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第九章 载 体 第九章 载体
第三节 酵母质粒 http: //etc. lyac. edu. cn/courseware/03_04 jiyingo ngcheng/web/chap 03_5. htm 第九章 载体
一、酵母2μ质粒的生物学特性 § 1. 概述 § 大多数酵母菌株含有一种称之为 2μ的质粒 § 基本结构： ①它们是封闭环状的双链DNA分子，周长约 2μ(6 kb左右)，以 高拷贝数存在于酵母细胞中，每个单倍体基因组含 60 -100个拷 贝，约占酵母细胞总DNA的30％； ②各含约 600 bp长的一对反向重复序列； ③由于反向重复序列之间的相互重组，使 2μ质粒在细胞内以 两种异构体(A和B)形式存在； ④该质粒只携带与复制和重组有关的4个蛋白质基因(REP 1、 REP 2、REP 3和FLP)，不赋予宿主任何遗传表型，属隐蔽性质粒。 第九章 载体 3
图 3 -7 酵母2μ质粒的结构和限制性图谱 § A和B是两种构型的2μ质粒， 图谱的环状部分代表单一 顺序，直线部分代表反向 重复序列（IR），粗线条 表示复制原点，REP 1、 REP 2和REP 3分别代表复制 酶基因和顺式作用位点， FLP表示重组酶基因，图谱 上标明了根据这个质粒的 全核苷酸顺序确定的一套 限制性位点的位置。（引 自 J. R. Broach, 1983） 第九章 载体 4
§ 2μDNA结构上最显著的特 点是存在两个反向重复序 列(inverted repeat， IR)，它们被一个较大的 单一顺序区(约 2. 7 kb)和 一个较小的单一顺序区( 约 2. 3 kb)隔开。在酵母细 胞中，由于这个反向重复 序列之间的相互重组，使 2μ质粒群成为两种构型 (A和B)的混合物，它们之 间的差别仅表现在两个单 一顺序区的相对方向不同。 第九章 载体 5
这类质粒至少在细胞周期的某一时期是位于酵母核内 § 2μDNA和染色体DNA一样与组蛋白一起装配成核 小体结构； § 2μDNA的复制只发生在细胞周期的s期，并且每 个分子在一个细胞周期中一般只复制一次； § 它和核DNA的复制都受到同样一些核基因的控制 等。 § 尽管 2μ质粒位于核质中，但游离的2μDNA从不 整合到染色体中去。 第九章 载体 6
2. 2μ质粒DNA的核苷酸顺序 § 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的 2μ质粒 § 全长 6318 bp，有61％是(A+T)，酵 母染色体DNA(64％) ，但线粒体 DNA (79％) 。 § 2μ质粒DNA含有两个反向重复序列 区域(IR 1和IR 2)，每个区域长 599 bp。 § 三个很长的空位译读码（open reading frame, ORF），其中两个 (REP 2和FLP)在较小的单一顺序区， 另一个(REP 1)在较大的单一顺序区。 第九章 载体 7
3． 2μ质粒的复制系统 § 2μ质粒DNA有一个高效的 复制原点，它已被定位在 这个质粒的一个约 350 bp 长的片段(A型质粒： 3650 －4000；B型质粒： 650 －1000)； § 其主要部分是IR 1的Xba I 切点一侧富合对称顺序的 区域，并且有约 100 bp长 的一段原点顺序从IR 1一 直延伸到邻近的单一顺序 区 第九章 载体 8
§ 质粒在酵母细胞内稳定地增殖和维持其高拷贝 数还需要由质粒本身编码的两个蛋白质REP 1和 REP 2，是反式作用位点。及单一顺序区中HpaⅠ 切点附近的顺式作用位点REP 3。 第九章 载体 9
4．FLP重组酶和2μ质粒的分子内重组 § 酵母2μ质粒DNA的反向重复序列(IR)很容易发 生重组。这种有效的重组是由 2μ质粒基因组自 身编码的一种FLP蛋白质催化的。 第九章 载体 10
§ 2μ质粒的重组是真核细胞内一类具有位置专一性的重 组。 § 基因FLP § “结合部位”：一对位于IR顺序中的能被FLP蛋白质识 别的，范围在反向重复序列的Xba. I切点两侧约 65 bp的 一个较小区域。 § 2μ质粒的FLP基因最近已被克隆在酵母和大肠杆菌的 表达型质粒载体中。可以直接制备FLP蛋白质。这种 FLP蛋白质可以有效地引起 2μ质粒DNA的重组，因此被 称为FLP重组酶。 第九章 载体 11
§ 结合部位芯子区：一旦核苷酸顺序发生突变(例 如XbaⅠ位点中的突变)，能剧烈损害底物DNA的 重组。 第九章 载体 12
