздражение слизистых, слезоте-чение, головокружение, удушье, боли в желудке от сокращения мышц.

27 NH4+ легко проходит биомембраны по градиенту концентрации. Нейтрализуя все множество кислот, от Фн до сахарофосфатов, ВЖК и кетокислот, блокирует ЦТК, а значит и работу ДЦ с окислительным фосфорилированием! Первыми на энергетический голод отвечают нейроны – мышечными судорогами.

28 Основной, но далеко не единствен-ный источник NH3 - Окислительное дезаминирование глутамата в митозоле. Также, окислительное дезаминирование d-аминокислот и аминов в пероксисомах и азотистых В нуклеотидов. Наконец, микробное дезаминирование в толстом кишечнике. Т.о. ежесуточно, на кг массы тела у людей возникает ~ 60 мг этого опасного вещества. Продуценты способны к синтезу всех нужных кетокислот, а затем используют NH3 для их восстановительного аминирования. Отмечая обратимость глутаматдегидрогеназной реакции, мы уже говорили, что она единственная, позволяющая консументам связывать аммиак, образуя Глу. Затем, в реакциях переаминирования, из Глу и кетокислот могут возникать другие заменимые аминокислоты.

29 У водных одноклеточных животных часть аммиака идет для биосинтеза Глу и других азотсодержащих веществ. Его избыток в виде солей аммония диффундирует в окружающую среду, позволяя регулировать рН. Риск лишь в том, что NH4+ привлекает хищников. Опасность отравления NH3 появилась у многокле-точных организмов и, многократно возросла при их выходе на сушу. Проблему решили, требующие затрат АТФ биосин-тезы электронейтральных: 1. Глн и 2. мочевины.

30 1. В цитозоле любой клетки: О О С-О- С-NH2 (CН2)2 глутаминсинтаза (CН2)2 СН АТФ АДФ NH3 Фн СН Н2N CООН Н2N CООН Глутаминовая Глутамин к-та

31 Электронейтральный глутамин, Как и другие аминокислоты используется в клетках для биосинтеза белка. Его избыток – диффундирует в плазму крови, откуда поступает в гепатоциты.

32 В цитозоле гепатоцита О О С-NH2 С-О- (CН2)2 1. глутаминаза (CН2)2 СН Н2О NH3 СН Н2N CООН Н2N CООН Глутамин Глутаминовая к-та Плазма крови Транспортная система Глу-Глн составляет 80 % пула аминокислот плазмы крови.

33 1.2. Карбамоилфосфатсинтетаза печени: NH3 СО2 2 АТФ 2 АДФ Фн Н2N-СО~Ф Аспартат Орнитин АКТаза ОКТаза Оротат Аргинин УТФ ЦТФ Мочевина В цитозоле В митозоле

34 Реакции орнитинового цикла Кребса освоить по учебнику самостоятельно, обратив внимание на: 1. Его индукцию у земноводных при метаморфозе. 2. Электронейтральная мочевина H2N-C-NH2, О как конечный метаболит почти идеальна, т.к. при массе 60 Да, содержит 28 Да N. Прекрасно раство-рима в воде и легко выводится из организма. Но развитие земноводных и птиц происходит в замк-нутой системе яйца. Поэтому вместо мочевины они синтезируют мочевую кислоту, откладывая это труднорастворимое в-во в амнионе. Сразу после вылупления птенцов, ее кристаллы можно найти в скорлупе.

35 2. Обмен мононуклеотидов детально изучен в 60-х гг. прошлого века. См.: учебники и Дж. Дэвидсон. Биохимия нуклеино-вых кислот. М. Мир. 1976. 412 с. Т.е., возвращаясь к карбамоилфосфату отметим: 1. АКТаза ведет к биосинтезу оротовой к-ты. 2. Оротат, реагируя с активированным продуктом пентозофосфатного пути окисления глюкозы: 5-фосфорибозил-1-ФФ, образует УМФ. 3. Перефосфорилирование УМФ с АТФ дает УТФ, из которого возникают все пиримидиновые нуклео-тиды: ЦТФ, дЦТФ и дТТФ. 4. Конечные продукты биосинтеза пиримидиновых нуклеотидов - аллостерические ингибиторы АКТазы, обеспечивающие автоматизм процесса.

