ВЭЖХ и масс-спектрометрия Раздел 1 ВЭЖХ ООО Спектроника

ВЭЖХ и масс-спектрометрия Раздел 1. ВЭЖХ ООО «Спектроника» , Москва, ул. Докукина, 16, стр. 1 тел. /факс: (495) 221 -6763 www. spektronika. ru

Часть 5 - Пробоподготовка перед хроматографическим разделением. - Практическое использование ВЭЖХ в различных областях анализа. - Современные подходы к повышению производительности ВЭЖХ-анализа. - Классическая и быстрая хроматография. 2

Задачи пробоподготовки для ВЭЖХ ● Перевод образца в растворитель, подходящий ● ● ● для системы Удаление компонентов и примесей (в т. ч. механических), отрицательно влияющих на работу колонки и/или системы Отделение мешающих или балластных компонентов (сброс матрицы) Обогащение пробы (концентрирование) Перевод определяемых компонентов в форму, обеспечивающую чувствительность детектирования Перевод определяемых компонентов в форму, обеспечивающую селективное разделение 3

Методы пробоподготовки ● ● ● ● Фильтрация Осаждение Экстракция Сорбция Разбавление Упаривание Получение производных 4

Фильтрация ● Мембранные фильтры ● Шприцевые насадки Подбирать материал фильтра с учетом растворителя и определяемых компонентов 5

Упаривание ● ● Вакуумное Температурное Вентиляционное Комбинированное Учитывать летучесть определяемых компонентов 6

Производные ● ● ● Аминокислоты Жирные кислоты Спирты Альдегиды Амины и т. д. Полнота прохождения реакции: Температура и другие условия реакции; Избыток реагента 7

Экстракция ● Встряхивание (делительная ● ● ● ● воронка) УЗ-экстракция Микроэкстракция Сокслетт (включая автоматический) Микроволновая СФ-экстракция ASE и т. д. - Подобное растворяется в подобном - Повышение температуры повышает эффективность экстракции - Контроль термостабильности экстрагируемых компонентов 8

Что такое ускоренная экстракция растворителями (ASE)? § Методика экстракции, которая использует растворители или смеси растворителей § Экстракции подвергаются только твердые или полутвердые образцы § Используется повышенная температура (40 -200°C) и давление (1500 -2000 psi) § Используются растворители с малом объеме, при этом время экстракции предельно мало 9

Почему используются растворители при повышенной температуре? § Увеличивается скорость десорбции § Снижается вязкость растворителя § Аналиты быстрее диффундируют в растворитель § Преодолеваются матричные эффекты § Увеличивается растворимость аналитов § Используется меньше растворителя 10

Поместить фильтр в ячейку 11

Заполнить образцом (табак) ячейку 12

Вставить ячейку в карусель 13

Наполнить бутыли растворителями 14

Создать метод или воспользоваться готовым 15

ASE помещает ячейку в печь 16

Экстракты разными растворителями 17

Последовательная экстракция • Последовательная экстракция из ягод черники для определения антиоксидантов • Растворители (слева направо): гексан, хлористый метилен, этил ацетат, ацетонитрил, этанол 18

Алгоритм работы ASE Загрузить ячейку Насос Наполнить Время (мин) растворителем 0. 5 -1 Нагреть Под давлением Клапан 5 Печь Статич. экстракция Клапан продувки 5 цикл Растворители Промыть 0. 5 свежим растворителем Экстракц. ячейка Клапан Осушить азотом Экстракт готов 1 -2 Всего (мин) 12 - 14 Азот Виала для экстракта 19

Сравнение методик экстракции Метод Размер образца, г Объем растворителя, мл ASE 1 -100 5 -150 Автоматический Сокслетт 10 -30 50 -150 Встряхиватель 10 -50 50 -300 Микроволновой 5 -10 30 -50 Ультразвук 30 100 -500 Сокслетт 1 -100 200 -1000 • Окупаемость системы ASE при полной загрузке: около 1. 5 лет 20

ASE® 150 и 350 21

ASE® 150 § Работает с одной ячейкой и одной бутылью растворителя § Размер ячеек: 1 -100 мл § Компактная система § Идентичная технология с ASE 350 Идеально для лабораторий с небольшой загрузкой 22