二、酵母质粒DNA的制备和纯化 § 一般通过大肠杆菌来制备和纯化酵母质粒DNA。 § 1、先提取酵母菌中的质粒DNA ：取 1. 5 m. L对数生长晚 期的培养液，13, 000 r/min离心15 s, 悬浮于100 ul TE缓 冲液。加 200 ul裂解液(2%Triton X-100; 1%p SDS; 0. 1 mol/L Na. CI; 10 mmol Tris HCL p. H 8; 1 mmol EDTA), 200 ul苯酚/氯仿/异戊醇，300 mg石英砂(0. 5 一l mm )。振荡 2 min, 13, 000 r/min离心5 min。乙醇 沉淀，加TE缓冲液。 § 2、将上述提取获得的酵母质粒DNA转化大肠杆菌 § 3、从大肠杆菌中进行酵母质粒DNA的制备和纯化。 第九章 载体 13
三、酵母质粒载体 § 以大肠杆菌质粒为基本骨架 § 具有酵母的DNA复制起始区、选择标记、有丝分 裂稳定区和外源DNA插入位点 第九章 载体 14
§酵母质粒载体既可以在大肠 杆菌复制与扩增、又可以在 酵母系统中复制与扩增，故 此类载体又称为穿梭载体（ shuttle vector）。 第九章 载体 15
以p. BR 322为基础组建的，用于酵母基因 程的质粒 载体有4种： § ①整合质粒（yeast integration plasmid， YIp）：含有酵母的筛 选标记ura 3基因。但 缺乏酵母的复制起始 位点，所以，它只有 整合到酵母染色体中 才能稳定(图 3 -9 a)。 图 3 -9 四种酵母质粒载体 a: 整合质粒(YIp)； b: 复制质粒(YRp)； c: 附加体质粒(YEp)； d: 稳定质粒(YCp) 第九章 载体 16
§ ②附加体质粒（yeast episomal plasmid，YEp） ：在p. BR 322中插入酵母 筛选标记ura 3和2μ质粒 DNA片段(复制起始部位 和rep基因)。因此，这 图 3 -9 四种酵母质粒载体 样的质粒以附加体形式 a: 整合质粒(YIp)； 在真核细胞中复制，YEp b: 复制质粒(YRp)； c: 附加体质粒(YEp)； 质粒拷贝数高且较稳定( d: 稳定质粒(YCp) 图 3 -9 b)。 第九章 载体 17
§ ③复制质粒（yeast replicating plasmid， YRp）：含有酵母的筛选标 记ura 3和DNA的自主复制序 列ARS（autonomous replication sequence）， 在真核细胞中独立自主的 复制，拷贝数高但不稳定( 图 3 -9 c)。 图 3 -9 四种酵母质粒载体 a: 整合质粒(YIp)； b: 复制质粒(YRp)； c: 附加体质粒(YEp)； d: 稳定质粒(YCp) 第九章 载体 18
§ ④稳定质粒 (yeast centromeric plasmid，YCp)：在复制质粒中再 插入酵母着丝粒(centromer)的一 个DNA片段(CEN)，此序列能保证 染色体的连接物(attachment)连 到有丝分裂的纺锤丝(spindle fibers)上，帮助染色体能等量地 分配到子代细胞中。所以，含有 CEN序列的质粒也将以同样的机制 稳定地维持在细胞中，并保证了 稳定质粒在子代细胞中的等量分 布(图 3 -9 d)。 图 3 -9 四种酵母质粒载体 a: 整合质粒(YIp)； b: 复制质粒(YRp)； c: 附加体质粒(YEp)； d: 稳定质粒(YCp) 第九章 载体 19
根据复制机制，可将上述酵母质粒载体分为两个基 本类型即整合载体和自我复制载体。 整合型酵母载体 § 整合型酵母载体包含一个酵母URA 3标志基因和大肠杆 菌的复制和报告基因。 § 整合载体YIp（yeast integrating plasmid）是通过 质粒DNA与酵母基因组DNA之间发生同源重组而整合到 基因组DNA上的，故遗传稳定性好但转化效率低。 第九章 载体 20
主要是细菌质粒含有一个酵母 基因。如YIp 5，是在p. BR 322 的基础上插入了一个URA 3基 因，这个基因编码乳清酸核 苷-5’-磷酸脱羧酶，是嘧啶 合成中的一个酶，可以作为 选择标记，选择的方法与 LEU 2标记相同，YIp不能像质 粒一样复制，其复制依赖于 整合到酵母的染色体上，整 合的机制与YEp相同。 § 图 3 -34 整合型载体 第九章 载体 21
自我复制型酵母载体 § 自我复制型酵母载体因在酵母中有自我复制的 能力而得名。 § 属于这类载体的有YRp，YEp和YCp。 第九章 载体 22
自我复制型酵母载体-YEp系列 § YEp系列含有2μ质粒的复制 起始部位和rep基因片段，和 选择基因LEU 2。 § 该质粒可在酵母中产生特异 的重组酶，使YEp很快与酵母 内源质粒重组。重组一旦发 生，YEp载体则很快复制并扩 增。因此YEp质粒拷贝数多并 且较稳定。 § YEp 13是一个穿梭质粒， 包 含p. BR 322的完整序列，因此 可以在大肠杆菌也可以在酵 母中进行选择。 § 3 -32 YEp的结构 第九章 载体 23
