Скачать презентацию 遺伝子の解析 第 2弾 DNAシークエンス法 DNAシークエンス ABI PRISM310を用いて遺伝子の配列を読む 原理 オートシークエンサー ABI PRISM310 の反応では合成 Скачать презентацию 遺伝子の解析 第 2弾 DNAシークエンス法 DNAシークエンス ABI PRISM310を用いて遺伝子の配列を読む 原理 オートシークエンサー ABI PRISM310 の反応では合成

d45a8bd8111f67fda1936bc450730eb7.ppt

  • Количество слайдов: 13

遺伝子の解析 第 2弾 DNAシークエンス法 遺伝子の解析 第 2弾 DNAシークエンス法

DNAシークエンス (ABI PRISM310を用いて遺伝子の配列を読む) 原理 オートシークエンサー(ABI PRISM310)の反応では合成 310) されるDNAを蛍光物質で標識します。 その標識されたDNAを電気泳動し、泳動中にレーザー光を当て励起光を 自動で検出し、コンピューターで解析します。 ABI PRISM310について ABI PRISM310でのシークエンス反応はサイクルシークエンス法とよ での ばれる方法で行っています。まず、PCR反応でA, G, C, DNAシークエンス (ABI PRISM310を用いて遺伝子の配列を読む) 原理 オートシークエンサー(ABI PRISM310)の反応では合成 310) されるDNAを蛍光物質で標識します。 その標識されたDNAを電気泳動し、泳動中にレーザー光を当て励起光を 自動で検出し、コンピューターで解析します。 ABI PRISM310について ABI PRISM310でのシークエンス反応はサイクルシークエンス法とよ での ばれる方法で行っています。まず、PCR反応でA, G, C, Tそれぞれに、励 起する波長が異なる4種類の蛍光色素をddNTPにつける方法(Dye  Terminator法)を用い、その標識されたDNAフラグメントを内径50μm のキャピラリー管のなかで電気泳動を行いA, G, C, Tそれぞれの蛍光を CCDカメラで検出し、塩基配列を読むことができます。

~DNAシークエンスの流れ~ PCRにて目的のDNA量を増やす。(同時に蛍光標識も行 う) エタノール沈殿にて目的DNAの分離・精製 オートシークエンサーにて目的DNAの塩基配列の読み 取り ~DNAシークエンスの流れ~ PCRにて目的のDNA量を増やす。(同時に蛍光標識も行 う) エタノール沈殿にて目的DNAの分離・精製 オートシークエンサーにて目的DNAの塩基配列の読み 取り

デオキシヌクレオチド(dNTP)と      ジデオキシヌクレオチド(ddNTP) 塩 基 P OH デオキシヌクレオチド(d. NTP) 塩 基 P H ジデオキシヌクレオチド(dd. NTP) デオキシヌクレオチド(dNTP)と      ジデオキシヌクレオチド(ddNTP) 塩 基 P OH デオキシヌクレオチド(d. NTP) 塩 基 P H ジデオキシヌクレオチド(dd. NTP) d. NTPとdd. NTPはPCR法でそれぞれDNAの構成単位として利用されま す。違いは3´の位置の水酸基が水素基になっていることです。Nには A, T, G, Cの 4種類の塩基が当てはまります。

d. NTPとdd. NTPの伸長反応の違い P OH P P P 5´末端 A T T C T d. NTPとdd. NTPの伸長反応の違い P OH P P P 5´末端 A T T C T 3´末端 A G G A d. ATPが 反応した場合 3´末端 G A A T C T T G 続く 3´末端 P P P H P P P P 5´末端 A 反応した場合 A A T dd. ATPが G C T T G 3´末端 P P 伸長反応はStop

d. NTPとdd. NTPが一緒にあるときに PCR反応をすると・・・・ d. NTPをA, T, G, Cとし、dd. NTPをA*, T*, G*, C*とする 5´ d. NTPとdd. NTPが一緒にあるときに PCR反応をすると・・・・ d. NTPをA, T, G, Cとし、dd. NTPをA*, T*, G*, C*とする 5´ 3´ ACGTACG TGCATGC 3´ 5´ PCR反応 ACG* TGCATGC 5´ 5´ 3´ ACGTACG* TGCATGC 5´ 5´ 3´ テンプレートDNA A* TGCATGC ACGT* TGCATGC 5´ A*, T*, G*, C*が取り込まれると、そこで伸長反応が停止するので いろいろな長さ(分子量)のDNA断片が作られる

