结核病实验室质量保证及快速诊断进展国家结核病参比实验室赵雁林内容 1 结核病实验室作在结核病控制中的作用

结核病实验室质量保证及快速诊断进展国家结核病参比实验室赵雁林

内容 1. 结核病实验室作在结核病控制中的作用 2. 为什么要进行EQA 3. EQA 培训的重要意义 4. 结核病实验室相关的流行病学理论 5. 痰涂片镜检的操作原理 6. 全球结核病快速诊断进展

结核病实验室作在结核病控制中的作用 • • 诊断（发现传染源）治疗（确定治疗方案）疗效评价结核病控制策略和措施的评估

Diagnosis of Pulmonary TB Related to Numbers of Tubercle Bacilli 10 102 103 104 105 106 Poor microscopy (25%) X-ray/clinical only (20%) Culture / PCR (25%) Good microscopy (55%) ← AFB per ml of sputum Slide Courtesy: Van Deun A, Nov 2003

细菌 – 让人们联想到什么? • • • 疾病传染性流行性食物腐败在目前已知的细菌中有1%的细菌可以导致人患病在目前已知的细菌中有4%的细菌可以导致植物得病 95%已知细菌不具有致病性

为什么要进行EQA • • • 增加人员的责任心推行标准化、规范化操作确保实验室服务质量的提高生物安全的需要加强实验室网络、采集信息

痰涂片镜检EQA 培训的意义 • • 强化EQA的理解，有利于积极推广提高实验室服务质量提高对结核病实验室作的重视逐步提高结核病防治人员特别是结核病实验室作人员的地位

结核病实验室相关的流行病学理论 • • 结核病的发病学和流行冰山理论水库理论病因分析和疗效评价

生命的5 个基本特征 • • • 1. 细胞 2. 通过从环境中摄取化合物和能量维持其结构 3. 对外部刺激的反应性 4. 复制、繁衍并传递给其子代遗传信息 5. 进化适应环境

结核分枝杆菌在人体中的生活周期感染 – 95% 感染病变早期进展 - 5% 例如： HIV, 婴幼儿后期表现 - 5% 例如：移民

结核分枝杆菌的生活周期感染人体内生存进入细胞内侵犯人体免疫防御系统改变细胞壁由肺中排入空气中免疫激活和营养限制免疫病理改变营养需要释放抗原性蛋白释放调控因子, 例如 sigma factors

微生物和人类 Very few microbes are always pathogenic Many microbes are potentially pathogenic Most microbes are never pathogenic

我们如何知道特定的病原微生物致病? 诊断和有效的治疗不仅依靠分离病原微生物，而且在于建立实验室和病人临床症状的联系 Recognised syndromes e. g. septicaemia, endocarditis, osteomyelitis meningitis, UTI, pneumonia pharyngitis potential pathogen isolated from or detected in clinical samples patient's clinical condition

如何推测特定病原体可以致病? • Koch‘s 推测 – – 病原体必须在每一例病例中都出现病原体可以从宿主中分离并且可以在纯培养基中生长当特定的病原体接种到健康机体时特定的疾病会发生病原微生物可以在实验动物中恢复

传染性疾病的冰山理论 poliomyelitis in a child 0. 1 -1% of infections are clinically apparent classical clinical disease less severe disease rubella 50% of infections are clinically apparent asymptomatic infection Spectrum of virulence rabies 100% of infections are clinically apparent

水库理论发病人数死亡人数现有病人数治愈人数

痰涂片镜检的操作原理

分枝杆菌的发现历史 • 1590 年荷兰杨森父子发明了显微镜 • 19世纪末, 显微镜技术、染色技术已应用于微生物检测, 分枝杆菌的发现条件已成熟 • 在发现结核菌前, 科霍已是一位在微生物学方面取得丰硕成果的学者.