自我复制型酵母载体-YEp系列 § YEp可以插入酵母的染色体 DNA，附加体意味着YEp可以 独立的复制也可以整合到酵 母的染色体内。 § 因为在载体中作为选择标记 的基因与突变体主染色体DNA 同源性很高，比如YEp 13质粒 中LEU 2基因可以与染色体上 突变的LEU 2基因进行重组， 将整个质粒插入到酵母染色 体内，可以一直保持整合状 态，随后的重组事件也可以 切下来 § 图 3 -33 YEp整合到酵母染色 体上 第九章 载体 24
§ YRp系列含有一个ARS基因片 段，由于转化后缺乏有效地 分离，故在有丝分裂后质粒 在母体细胞分布极多而子代 细胞分布较少，在遗传学方 面极不稳定。 § YCp系列是在YRp质粒上连上 一个染色质着丝点（CEN）而 形成，表现特性为拷贝数少 而且具有遗传稳定性。 § 图 3 -35 复制型酵母载体 第九章 载体 25
转化受体方法 § 首先用酶学方法除去酵母的细胞壁游离出原生质球。 § 然后，在Ca. Cl 2和聚乙二醇存在下，重组DNA便很容易 地被细胞吸收 § 将转化后的原生质体悬浮在营养琼脂中并再生出新的 细胞壁。 § 目前多采用Li. Cl法将质粒DNA转化完整的酵母细胞，无 需除去酵母的细胞壁操作更加简便。 § 导入酵母细胞中的重组DNA有两种命运：整合到染色体 DNA中或在细胞中自主复制。 第九章 载体 26
§ 在一个特定的克隆实验中选用哪一种类型的质粒需要考虑三个因素。 第一转化频率，也就是每ug的质粒DNA可以获得转化子的数目。YEps 的转化频率最高，每ug. DNA可以获得 10000 -100000个转化细胞，YRps次之， 可以产生 1000 -10000个转化细胞，YIp产量较低，一般少于1000个，如果不 是用特殊的程序，只能产生 1 -10个重组子，较低的转化效率意味着与染色体 之间的重组是非常少的。 拷贝数：YEps和YRps含有的拷贝数也最多，每个细胞中含有20 -50和5 -100 个，而YIps一般只以单个拷贝存在于细胞中。如果要从克隆的基因中获得蛋 白，这些特性就非常重要，因为拷贝数越多，蛋白质的产量就越高。 稳定性：因为YIps能产生稳定的重组子。另一方面YRp重组子是非常不 稳定的，母细胞中聚集大量的重组分子，但在子代中就可能丢失，YEp也有 同样的问题。 第九章 载体 27
四、酵母人 染色体 § 酵母人 染色体(yeast artificial chromosome，YAC)是一类酵母穿梭载体。 § YAC具有自主复制序列、克隆位点以及可在细菌 和酵母菌中选择的标记基因。此外，YAC还具有 酵母菌染色体的一些特点。可以接受 1001000 kb的外源DNA片段。 第九章 载体 28
YAC载体--p. YAC 4 § 主要结构： ①两个可在酵母菌中利用的选择基因， URA 3和TRP 1(色氨酸合成基因)； ②酵母菌着丝粒序列 (centromere 4, CEN 4)； ③一个自主复制序列(ARS 1)； ④两个来自嗜热四膜虫 (Tetrahymenna thermophilp)的末端重复序列(TEL)， 以保持重组YAC为线状结构； ⑤在两个末端序列中间，有一段填充序 列(stuff, HIS 3)，以便p. YAC 4在细菌细 胞中稳定扩增； ⑥Amp抗性及细菌质粒复制原点； ⑦一个Eco. RⅠ克隆位点，该位点位于酵 母菌Sup 4 t. RNA基因内。 第九章 载体 29
选择标记--Sup 4 § Sup 4基因编码赭色抑制Trp-t. RNA，抑制赭色表型(成为白色)。 § 不含外源DNA片段的p. YAC 4载体转化酵母菌，转化子的菌落呈白色。 § 带有插入的外源DNA片段的p. YAC 4重组载体，其Sup 4已经失活， 结果转化酵母菌后所产生的转化子形成赭色菌落。 第九章 载体 30
酵母克隆载体的最后一种类型 是YAC，酵母人 染色体。染色 体的主要组成如下： 1) 着丝点 2) 两个端粒：存在于染色 体的末端，使染色体正确的结束 复制，防止染色体被外切酶撕咬 3) 复制起始位点： DNA复制的起点染色体结构 确定后，可以同过重组DNA技术 将每一组成部分分离开来，然后 连接在一起，创造人 染色体。 自然中酵母的染色体有几百个kb 长度，利用人 染色体可以携带 比其他质粒更大的DNA分子。 第九章 载体 31
五、表达载体 § 一般酵母表达载体都以大 肠杆菌质粒为基本骨架 再加上酵母的自主复制 序列，选择标记，外源 基因插入位点，启动子 和终止子。 § 既能在酵母菌中复制也能 在大肠杆菌中复制，所 谓酵母菌—大肠杆菌穿 梭载体。 第九章 载体 32
理想的酵母表达系统要考虑： § § ①启动子和终止子的选择； ②表达盒的稳定性； ③外源蛋白的累积部位； ④产量的提高。 第九章 载体 33
