ВИРУСЫ ВИРУСЫ qсубмикроскопические неклеточные формы жизни qобладающие

ВИРУСЫ

ВИРУСЫ qсубмикроскопические неклеточные формы жизни, qобладающие свойством генетического паразитизма (строгие внутриклеточные паразиты), qсодержащие один тип нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) q отсутствие органоидов; собственных метаболических систем; неспособность к бинарному делению; q дизъюнктивный тип размножения (разобщенный) – репродукция.

МОРФОЛОГИЯ ВИРУСОВ: РАЗМЕРЫ Мелкие – от 20 до 60 -70 (пикорнавирусы, арбовирусы, реовирусы); Средние – 80 -100 -150 (миксовирусы); Крупные – 150 и более (герпесвирусы, оспенные вирусы).

ВИРУСЫ Мелкие вирусы состоят только из нуклеиновой кислоты и белка – это нуклеопротеиды и нуклеокапсиды. Капсид состоит из белковых субъединиц – капсомеров, уложенных компактно, правильными образованиями на поверхности нуклеотида в виде спирали (миксовирусы) или с кубической симметрией (энтеро-, адено-, герпесвирусы). Каждый вирус имеет определенное число капсомеров (адено – 252, полио – 60, герпес – 162 и т. д. ). У средних и крупных вирусов, кроме нуклеокапсида, есть внешняя оболочка, содержащая белки, жиры, углеводы. Вся эта структура – вирион. В состав вириона входят неорганические ионы.

МОРФОЛОГИЯ ВИРУСОВ: ФОРМА КАПСИДОВ

ПРИМЕРЫ НЕКОТОРЫХ ВИРУСОВ: ГЕРПЕСВИРУСЫ

ТАКСОНОМИЧЕСКАЯ КЛАССИФИКАЦИЯ ВИРУСОВ Царство – Вирусы (Vira); Подцарство – ДНК- и РНК- содержащие (дезокси- и рибоксивирусы) Семейство (-viridae); (8 семейств ДНК-содержащих Рибоксивирус Picornaviridae и 16 семейств РНК-содержащих) Подсемейство (-virinae); Род (-virus); Enterovirus Human Вид – не имеют enterovirus C международного (Poliovirus 1) биноминального обозначения.

РЕПРОДУКЦИЯ ВИРУСА Ø Ø 1. Адсорбция - взаимодействие специфических рецепторов вируса и клеток хозяина (независима от температуры и обратима) 2. Проникновение вируса в клетку: Эндоцитоз – образование вакуоли, в которую впрыскиваются лизосомальные ферменты, растворяющие белковую оболочку вируса, освобождая нуклеиновую кислоту; Путь слияния мембран (характерен для крупных вирусов) 3. Освобождение нуклеиновых кислот - “раздевание” нуклеокапсида и активация нуклеиновой кислоты 4. Синтез нуклеиновых кислот и вирусных белков – подчинение систем клетки хозяина и их работа на воспроизводство вируса. 5. Сборка вирионов - ассоциация реплицированных копий вирусной нуклеиновой кислоты с капсидным белком. 6. Выход вирусных частиц: Почкование – клетка остается живой Повреждение цитоплазматической мембраны за счёт нейраминидазы (цитопатогенное действие) Сложные вирусы приобретают суперкапсид

ЖИЗНЕННЫЙ ЦИКЛ Вирион - сформированная вирусная частица, существует вне клетки, содержит: нуклеиновую кислоту (геном), защитную протеиновую оболочку (капсид), структурные белки, ферменты

ТИПЫ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ВИРУСА С КЛЕТКОЙ Продуктивный тип— завершается образованием и выходом нового поколения вирионов (лизис клетки или почкование) Абортивный тип— не завершается образованием новых вирионов, поскольку инфекционный процесс в клетке прерывается на любом из этапов Интегративный тип, или вирогения — характеризуется встраиванием (интеграцией) вирусной ДНК в виде провируса в хромосому клетки и их совместным сосуществованием (совместная репликация).

МЕТОДЫ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ Экспресс-диагностика –обнаружение вирусов или антигенов в исследуемом материале Вирусологический метод – выделение вируса и его идентификация: Накопление вирусов; Индикация вирусов; Идентификация вирусов.

ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКА - ОБНАРУЖЕНИЕ ВИРУСОВ ИЛИ АНТИГЕНОВ В ИССЛЕДУЕМОМ МАТЕРИАЛЕ МИКРОСКОПИЯ ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА ЭЛЕКТРОННАЯ СВЕТОВАЯ ЛЮМИНЕСЦЕНТНАЯ

ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКА 1. Обнаружение элементарных телец и внутриклеточных включений при световой микроскопии А. Элементарные тельца – это отдельные крупные вирионы, имеющие размеры до 200 нм и видимые при окраске по Морозову, Романовскому-Гимзе Вирус осповакцины (тельца Пашена). Препарат из хорионаллантоисной оболочки эмбриона, зараженного вирусом осповакцины. Окраска по Морозову.

ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКА Б. Обнаружение вирусных включений, локализующихся в цитоплазме тельца Бабеша-Негри при бешенстве тельца Гварниери при натуральной оспе

ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКА В. Обнаружение вирусных включений, локализующихся в ядре Вирусные включения в ядрах Койлоциты при ВПЧ инфекции

ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКА 2. Обнаружение вирусных частиц - электронная микроскопия (при негативном контрастировании) Negative image of an Adenovirus (A), Calicivirus (B), Parvovirus (C), Coronavirus (D), Parapoxvirus (E), Orthopoxvirus (F), Rotavirus (white arrow), Enterovirus (black arrow) (G) and Influenza virus (H).

ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКА 3. Обнаружение антигенов вирусов: РИФ (реакция иммунофлюоресценции); ИФА (иммуноферментный анализ); РИА (радиоиммунный анализ); ИЭМ (иммунная электронная микроскопия)

ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКА: РИФ с использованием диагностических люминесцирующих сывороток

ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКА: ИФА в лунках планшета с сорбированными диагностическими антителами При положительном результате изменяется цвет хромогена

ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКА: РИ А Разновидность твердофазного иммунологического анализа, когда один из известных компонентов имеет радиоактивный маркер - радионуклид (125 J, 14 C, 3 Н, 51 Сr и др. ) q Результаты учитываются с помощью счетчика (бета - или гамма-излучение) или авторадиографии, используя рентгеновскую пленку. q Интенсивность излучения прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител. q

ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКА: ИЭМ Основана на взаимодействии антител диагностической сыворотки с вирусными частицами, добавляемой к исследуемому материалу. Вирусы, обработанные иммунной сывороткой, образуют иммунные комплексы (микропреципитаты). Вокруг вирионов образуется "венчи" из антител, контрастированные фосфорно-вольфрамовой кислотой или другими электроннооптически плотными препаратами. Это позволяет выявить возбудителя и одновременно его идентифицировать.

ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКА 4. Обнаружение нуклеиновых кислот вирусов

ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД I этап НАКОПЛЕНИЕ ВИРУСА II этап ИНДИКАЦИЯ ВИРУСА III этап ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВИРУСА

ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД НАКОПЛЕНИЕ ВИРУСА В лабораторных животных В эмбрионах (куриных, гусиных и т. д. ) В культурах тканей I этап -

НАКОПЛЕНИЕ ВИРУСА В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК • • Типы тканевых культур: Первично-трипсинизированные. Получают из различных органов и тканей (измельчение источника; обработка трипсином; освобождение от детрита; стандартизация числа клеток, взвешенных в питательной среде с антибиотиками; разлив в пробирки или флаконы) Полуперевиваемые культуры – штаммы диплоидных клеток, способные вне организма выдерживать 50 -100 пассажей благодаря двойному набору хромосом, после чего отмирают. Перевиваемые клетки существуют вне организма очень долго. Получены из нормальных тканей, злокачественных, эмбриональных. Не могут быть использованы для вакцин.

ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ ДЛЯ КУЛЬТУР КЛЕТОК Синтетические – содержат микроэлементы и витамины. Используют для поддержки жизнедеятельности. Полусинтетические – содержат гидрализаты различных продуктов. Используют для роста. Натуральные (естественные) сыворотки крупного рогатого скота или фетальные Наиболее универсальная – 199 среда, содержащая 66 компонентов. Основу всех сред составляют солевые растворы: Эрла, Хенкса. р. Н среды должна быть строго определена и постоянна – 7, 0 -7, 4.