Robert Koch – 第一个证明细菌可以致病 • 1876 • 传染病的微生物病因学 – 病因学 - 疾病的病因 • 建立 “科学规则” 来确定微生物和疾病的病因和效应关系 • Koch’s 原理

Koch确定了3个重要疾病的病因 • 1. 霍乱 (fecal-oral disease) – Vibrio cholerae • 2. 结核病 (pulmonary infection) – Mycobacterium tuberculosis • 3. 炭疽(sheep and cattle) – Bacillus anthracis

结核病 • 结核分枝杆菌：棒状抗酸菌. 可以在人与人之间传播 • 牛型结核杆菌: 美国的病例数〈１％, 不在人与人之间传播 • 鸟胞内分枝杆菌，可以感染 AIDS晚期患者 Figure 24. 9

分辨率和对比度 • 人的肉眼不能看清小于0. 1毫米的物体 • 普通光学显微镜不能区别小于0. 2微米的物体 • 电子显微镜不能看清小于0. 1纳米的物体

光学显微镜的基本原理 • 为区分物体不同的两点, 这两点的光学成像必须落在视网膜上不同的感光细胞上; • 显微镜下, 光线经过显微镜物镜折射成倒立放大的实像, 然后经目镜折射成正立放大的虚像; • 经显微镜放大后, 人眼就可以区分物体不同的两点, 以达到观察微小物体的目的; • 由于光线衍射的原因, 普通光学显微镜不能区别小于0. 2微米的物体；

电子显微镜下的结核分枝杆菌 Gram-positive S. aureus Gram-negative E. coli Acid fast M. tuberculosis

生理条件下细菌的表面往往带有大量负电荷 • 原因：细菌表面带有正负电荷的基团，等电点多在PH ７以下，因此在中性或碱性条件下细菌的表面往往带有大量负电荷

染色反应 • Stains - salts composed of a positive and negative ion, one of which is colored (chromophore) • 碱性染料 – 着色基团带正电荷 – dye+ Cl- • 酸性染料 – 着色基团带正电荷 – Na+ dye-

分枝杆菌涂片镜检基本原理１、待检标本中存在分枝杆菌，即受检者排菌２、分枝杆菌的特殊结构决定了染色方法：　　　染色剂细菌表面带负电荷, 与碱性复红易于结合, 　　　　加热加深分枝杆菌着色程度　　　　脱色为了易于镜检，应该使抗酸菌以外的所有物质近乎完全脱色　　　　复染提供一个良好的对比，隐去背景中残留的红色，但不掩盖抗酸菌。而且，复染既要使涂片的背景易于镜检时调焦，同时又不能太深以至分散太多注意力

结核菌感染及排出示意图

结核病

细胞壁革兰氏阳性菌脂质双分子革兰氏阴性菌 porins acyl lipids LAM 肽聚糖 lipid + LPS 分枝杆菌 MYCOLATE 　arabinogalacta

细胞膜 • 两种主要结构成分 – 双层磷脂　double layer of phospholipids – 蛋白质　　proteins

Cell Membrane

1. 痰涂片操作程序原理 2. 二甲苯问题

产生错误结果的常见原因假阴性技术错误涂片: 假阳性太薄/太厚、暴露在紫外线下 / 加热时间过长染色质量不佳、未热染、染色时间太短、脱落、涂片未固定脱色不佳过染标本中的混杂物质 / 使用污染的木签结晶/环境抗酸菌、交叉污染脱色不佳染色不佳镜检员视力缺陷、仅观察少数视野、经镜油交叉污染读片错误：未经培训记录/报告：记录错误染色: 脱色: 复染:

细菌感染的诊断病人 Non-microbiological investigations 临床诊断影像学血液生化标本分泌物标本

实验室检查是临床诊断的必要环节

OUTLINE • 细菌学诊断显微镜检查术培养 • 免疫学诊断 • 分子生物学诊断 Gen Probe 噬菌体检测方法 HPLC 其他

结核分枝杆菌的细菌学诊断显微镜检查 unstained or stained with e. g. Gram stain 染色脱色复染 identification by biochemical or serological tests on pure growth from single colony 培养 on plates or in broth 药敏 by disc diffusion methods, breakpoints or MICs 血清学 DNA 方法