酿酒酵母作表达系统的优缺点： § 在理论上酵母生产外源蛋白的最佳表达盒包括有效的 启动子序列（可为诱导性或组成性），目的蛋白c. DNA 和转录终止序列。表达盒可以在含本身 2μ质粒复制功 能或其他自主复制序列的质粒中，也可将其插入酵母 基因组中。要在酵母中最大限度表达基因，需要特异 的启动子（乙醇脱氢酶同 酶-Ⅰ、磷酸甘油激酶、酸 性磷酸酶和α因子等基因的启动子）。由于酿酒酵母 不能识别和处理高等真核内含子，因而须使用c. DNA。 还应注意表达蛋白的性质，因为这将决定产物是在胞 内表达还是向外分泌。 第九章 载体 34
第四节 常用的真核病毒载体 第九章 载体
第一节： 病毒基因组 一、病毒基因组核酸的主要类型 DNA 分类 RNA 双链DNA：HBV 单链DNA：M 13噬菌体 双链RNA 单链负股RNA 单链正股RNA 正股(+)：序列与m. RNA相同的链 负股(-)：序列与m. RNA互补的链 第九章 载体 36
二、病毒基因组的特点 HBV： 3. 2 kb 痘病毒： 300 kb 1．基因组大小相差很大： 2．核酸结构多样性： DNA 或RNA 单链或双链 合环状分子或线性分子 3．基因组有连续的，有不连续的 大多数连续 流感病毒： 8条单链RNA 4．编码序列>90%(基因组) 第九章 载体 37
5. 多为单拷贝, 即每个基因只出现一次 6. . 基因有连续的和间断的 (有内含子) 7. 相关基因丛集: 功能上相关的基因排列在一起 8. 有重叠基因 9. 含有不规则结构基因 基因之间无间隔区. m. RNA５＇端无帽子结构. 结构基因本身无翻译起始序列 第九章 载体 38
三、典型病毒基因组介绍 1. SV 40病毒基因组 第九章 载体 39
双链环状DNA： 5243 bp 早期转录区：一个基因（2个蛋白质 t，T） 调控区（ 400 bp）：复制起始点，启动子，增强子 晚期转录区：先转录出一个多顺反子m. RNA VP 1 m. RNA VP 2 m. RNA VP 3 m. RNA 第九章 载体 AUG 位于VP 2和 VP 3内 VP 3比VP 2 N端少 1/3 40
内含子 1 UAA 前体m. RNA 内含子 2 剪接方式 1：去 除内含子 1 剪接方式 2： 去除内含子 2 UAA t -m. RNA T-m. RNA t-抗原 T- 抗原 分布于核内： 100 KD 分布于胞浆内： 18 KD T - 抗原和t-抗原m. RNA前体的不同剪接方式 第九章 载体 41
2、逆转录病毒(retroviruses) （1）一般特征 病毒(+)股RNA为 2个拷贝, 基本结构为: ５＇帽－R－U 5－PB－ －DLS－ －gag－pol－env－(onc－) － C－PB＋－U 3－R－poly(A)n 病毒颗粒中有两条相同的正股RNA+两条来自宿主细胞的t. RNA 第九章 载体 42
A：编码区: 所有逆转录病毒均含有3个基本结构基因 gag: 病毒衣壳蛋白 pol: 肽链内切酶, 一个逆转录酶, 一个与前病毒整 相关的酶 env: 包膜蛋白 合 B：非编码区: 与基因组复制和基因表达有关 A: B: C: R区: 两端的重复序列, 与c. DNA合成有关 引物结合区(primer binding site, PB) U区: U 3 含强启动子, 起始转录RNA. U 5 与转录终止和加poly. A有关 D: DLS- -C区: DLS: 两条病毒(+)RNA链结合位点 : 包装信号: RNA装入病毒颗粒 C: 调控区. 第九章 载体 43
（2）前病毒基因组的转录和翻译 A：逆转录病毒基因组的复制和转录都需要经过DNA中 间体才能完成. DNA前病毒 (c. DNA) RNA病毒 末端形成新的重复序列(U 3 -R-U 5) 称长末端重复序列(LTR) long terminal repeat B：翻译 多顺反子m. RNA gag----------pol(无起始密码子) 第九章 载体 44
90% 形成gag蛋白 10%形成gag- pol 蛋白 剪接后形成env m. RNA 第九章 载体 45
第二节 原核生物基因组 一、原核生物基因组结构的特点： 1、基因组为环状双链DNA分子 2、只有一个复制起始点. 3、具有操纵子结构 指数个功能上相关的基因串联在一起, 连同上游的 调控区和 下游的转录终止信号构成基因的表达单 位. 4、一般无重叠基因. 5、基因是连续的, 无内含子 6、编码区在基因组中的比例 第九章 载体 >> 真核基因组 << 病毒基因组 46
§ 病毒基因 程，就是指DNA重组技术在病毒学中 的应用。 取代型的重组病毒载体 § 重组病毒载体： 重组的病毒质粒载体 第九章 载体 47