36 Схема активации рибозо-5-Ф для темновой фазы фотосинтеза и синтеза мононуклеотидов АТФ Киназа АМФ

37 Схема биосинтеза нуклеотидов Оротат Глицин и др. амино- Н4Р2О7 кислоты УТФ УМФ ИМФ Пиримидиновый ряд Пуриновый ряд

38 Уридиловый и адениловый нуклеотиды.

39 3. Декарбоксилирование аминокислот в α-положении Ведет к образованию аминов. Принципиально отлично от декарбоксилаз кетокислот зависимостью не от ТДФ, а от ПЛФ. R ПЛФдекарбоксилаза R CH CH2 H2N COOH CO2 NH2 Важно сознавать что амины биоактивны, т.е. действуют в концентрациях 10-7 – 10-11моль

40 Соответственно: Из Гис возникает гистамин. Из Три – триптамин, а после окисления – 5-гидрокситриптамин = серотонин. Из Тир – тироидные гормоны в щитовидной железе и катехоламины = КА в нейронах и надпочечниках. Из Глу –ГАМК. По массе – процессы ничтожны, но важны для управления межклеточными отношениями, т.к. выполняют функции гормонов и/или медиаторов = трансмиттеров.

41 Инактивация биогенных аминов в пероксисомах клеток-мишеней однотипна: ФАД-моноаминооксидаза R-СН2-NH2 R-C-H О2 Н2О NH3 Н2О2 О Специфичные альдегидДГ R-СООН

42 4. Обмен гема. Гем - простетическая группа всех гемопротеидов: Цитохромов - для транспорта электронов. Леггемоглобина и каталазы пероксисом. Мио- а затем и гемоглобина Так стабилен и распростра-нен в биосфере, что находят в следах преступлений и ископаемых: торф, сланцы, нефть, бурый уголь.

43 Эволюция гемопротеидов (по H.Lodisch et al., 2004)

44 Биосинтез гема (путь Shömin) происходит в митозоле в 3 этапа: 1 2 Сукцинил~SКоА Порфобилиноген х 4 2 Глицин 3 2 Гем Уропорфирин

45 Начало 1-го этапа биосинтеза: СН2-СООН COOH СН2-СО~SKoA CH2 Сукцинил~SКоА CH2 C=O CH2-COOH CH2 NH2 HSKoA CO2 NH2 Глицин ∆-аминолеву- линовая к-та = = ДАЛК

46 Затем 2 молекулы ДАЛК

47 2 этап биосинтеза гема: 4 молекулы порфобилиногена, теряя 4 NH2, через метиленовые мостики замыкаются в макроцикл - уропорфирин = тетрапиррол с соответствующими R.

48 Уропорфирин Номенклатура колец и внешних атомов С - в учебниках. Обратить внимание на: 1. все атомы азота – внутри макроцикла. 2. Сопряженная система Δ = двойных связей. 3. Позиции R в макро-цикле.

49 Т.о., 3-й этап биосинтеза гема: Сводится к: Преобразованиям R. Включению атома железа в плоскость макроцикла. Соединению гема с полипептидом, придающим соответствующий редокс-потенциал.

50 Соответственно времени полужизни = τ1/2 любого гемопротеида, В макрофагах проходит 1-я фаза распада гема: МОГ-окисление СН2-мостика между А и В пирролами гема. Но и после удаления из гема СО, тетрапиррол остается свернутым, т.к. его фиксируют атом Fe и полипептид. Лишь после связывания Fe с ферритином и протеолиза апобелка до аминокислот, возникает ярко желтый линейный тетрапиррол - билирубин.

51 Билирубин

52 Билирубин – довольно крупная > 500 Да и гидрофобная молекула. Предупреждая возмож-ность дезорганизации биомембран, ее связы-вает СА и транспортиру-ет из плазмы крови в гепатоциты. Здесь трансферазы проводят 2-ю фазу биотрансформации - конъюгацию с активными формами: серной, уксусной, глюкуроновой к-ты (70 %) или GSH.

53 Билирубин-диглюкуронид

54 Конъюгация резко повышает растворимость билирубина в воде, снижая его токсичность и облегчая выведение с желчью, которую вы уже видели. Аналогична и схема биотрансформации ксенобиотиков, например лекарств, пестицидов и других поллютанов окружающей среды: 1. МОГ-окисление SH SOH 2. Трансферазы Полярные конъюгаты