显微镜检查 • Gram-染色 • 抗酸染色 – Ziehl-Neelsen • 荧光染色 – Direct, e. g. auramine – Immunofluorescence

培养 • Solid media – Agar plates • For Identification • For Enumeration – Slopes – For safe long-term culture, e. g. Lowenstein. Jensen media for TB • Liquid media (broth) – For enrichment or maximum sensitivity

菌种鉴定 • • • 形态学生长条件生化反应酶抗原分子生物学方法

非培养的诊断方法 • 血清学检测 • 分子生物学方法 • 其他（HPLC）

讨论的议题 • 什么是分子生物学诊断方法 ? • 为什么用分子生物学诊断方法 ? • 可得的分子生物学方法? 2018/3/16 45

分子生物学方法是传统方法的必要补充 • 显微镜检查有假阳性 - T. vaginalis, N. gonorrhoeae • 胞内致病菌 – viruses, M. genitalium • 低敏感性 – Chlamydia sp. , Neisseria sp. • 慢速生长 – M. tuberculosis

分子生物学方法 – 如何发挥作用? • 每个微生物拥有一些种属特异的DNA序列 • 分子生物学方法使得种属特异性DNA可以衡量法医鉴定

分子生物学方法是一系列DNA初级结构的方法 • 杂交的互补序列方法 -A-A-T-T-C-G-A-T-G- T-T-A-A-G-C-T-A-C- • 扩增合成种属特异的DNA序列 -A-A-T-T-C-G-C-G-A-T-G-A-A-T-T-C-G-C-G-A-T-G-A-A-T-T-C-G-A-T-G-

PCR 实验室 QC & QA 标本处理质量控制和质量保证 DNA 准备 No alternative 混合点洁净屋储存溶液热循环和扩增检测 R & D Alternatives: - commercial kits - robots + kits

Bactec呼吸测定 ①Bactec放射呼吸测定以含有放射标记的软脂酸为底物的液体培养基，自动测量分枝杆菌代谢 14 C软脂酸脱致过程中释放的14 CO 2的量。该法药敏报告可缩短为 4一12天。 ②分枝杆菌生长指示管法 Bactec放射呼吸测定法的替代方法。以培养基中加入荧光钌复合物代替放射性标记，其荧光衰减与细菌代谢过程中O 2的消耗量有关。荧光衰减可通过一系列不同的紫外透照管检测。

流式细胞仪测定法原理: 分枝杆菌细胞内的非特异性脂酶能水解培养基中加入的荧光素复合物(FDA)为游离的荧光素，因而分枝杆菌在生长过程中可造成荧光素的堆积，经FCM即可检测到。

比色法 ①MTT法为线粒体琥珀酸脱氢酶的作用底物，可被活细胞还原形成不溶性的Formazan产物, 其生成量与活细胞数量成正相关。Formazan经溶解后，可在酶标仪上测定其光吸收值。 ②微孔板美兰比色法美兰为耗氧指示剂，有氧时为蓝色，无氧时为粉红色。Franzblau等以美兰为指示剂在 96孔微量板中培养细菌，培养基中加入抗结核药物，微量板用Parafilm封口膜封闭。若细菌为药物敏感株，可被加入的抗结核药物抑制或杀死，首先表现为氧消耗停止。而耗氧指示剂在各独立微小隔氧环境中的颇色变化可客观反映氧被消耗的程度，从而反映细菌的生长状态。

噬菌体法（Fast flaque) • 噬菌体生物扩增法将分枝杆菌噬菌体感染结核分枝杆菌，未进入菌体内的噬菌体用特异的杭噬菌体物质灭活，进入菌体内的噬菌体得到保护而复制增殖，溶菌后释放子代噬菌体，将此噬菌体与快速生长的耻垢分枝杆菌混合，接种在固体培养基上培养，观察蚀斑的产生。蚀斑的数量与噬菌体数量有关，也与在含抗结核药物培养基上存活的结核分枝杆菌数有关。