动物病毒载体的组建有两种类型： § 第一是组建含有目的基因的感染性重组病毒， 随着病毒的繁殖，使目的基因有效表达。采用 这一系统时，除反转录病毒外，大多数感染性 病毒可以杀死细胞。 § 第二是建立一种能使病毒载体复制的游离基因， 其优点是，可以用来建立不产生感染性病毒颗 粒就可以不断表达外源性基因的细胞系，而且 还可以克服病毒颗粒包装容量的限制。 第九章 载体 48
动物病毒载体的用途有如下几方面： 1．研究真核基因表达调控原理； 2．高效表达真核基因，用于研制病毒疫苗或 生产多种活性多肽物质； 3．利用病毒基因组中的基因表达增强子； 4．人类遗传病的基因治疗。 第九章 载体 49
一、腺病毒载体 § 1、腺病毒概述 § 腺病毒的形态是特征性的 二十面体病毒壳体。 § 壳体含有三种主要的蛋白： 六邻体（II），五邻体基 底（III）和纤突（IV）， 还有多种其他的辅助蛋白 VI，VIII，IX，IIIa和 Iva 2 第九章 载体 50
腺病毒基因组 § 一个线性的双链DNA § 5’端与一种末端蛋白（TP）共价结合，5’端上还具 有末端反向重复序列（ITRs）。 § 病毒DNA与核心蛋白VII和一个称为mu的小肽紧密结合。 § 蛋白V包被在DNA-蛋白复合物上，并且通过蛋白VI为 DNA-蛋白复合物和病毒壳体间提供了结构上的联系 § 病毒含有一种病毒自身编码的蛋白酶，这种蛋白酶对 于加 某些结构蛋白从而产生成熟的具有感染性的病 毒是必需的。 第九章 载体 51
2、腺病毒载体的构建 § 在人腺病毒C亚群的Ad 2 和Ad 5 的基础上构建。 § E 1区为病毒复制必需区，缺失则成为复制缺陷 型载体。 § E 3区是病毒复制非必需区，可用于外源基因的 插入。 第九章 载体 52
腺病毒载体常见的构建方法如下： § 将启动子基因外源基因Poly. A盒插入到E 1缺失区，就构 建成穿梭质粒载体； § 再将E 3区缺失的腺病毒DNA末端连成环状，内有细菌质 粒的复制原片段，该环状腺病毒DNA可以在细菌内复制， 但不会被包装成病毒体。 § 载有外源目的基因的穿梭质粒与环状病毒质粒共转染 293细胞，通过同源重组可以产生一个E 1区域缺失的带 外源基因的腺病毒重组体。同源重组体产生包装蛋白， 通过反式互补即可产生复制缺陷的重组腺病毒。 第九章 载体 53
§ 第一代腺病毒载体，去除了El/E 3基因表达盒, 可以插入长达 615 kb的外源DNA。去除E 1区还阻 止了依赖E 1区和E 2区功能蛋白的转录与随后病 毒DNA的复制及病毒外壳蛋白的产生。E 1区缺失 的腺病毒在能够反式提供E 1区基因蛋白的细胞 中得到增殖。 第九章 载体 54
第二代腺病毒载体 § 在E 1、E 3缺失的基础上进一步去除了E 2区和(或) E 4区, 减弱病 毒蛋白的表达 § 这种载体已用于鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺乏症的I期临床实验。 § 第一代和第二代腺病毒载体的E 1区缺失增强了病毒DNA的复制、 晚期结构蛋白的合成和可复制腺病毒( Replication Competent Adenovirus, RCA)的产生, 在使用时会产生针对病毒包壳和转基 因表达产物的免疫反应, 基因表达受到抑制, 表现为感染组织的 炎症反应和外源基因表达消失; 在二次应用时, 强烈的免疫反应 会使外源基因的表达迅速消失。这使腺病毒的应用受到很大的 限制。 第九章 载体 55
第三代腺病毒载体: § 通过对无感染能力的腺病毒颗粒的观察, 发现无 感染能力腺病毒颗粒的基因组都含有腺病毒基 因组左端的一段序列即包装信号。因此设想保 留两端TR ( Terminal Repeats)及包装信号共 约 500 bp 的顺式作用元件, 去除腺病毒基因组中 全部编码序列(反式作用元件) , 其它功能由辅 助病毒提供, 这样的腺病毒载体就是第三代腺病 毒载体即所谓空壳载体。 第九章 载体 56
3 、腺病毒载体的优点 ①腺病毒粒子相对稳定, 病毒基因组重排频率低, 外源基因片段插 入片段在病毒复制几个周期后仍可保持不变, 易于用重组DNA技 术操作; ②安全性较好, 腺病毒无需整合进宿主细胞基因组中, 目的基因在 宿主细胞基因组外游离状态下表达, 整合突变致癌可能性小, 基 因毒性低; ③腺病毒基因组较大(36 kb) , 绝大多数基因组(约 35 kb)均能被 外源基因取代, 插入大片段外源性基因的潜力大; ④有较大的宿主范围, 可以感染肝细胞、血管内皮细胞等多种人体 细胞, 对于受体细胞是否处于分裂期要求不严格; ⑤腺病毒载体容易将外源基因直接转移到靶细胞中, 并有效表达成 活性蛋白。 第九章 载体 57