Dye Terminator法 蛍光色素 塩 基 P H A P H T P H dd. NTPの4種類の塩基( Dye Terminator法 蛍光色素 塩 基 P H A P H T P H dd. NTPの4種類の塩基( A, T, G, C)それぞれに異なっ た蛍光色素を標識することで 4種類のdd. NTPを見分けるこ とができる。 G P H C P H

蛍光色素で標識することで・・・・・ 5´ 3´ ACA* TGTATGC 5´ 5´ 3´ ACT* TGAATGC 5´ ほぼ同じ長さ(分子量)だが これら4種類のDNAを 5´ 蛍光色素で標識することで・・・・・ 5´ 3´ ACA* TGTATGC 5´ 5´ 3´ ACT* TGAATGC 5´ ほぼ同じ長さ(分子量)だが これら4種類のDNAを 5´ 3´ ACG* TGCATGC 5´ 5´ 3´ ACC* TGGATGC 5´ 区別することができる

ゲル電気泳動の分子ふるい効果 DNAは負電荷を持つ高分子なので全て+極へ進みます。DNAの分 子量が小さいほど(短いほど)ゲルマトリックスとのふるわれ方が少な く、進みやすくなります。このように一定時間泳動すると分子量の差に よってDNAが分離されることを分子ふるい効果といいます。 ゲルマトリックス 高分子DNA 低分子DNA + - ゲル電気泳動の分子ふるい効果 DNAは負電荷を持つ高分子なので全て+極へ進みます。DNAの分 子量が小さいほど(短いほど)ゲルマトリックスとのふるわれ方が少な く、進みやすくなります。このように一定時間泳動すると分子量の差に よってDNAが分離されることを分子ふるい効果といいます。 ゲルマトリックス 高分子DNA 低分子DNA + -

Ex)塩基配列を知りたい(水色部分が知りたい部分)DNA ACGTACG TGCATGC 5´ 3´ 3´ 5´ Dye Terminator法を利 用してPCRをすると 出来上がったDNA断片 プライマー 5´ 3´ ACGT* Ex)塩基配列を知りたい(水色部分が知りたい部分)DNA ACGTACG TGCATGC 5´ 3´ 3´ 5´ Dye Terminator法を利 用してPCRをすると 出来上がったDNA断片 プライマー 5´ 3´ ACGT* TGCATGC ACGTA* TGCATGC 5´ 3´ ACGTAC* TGCATGC 5´ 3´ 5´ 5´ AC* TGCATGC 5´ 3´ 5´ ACGTACG* TGCATGC A* TGCATGC 5´ 3´ 5´ 5´ 5´ ACG* TGCATGC 5´

PCRで作られたDNA断片をポリマーを充填した(ゲルと同 様)キャピラリー管の中で電気泳動をすると 5´ ACGTACG* 5´ ACGTAC* 5´ ACGTA* 5´ 5´ ACGT* ACG* AC* A* PCRで作られたDNA断片をポリマーを充填した(ゲルと同 様)キャピラリー管の中で電気泳動をすると 5´ ACGTACG* 5´ ACGTAC* 5´ ACGTA* 5´ 5´ ACGT* ACG* AC* A* - 分子ふるい効果 により短い断片 が早く+極側へ 移動する +

蛍光のついた塩基を早く+極側についた順に並べると ACGTACG 5´ 3´ ACGTACG TGCATGC 5´ よって知りたかった塩基配列はACGTACGとなる 参考文献 改訂遺伝子 学実験ノート 羊土社     バイオ実験超基本Q&A 羊土社 蛍光のついた塩基を早く+極側についた順に並べると ACGTACG 5´ 3´ ACGTACG TGCATGC 5´ よって知りたかった塩基配列はACGTACGとなる 参考文献 改訂遺伝子 学実験ノート 羊土社     バイオ実験超基本Q&A 羊土社

実際のシークエンス結果(一部抜粋) 実際のシークエンス結果(一部抜粋)