遺伝子の解析 第 2弾 DNAシークエンス法
DNAシークエンス （ABI PRISM３１０を用いて遺伝子の配列を読む） 原理 オートシークエンサー（ABI PRISM３１０）の反応では合成 ３１０） されるDNAを蛍光物質で標識します。 その標識されたDNAを電気泳動し、泳動中にレーザー光を当て励起光を 自動で検出し、コンピューターで解析します。 ABI PRISM３１０について ABI PRISM３１０でのシークエンス反応はサイクルシークエンス法とよ での ばれる方法で行っています。まず、PCR反応でA, G, C, Tそれぞれに、励 起する波長が異なる４種類の蛍光色素をｄｄNTPにつける方法（Dye Terminator法）を用い、その標識されたDNAフラグメントを内径５０μｍ のキャピラリー管のなかで電気泳動を行いA, G, C, Tそれぞれの蛍光を CCDカメラで検出し、塩基配列を読むことができます。
～DNAシークエンスの流れ～ PCRにて目的のDNA量を増やす。（同時に蛍光標識も行 う） エタノール沈殿にて目的DNAの分離・精製 オートシークエンサーにて目的DNAの塩基配列の読み 取り
デオキシヌクレオチド（ｄNTP）と ジデオキシヌクレオチド（ｄｄNTP） 塩 基 Ｐ OH デオキシヌクレオチド（d. NTP） 塩 基 Ｐ H ジデオキシヌクレオチド（dd. NTP） d. NTPとdd. NTPはPCR法でそれぞれDNAの構成単位として利用されま す。違いは３´の位置の水酸基が水素基になっていることです。Nには A, T, G, Cの 4種類の塩基が当てはまります。
d. NTPとdd. NTPの伸長反応の違い Ｐ OH Ｐ Ｐ Ｐ ５´末端 A T T Ｃ T ３´末端 A Ｇ Ｇ A d. ATPが 反応した場合 ３´末端 Ｇ A A T Ｃ T T Ｇ 続く ３´末端 Ｐ Ｐ Ｐ H Ｐ Ｐ Ｐ Ｐ ５´末端 A 反応した場合 A A T dd. ATPが Ｇ Ｃ T T Ｇ ３´末端 Ｐ Ｐ 伸長反応はStop
d. NTPとdd. NTPが一緒にあるときに PCR反応をすると・・・・ d. NTPをA, T, G, Cとし、dd. NTPをA*, T*, G*, C*とする ５´ ３´ ACGTACG TGCATGC ３´ ５´ PCR反応 ACG* TGCATGC ５´ ５´ ３´ ACGTACG* TGCATGC ５´ ５´ ３´ テンプレートDNA A* TGCATGC ACGT* TGCATGC ５´ A*, T*, G*, C*が取り込まれると、そこで伸長反応が停止するので いろいろな長さ（分子量）のDNA断片が作られる
Dye Terminator法 蛍光色素 塩 基 Ｐ H A P H T P H dd. NTPの４種類の塩基（ A, T, G, C）それぞれに異なっ た蛍光色素を標識することで 4種類のdd. NTPを見分けるこ とができる。 G P H C P H
蛍光色素で標識することで・・・・・ ５´ ３´ ACA* TGTATGC ５´ ５´ ３´ ACT* TGAATGC ５´ ほぼ同じ長さ（分子量）だが これら４種類のDNAを ５´ ３´ ACG* TGCATGC ５´ ５´ ３´ ACC* TGGATGC ５´ 区別することができる
ゲル電気泳動の分子ふるい効果 DNAは負電荷を持つ高分子なので全て＋極へ進みます。DNAの分 子量が小さいほど（短いほど）ゲルマトリックスとのふるわれ方が少な く、進みやすくなります。このように一定時間泳動すると分子量の差に よってDNAが分離されることを分子ふるい効果といいます。 ゲルマトリックス 高分子DNA 低分子DNA ＋ －
Ex)塩基配列を知りたい（水色部分が知りたい部分）DNA ACGTACG TGCATGC ５´ ３´ ３´ ５´ Dye Terminator法を利 用してPCRをすると 出来上がったDNA断片 プライマー ５´ ３´ ACGT* TGCATGC ACGTA* TGCATGC ５´ ３´ ACGTAC* TGCATGC ５´ ３´ ５´ ５´ AC* TGCATGC ５´ ３´ ５´ ACGTACG* TGCATGC A* TGCATGC ５´ ３´ ５´ ５´ ５´ ACG* TGCATGC ５´
PCRで作られたDNA断片をポリマーを充填した（ゲルと同 様）キャピラリー管の中で電気泳動をすると ５´ ACGTACG* ５´ ACGTAC* ５´ ACGTA* ５´ ５´ ACGT* ACG* AC* A* － 分子ふるい効果 により短い断片 が早く＋極側へ 移動する ＋
蛍光のついた塩基を早く＋極側についた順に並べると ACGTACG ５´ ３´ ACGTACG TGCATGC ５´ よって知りたかった塩基配列はACGTACGとなる 参考文献 改訂遺伝子 学実験ノート 羊土社 バイオ実験超基本Q&A 羊土社
実際のシークエンス結果（一部抜粋）
Скачать презентацию 遺伝子の解析 第 2弾 DNAシークエンス法 DNAシークエンス ABI PRISM３１０を用いて遺伝子の配列を読む 原理 オートシークエンサー ABI PRISM３１０ の反応では合成
d45a8bd8111f67fda1936bc450730eb7.ppt