4、腺病毒载体应用于基因治疗 在美国近三分之一的基因治疗临床试验中采用腺病毒载体，而其 中 5型腺病毒的使用最为广泛。这些腺病毒载体现在正在被评估 作为载体对癌症、心血管疾病和遗传紊乱等病人进行基因治疗 的安全性和有效性。 根据美国国家卫生院的生物技术活动办公室统计，在过去的20年 里，已进行了将近 144例使用腺病毒载体的基因治疗临床试验， 在所有参与基因治疗临床试验的病人中，将近五分之一已引入 了腺病毒载体。 2004年 1月20日, 我国拥有自主知识产权的重组腺病毒p 53注射液（ 深圳赛百诺基因技术有限公司）----获得国家食品药品监督管 理局的生产文号，成为世界上第一个上市的基因治疗药物。 第九章 载体 58
§ 对人体非致病的腺病毒 2型（或 5型）使之带上 目的基因，将腺病毒输注入人体后，目的基因 在体内翻译成抗癌蛋白p 53，从而使机体获得抑 制细胞恶性生长的能力并杀死癌化细胞。 第九章 载体 59
腺相关病毒 (ａｄｅｎｏ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ, ＡＡＶ) ①人群感染率高(80%～ 90%), 但无致病性, 且免疫反应轻微; ②可定点整合, 并能以较稳定的形式存在; ③宿主范围广泛, 包括分裂期和非分裂期的多种细胞; ④携带的外源基因长期持续稳定表达, 并可调控; ⑤具有较好的热稳定性和抗酸碱性(ｐＨ 3 0～ 9 0)以及抗有机溶 剂处理的特点, 便于储存[8]。 § 近年来, ＡＡＶ已广泛用于肝脏、肺脏、脑、肌肉、视网膜及 血液系统等多种器官的遗传性疾病、心血管疾病和自身免疫性 疾病等的研究, 所用的动物模型包括小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、 猪、恒河猴、非洲绿猴及狒狒等。 § 目前在美国以ｒＡＡＶ 2作为载体采用基因治疗的两种疾病(血 友病Ｂ和囊性纤维化), 已进入早期的临床试验阶段。 第九章 载体 60
血友病Ｂ的治疗 § 血友病Ｂ是最适合用ＡＡＶ载体进行基因治疗的疾病 之一, ｒＡＡＶ载体介导凝血因子Ⅸ(ＦⅨ)在小鼠和狗 血友病Ｂ模型中得到了有效表达, 并取得明显的疗效。 § 方案: 采用剂量递增式肌肉注射ＡＡＶ 2/ｈＦⅨ: 受试 患者8例, 其中 1例患者接受最低剂量ＡＡＶ 2/ｈＦ Ⅸ(2× 1011ｐａｒｔｉｃｌｅｓ/ｋｇ)治疗后, 血液中 ＦⅨ水平达到 1%～ 2%, 在外源性ＦⅨ使用次数或剂量减 少的情况下, 患者临床出血症状减轻长达 40个月, 肌肉 免疫组化证实ＦⅨ在注射部位慢肌纤维中得到表达。 第九章 载体 61
囊性纤维化治疗 § 囊性纤维化(ｃｙｓｔｉｃｆｉｂｒｏｓｉｓ, ＣＦ)是由于囊性纤维化跨膜转导调节蛋白(Ｃ ＦＴＲ)基因突变造成的。 § 动物实验表明, 携带野生型ＣＦＴＲ基因的ｒＡ ＡＶ能有效转染呼吸道上皮细胞, 并使ＣＦＴＲ 得到有效表达。 第九章 载体 62
囊性纤维化治疗 § 目前在美国采用ＡＡＶ 2/ＣＦＴＲ治疗囊性纤 维化已经完成一期临床试验和二期临床试验。 § 一期试验: 通过鼻黏膜、上颌窦和肺(支气管灌 注和气溶胶吸入)转染ＡＡＶ 2/ＣＦＴＲ目的基 因, 结果证实: ＡＡＶ 2作为载体没有任何毒性, 目的基因转染效率高。 第九章 载体 63
二、痘病毒载体 1 、痘病毒概述 为最大的一类DNA病毒, 结构复杂。 病毒粒呈砖形或椭圆形，大小 (300～ 450)×(170～ 260)纳 米，有核心、侧体和包膜, 核 心含有与蛋白结合的病毒DNA。 第九章 载体 64
DNA为线型双链, 由 130～ 300 kb 的单线双链DNA 分子组成, 在 每个DNA 分子末端有一个发 夹环结构，分子量(85～ 240)× 106, 鸟嘌呤和胞嘧啶 的碱基含量低。 病毒粒中有30种以上的结构蛋 白和几种酶，核心蛋白中含 依赖于DNA的RNA多聚酶。 病毒在细胞质内增殖, 形成包涵 体, 病毒粒由微绒毛或由细胞 裂解而释放。 第九章 载体 65
§ 根据脊椎动物和昆虫宿主范围, 将痘病毒科分为 两个亚科：脊椎动物痘病毒亚科和昆虫痘病毒 亚科。 § 迄今为止, 还未见任何昆虫痘病毒载体的报道。 § 脊椎动物痘病毒亚科包括 8个属: 禽痘病毒属、 羊痘病毒属、野兔痘病毒属、拟软体动物痘病 毒属、正痘病毒属、副痘病毒属、猪痘病毒属 和亚塔痘病毒属。 第九章 载体 66
2 、 主要的痘病毒载体及其应用 § 痘病毒是研究最早最成功的载体病毒之一 § 特点： 宿主范围广 增殖滴度高 稳定性好 基因容量大 非必需区基因 可以插入多个外源基因表达水平较高 第九章 载体 67
牛痘病毒 § 第一个痘病毒载体是牛痘病毒。 § 第一：通过在基因组中进行大量的缺失来降低 牛痘的复制作用。 § 例如：NYVAC，一种牛痘缺失突变体。 § MVA，一种牛痘病毒在细胞培养中多次传 代期间偶尔形成的缺失突变体。 § 这两个病毒都已高度减毒，甚至在免疫抑制性 动物中毒性也很弱。 第九章 载体 68