• 噬菌体荧光素酶检测法 Jacobs等将荧火虫荧光素酶基因导入分枝杆菌噬菌体，这种噬菌体感染分枝杆菌后，荧光素酶基因被代谢活跃的分枝杆菌活化，在菌细胞内ATP存在的条件下，可产生光子，通过荧光检测器测定发光信号。只有耐药的分枝杆菌才能在含药的培养墓上生长，产生光子，敏感菌和死亡菌不产生或产生后不能维持。

噬菌体生物扩增法原理示意图

Gen Probe 方法检测结核分枝杆菌 1. 原理 2. 菌种鉴定

• RNA/RNA错配法 Nash等(1997)首先将该法用于RFP耐药菌株培养物的检测。该法是基于双链RNA能抵杭RNA酶的消化的原理而建立的。将待检菌株以及药物敏感的参考菌株(H 37 Rv)的PCR产物混合，加入T 7 RNA多聚酶和 SP 6 RNA多聚酶，通过转录形成两条RNA，在进行杂交，若待检测株为敏感株，则形成两条互补的RNA，能抵抗 RNA酶的消化，若待检测菌株有突变发生，则不能与参考株RNA链完全配对，加入RNA酶后，杂交产物将在突变位点被切开，通过电泳即可检测到。

分枝菌酸(HPLC) Alpha Methoxy Keto Pasteur Phipps Connaught Frappier Tice Glaxo Prague Danish Birkhaug Sweden Tokyo Brazil Russia 300 bp 200 bp 100 bp Behr et al. J Bacteriol, 2000

DNA 测序法 • Hirano等应用DNA测序法被认为是检测变异的“金标准”，可检测出待检基因上的所有突变位置和突变情况。利用PCR法扩增待检基因，PCR产物可直接测序，24一48 h即可提供精确序列，并准确判定碱基突变的位点，已用于RFP、 INH、PZA、EMB等耐药基因的检测。

基因芯片将耐药基因的DNA或寡核苷酸序列标记到芯片上，从而快速的检测出突变位点，可以在 3个小时内完成。

基因组学的问题 • 多样性单核苷酸多态性, 复制子, 缺失, 重排 – 株水平差异和种属特异性 • 基因的作用是什么? – 基因的功能通常是未知的 – 主要是根据同类中的功能来推论 • 翻译成效应分子 – 信息如何引导诊断、预防、治疗疾病

M. tuberculosis H 37 Rv • 440万碱基对 • 3924 预测基因 • 65. 6 % GC 含量 Cole ST et al. Nature 1998; 393: 537.

斑点杂交和反相斑点杂交标记探针 DNA / RNA 标本斑点杂交标记DNA / RNA 标本探针反相斑点杂交

制作DNA芯片 ‘printer’ 玻片 96 -孔板 18 mm

DNA在玻片上的点样

DNA 微阵列 - M. tuberculosis H 37 Rv的基因组芯片 • 3924 开放阅读框 • 一个基因一个探针

DNA微阵列 DNA /RNA Cy 3 DNA /RNA Cy 5 DNA 微阵列扫描

c. DNA 微阵列 Cy 3 荧光信号强 Cy 5 荧光信号强 Cy 3 和 Cy 5 荧光强度相等

M. tuberculosis vs. BCG-Danish 1331 H 37 Rv Rv 1974 Rv 1976 Rv 1978 BCG Both strains Rv 562 Rv 2875 Rv 780 Behr MA et al. Science 1999; 284: 1520.

Affymetrix 基因芯片

单核苷酸多态性基因分型 Genomic Sequence. . . G C C A T TTGAACA T T G T C A. . . C ‘A’ Allele Hybridization A T T GAACA C G T Individual 1 A C G T Individual 2 T T GCACA ‘C’ Allele Hybridization Individual 3 Sample Hybridization A/A homozygote A/C homozygote C/C homozygote

谢谢大家 Zhaoyanlin@tb 123. org Readpaper@hotmail. com 010 -80507653 - 678

结核病实验室质量保证及快速诊断进展 国家结核病参比实验室 赵雁林 内容 1 结核病实验室 作在结核病控制中的作用

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