НАКОПЛЕНИЕ ВИРУСА В ЭМБРИОНЕ Преимущества: закрытая полость, свободная от микрофлоры и вирусов, у эмбрионов не образуются антитела, они доступны и дешевы.

НАКОПЛЕНИЕ ВИРУСА В ЖИВОТНЫХ Преимущества: оценить этапы развития клинической картины заболевания, патоморфологические и патогистологические изменения в органах и тканях.

ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД II этап ИНДИКАЦИЯ ВИРУСА 1. Цветная проба Солка 2. Микроскопический – оценка ЦПД вируса 3. Реакция гемагглютинации (РГАггл) 4. Реакция гемадсорбции (РГАдс)

ИНДИКАЦИЯ ВИРУСА: ЦВЕТНАЯ ПРОБА СОЛКА Самый простой метод индикации вирусов в культуре клеток. Сущность его заключается в визуальной оценке окраски питательной культуральной среды. При жизни клеток в культуре они выделяют в питательную среду кислые продукты своего метаболизма, вызывая изменение цвета индикатора с красного на желтый уже на третьи сутки. При развитии вируса в культуре клеток он нарушает функционирование клеток вплоть до их гибели. Отмечается задержка изменения цвета среды более 6 дней, что и позволяет сделать заключение о присутствии вируса в культуре.

ИНДИКАЦИЯ ВИРУСОВ: ЦПД видимые под микроскопом морфологические изменения клеток (вплоть до их отторжения от стекла), возникающие в результате внутриклеточной репродукции вирусов (пикноз ядер, просветы в монослое)

ИНДИКАЦИЯ ВИРУСОВ: РЕАКЦИЯ ГЕМАДСОРБЦИИ §Основана на способности вирусов, обладающих гемагглютинирующими свойствами, вызывать гемадсорбцию. §Компоненты: культура клеток + эритроциты §Микроскопия: адсорбция эритроцитов на клетках, пораженных вирусом

РЕАКЦИЯ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ §Основана на способности вирусов, обладающих гемагглютинирующими свойствами, вызывать агглютинацию (склеивание) эритроцитов. §Компоненты: вируссодержащая жидкость (культуральная среда, амниотическая или аллантоисная жидкостьи т. д. )+ эритроциты §Визуально: феномен гемагглютинации на стекле в виде хлопьев

ИНДИКАЦИЯ ВИРУСОВ: В эмбрионах: Образование бляшек на хорионаллантоисной оболочке. Помутнение амниотической жидкости. Реакция гемагглютинации В организме лабораторного животного: Оценка клинических проявлений инфекции. Оценка патоморфологических и патогистологических изменений.

ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД III этап ИДЕНТФИКАЦИЯ 1. 2. 3. ВИРУСА РТГА Реакция нейтрализации с учетом по: цветной пробе, РТГАдс, нейтрализации ЦПД или инфекционной активности вируса Прямая и непрямая РИФ, РСК КОМПОНЕНТЫ: Вируссодержащая жидкость + Диагностическая сыворотка

ИДЕНТФИКАЦИЯ ВИРУСА: РТГА КОМПОНЕНТЫ: Вируссодержащая жидкость + Диагностическая сыворотка + Эритроциты АГ+АТ НЕТ ХЛОПЬЕВ АГ ХЛОПЬЯ КРАСНОГО ЦВЕТА А Т

ИДЕНТФИКАЦИЯ ВИРУСА: РЕАКЦИЯ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ основана на способности специфических вируснейтрализующих антител блокировать свойства вирусов Реакция АТ неспецифичны АТ специфичны (вирус поражает тест- (нейтрализация вируса объекты) АТ) Цветная проба цвет среды не изменяется (красный) цвет среды изменяется на желтый Нейтрализация ЦПД морфологические изменения клетки нет изменений клеток РТГАдс адсорбция эритроцитов на пораженных клетках нет гемадсорбции Нейтрализация инфекционной активности у животного будет заболевание животное будет здорово

СЕРОДИАГНОСТИКА исследование сывороток крови больного для выявления AT в серологических реакциях q РТГА, РСК, ИФА, непрямая РИФ, РИА с антигенами вирусов или инактивированными вирусными частицами. q РН с живыми лабораторными штаммами вируса с учетом по: цветной пробе, РТГАдс, нейтрализации ЦПД или инфекционной активности вируса КОМПОНЕНТЫ: Сыворотка больного + Вирусный диагностикум