§ 第二，对禽痘病毒进行实验，其在哺乳动物细 胞中不能进行完全复制。 § 例如金丝雀痘病毒和其它禽痘病毒。尽管它们 不能在哺乳动物细胞中合成DNA或进行全病毒复 制，但在其基因组通过感染或转染到这些细胞 中后，基因在早期还是被转录了。如果将一种 外源基因插入大容量基因组早期启动子的下游， 它也将被转录和翻译。从而使相关蛋白被宿主 免疫系统发现。 第九章 载体 69
目前痘苗病毒的应用 § 分为三个领域: (1) 痘病毒分子生物学领域的研究； (2) 体外生产和蛋白质功能化研究； (3) 作为活的疫苗或 具用于疫苗研究。 第九章 载体 70
§ 1982年, 研究人员将外源基因插入痘苗病毒的TK 基因中, 首次成功地构建了在哺乳动物细胞中表 达外源基因的重组痘苗病毒。 第九章 载体 71
三、逆转录病毒载体 1、 逆转录病毒概述 逆转录病毒科(retrovidae)是RNA病毒的一个大科, 过去 称为RNA 肿瘤病毒(RNA tumorviruses), 白血病病毒 (leukoviruses)或致瘤RNA 病毒(oncobaviruses)。 逆转录病毒基因组是由 2条相同的单链RNA分子组成，在 病毒颗粒内部还包含有t. RNA引物分子、反转录酶和整 合酶等组分。 目前，在鸟类及哺乳类动物中发现了许多种逆转录病毒， 例如鸟类的脾坏死病毒，鼠类的乳腺肿瘤病毒，莫洛 尼氏小鼠白血病病毒等，但其中研究得最为详尽的是 劳斯肉瘤病毒（Rous sarcoma virus，RSV）。 第九章 载体 72
2、逆转录病毒载体的构建 § （1）利用重组DNA技术除去病毒转化基因, 用目的基 因、选择标记基因代替病毒编码基因。 § 病毒的LTRS可以对插入的外源基因进行有效的转录。 这些载体常含有标记基因如neor基因等。因此, 可在体 外组建逆转录病毒前DNA载体, 包括两端LTRS, 中间插入 标记基因, 细菌复制子以及可供外源基因插入的单一切 点。 第九章 载体 73
2、逆转录病毒载体的构建 § （2）组建包装细胞系 § 使细胞中含有整合的缺陷型逆转录病毒DNA(已去除包 装信号), 尽管有大量的病毒蛋白存在, 但无病毒颗粒 装配。 § Mulligan实验室建成一种辅助病毒细胞株称为U 22细胞 , 它源于NIH 23 T 3成纤维细胞, 它是用Moloney白血病病 毒U(包装位点)缺陷株感染细胞而得到的, 这种细胞可 以表达病毒全部基因产物, 但由于缺少U位点, 不能包装 成毒粒。 第九章 载体 74
2、逆转录病毒载体的构建 （3） 用构建的逆转录病毒载体转染包装细胞 这种插有目的基因的载体可在培养细胞内扩增, 然后转染小鼠细胞。 由于这种逆转录病毒载体是缺陷的, 它必须在辅助病毒或包装细胞 存在下才能复制, 因此收获的病毒液中既含有载体病毒, 又含有 辅助病毒, 后者提供的蛋白可以包装载体RNA, 而不能包装自己的 RNA。使用这种辅助病毒细胞, 不需要标记基因, 产生的病毒都含 有载体RNA, 而不含有辅助病毒RNA。将这种含有目的基因的载体 病毒感染一株双嗜性辅助细胞PA 317, 可产生双嗜性evp蛋白, 从 而具有广泛的宿主细胞范围, 且可以产生较高的病毒滴度(102～ 103 CFU/ml)。 第九章 载体 75
2、逆转录病毒载体的构建 （4）用所得的缺陷型重组病毒感染靶细胞 通过与宿主细胞受体相互作用, 进入到细胞中, 通过反转 录并整合到宿主基因组。 这种病毒转录物不编码任何产生病毒外壳所需的蛋白质, 它通常编码目标基因, 另外, 许多无复制能力的载体编 码另一启动子(pro), 它在病毒基因组内合成另一基因 的m. RNA。由于这样的载体不编码衣壳蛋白, 所以无复制 能力的载体感染的细胞不能产生另外的病毒颗粒。因 此, 病毒基因组由一个被感染的细胞传至其他细胞。然 而病毒基因组可通过宿主基因的正常复制遗传过程而 传至所有子代子细胞。 第九章 载体 76
四、单纯疱疹病毒载体 1、 单纯疱疹病毒概述 § 单纯疱疹病毒（Herpes simplex virus，HSV）呈球形， 完整病毒由核心、衣壳、被膜(Tegument)及囊膜组成。 § 核心含双股DNA，缠绕成纤丝卷轴。 § 衣壳呈二十面体对称，由 162个壳微粒组成，直径为 100 nm。 § 衣壳外一层被膜复盖，厚薄不匀，最外层为典型的脂质 双层囊膜，上有突起。 § 有囊膜的病毒直径为 150～ 200 nm。 § 囊膜表面含g. B、g. C、g. D、g. E、g. G、g. H糖蛋白，与病毒对 细胞吸附/穿入（g. B、g. C、g. D、ge）、控制病毒从细胞核 膜出芽释放（g. H）及诱导细胞融合（gb、g. C、g. D、g. H） 有关。 § 并有诱生中和抗体(gd最强)和细胞毒作用（已知的HSV糖 蛋白均可）。 § 单纯疱疹病毒对乙醚及脂溶剂特别敏感。它在低温下可 生存数月，在湿热 50℃及干燥 90℃条件下30分钟可消灭。 第九章 载体 77
HSV基因组 § HSV基因组为一双链线性DNA 分子，由共价连接的长片段 （L）和短片段（S）组成。 § 每片段均含有单一序列和反 转重复序列。 § 基因组中有72个基因，共编 码70多种各异的蛋白质 § 24种蛋白特性不清楚外， § 18种编码蛋白组成病毒DNA结 合蛋白及各种酶类，参予病 毒DNA合成，包装及核苷酸的 代谢等。 § 30多种不同蛋白组成病毒结 构蛋白（如衣壳蛋白、囊膜 蛋白），在保护HSV的DNA， 以及HSV的致病作用和诱导机 体免疫应答中起重要作用。 第九章 载体 78
2 、单纯疱疹病毒载体的构建 § HSV载体可感染非分裂细胞，病毒滴度高，可容 纳长至 50 kb的外源基因，包括正常启动子、增 强子序列的完整基因的插入，HSV对神经系统有 天然的亲和性，可在神经系统中呈隐性感染， 因此可作为中枢神经系统靶向的良好载体。 第九章 载体 79
HSV载体有两种： § 一种为重组病毒型，构建与重组痘苗病毒相似，HSV非 必需区，如TK 基因中插入外源基因，然后经同源重组， 再筛选出重组的。 § 另一种为重组质粒型，将构建的质粒DNA连同HSV 21辅 助病毒一起导入细胞后，质粒DNA可被串联在一起，包 装在病毒颗粒内，这种包装有质粒DNA的假病毒，可以 感染其他细胞，但其效率较重组病毒低，外源基因的 容量也受到限制。目前，作为基因转移载体的HSV主要 来源于Ⅰ型HSV 。 第九章 载体 80
3 、单纯疱疹病毒载体的优点及应用 § HSV载体具有以下优点： ①宿主范围广，包括大量哺乳动物和鸟类的分裂和非分 裂细胞，宿主细胞广泛； ②病毒滴度高； ③外源基因容量大，可插入长达 50 kb 的外源基因，多种 抗肿瘤基因可被同时装入载体，达到联合治疗的目的； ④对神经细胞具有嗜向性，可在神经元细胞中建立终生 潜伏性感染。HSV载体的不足之处在于它的毒性。 第九章 载体 81
HSV-1被改造成两类载体： § 一类是扩增子载体，即仅把HSV的复制起点和包 装信号序列插入到细菌质粒中。当其转染至包 装细胞，用HSV辅助病毒超感染，便可获得含有 扩增子的假病毒。 § 另一类为重组1型单纯疱疹病毒，即删除了与复 制相关及非必需基因，以减少细胞毒性，可用 于宿主神经元细胞中长期表达外源治疗基因。 第九章 载体 82
五、猴空泡病毒 40 (Simian vacuolating virus 40，SV 40)载体 1 、SV 40病毒概述 § SV 40病毒属于乳多空病毒科(Papovaviridae)，多瘤病毒属，是 一种DNA肿瘤病毒, 于1960年由Sweet和Hilleman从猴肾细胞中分 离得到。 § SV 40为裸露的20面对称体, 直径为 45 nm，有72个壳粒。 § DNA为环形双股, 长约 5 kb，以超螺旋形式存在，并与细胞组蛋白 结合成核体。DNA 有2 种形式，DNA I占大多数，是共价键相联 的闭环式结构；DNAII来源于DNA I, 为开环式结构，两种DNA 都有感染性和转化性。 § 基因组可分为A～M 13个片段, 有一特定起点, 双向复制转录。 § SV 40 对热和福尔马林有抗性，在 56℃，高浓度氯化镁条件下可 灭活。 第九章 载体 83
2、SV 40病毒载体的构建 SV 40病毒载体有以下的特点： ①外源基因能高效表达； ②基因重排高，病毒基因组和重组分子常发生重排和缺 失现象； ③宿主范围窄，只能转染猴细胞； ④装载量较小。 第九章 载体 84
野生型必须经过改造成为基因克隆载体 § 野生型的SV 40病毒颗粒包装范围相当严格，超 过其基因组大小(5. 2 kb)的重组DNA就不能够被 包装为成熟的病毒颗粒。 § SV 40病毒还存在着寄主细胞的局限性，只能在 受体细胞中增殖，并最终导致寄主细胞的死亡， 这样就不能作长期的培养使用。 第九章 载体 85
SV 40病毒的基因克隆载体的类型 § 第一种是取代型的重组病毒载体（recombinant virus vector）。外源DNA是直接插入在缺陷性 的病毒基因组。 第九章 载体 86
SV 40病毒的基因克隆载体的类型 § 第二种是重组的病毒-质粒载体（recombinant viral plasmid vector）。 § 病毒基因组部分只保留下维持在哺乳动物细胞 中进行复制所必须的有关序列，但它融合上了 一个细菌质粒，因而还能够在大肠杆菌细胞中 进行复制和增殖。 第九章 载体 87
目前最需要解决的问题 § 病毒性载体均存在缺陷, 它们的靶向性和组织特 异性差，可控性弱，因此要筛选靶向性好、组 织特异性强且可精确调控的病毒性载体还需要 做大量 作。 第九章 载体 88
Скачать презентацию 第九章 载 体 第九章 载体 第三节 酵母质粒
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