ASE® 350 § Автоматическая экстракция из 12 -24 ячеек с образцами § Ячейки с объемами 1100 мл § Среднее время экстракции 15 мин на образец § 3 растворителя или их смесь § Объем растворителя Быстрый и эффективный путь пробоподготовки для экстракции 5– 150 мл 23

ТФЭ – Твердо. Фазная Экстракция Мешающий компонент Экстрагируемый компонент Кондиционирование картриджа Загрузка образца Промывка Элюирование 24

Автоматическая твердофазная экстракция (ТФЭ) – система Auto. Trace 280 § Автоматическая пробоподготовка для органического анализа § Автоматическая экстракция из водных проб большого объёма § - От 10 до 2000 мл § - Питьевые и природные воды § - Сточные воды § Автоматическая твердофазная экстракция (ТФЭ) § - Используются картриджи с традиционными обращённо-фазовыми сорбентами 25

Схема работы экстрактора Auto. Trace 280 26

Оборудование для ТФЭ § Автоматическая станция для твердофазной экстракции Auto. Trace 280 27

Преимущества Auto. Trace 280 § § Полная автоматизация ТФЭ – Автоматическая одновременная загрузка 6 образцов – Автоматические кондиционирование картриджей, промывка, элюирование Повышение степени извлечения и воспроизводимости экстракции – Использование постоянных скоростей потока при загрузке и элюировании Снижение количества растворителей по сравнению с жидкость-жидкостной экстракцией Не требуется вытяжная вентиляция для экстракции растворителями – Закрытая система для экстракции – Раздельный сбор водного и органического слива 28

Степень извлечения и воспроизводимость при экстракции пестицидов Соединени е Auto. Trace SPE Вакуумный манифолд Степень извлечени я, % Sr, % Атразин 88 1. 8 54 12. 2 Пропазин 91 1. 5 80 7. 3 Алахлор 99 3. 4 96 4. 1 Металахлор 99 4. 3 96 2. 9 29

Снижение стоимости экстракции Вариант проведения Стоимость затрат на одну пробу (USD) Auto. Trace SPE 4 Вакуумный манифолд 13 Делительная воронка 25 • С учётом затрат на растворители, оборудование и оплату труда 30

Экстрагируемые компоненты ü Фенолы ü Полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) ü Диоксины, дибензофураны ü Полихлорированные бифенилы ü Нефтепродукты ü Пестициды, гербициды ü Нитрозамины ü и т. д. 31

Примеры использования ВЭЖХ 32

Применение Объекты анализа • Вода: питьевая, сточная и т. д. • Почва, донные отложения • Воздух (с фильтров) • Мясо, молоко и продукты из них • Овощи и фрукты • Мука, хлеб, мучные продукты • Кондитерские изделия • Натуральные напитки • Напитки • Пищевое сырье • И другое Определяемые компоненты • ПАУ, ПХБ • Альдегиды, кетоны • Фенолы, пестициды • Микотоксины • Меламин • Витамины • Красители, консерванты • Подсластители • Аминокислоты • Углеводы • И другое 33

Полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) 70 m. FU 6 2 1 5 4 3 7 8 0 0 5 10 15 20 25 Минуты Колонка: Acclaim PA, 5 μm Температура: 30°C Элюент: градиент ацетонитрил-вода Скорость потока: 2. 0 мл/мин Объём пробы: 10 мкл Детектирование: флуориметрическое Пики: 1. Нафталин 2. Аценафтилен 11 3. Аценафтен 4. Флуорен 13 5. Фенантрен 9 10 12 6. Антрацен 16 15 7. Флуорантен 8. Пирен 14 9. Бензо[a]антрацен 10. Хризен 11. Бензо[b]флуорантен 12. Бензо[k]флуорантен 30 35 40 45 13. Бензо[a]пирен 14. Дибензо[a, h]антрацен 34 15. Бензо[g, h, i]перилен 16. Индено[1, 2, 3 cd]пирен

ОФ-сорбенты с модифицированной селективностью Стандартный ODS (Acclaim 120 C 18) Модифицированная длина защищенная поверхность (Acclaim PA) Повышенная p. H-стабильность: 1. 5 -10 (Acclaim PA 2) 35

Карбонильные соединения 0. 03 1 AU 2 0 0 5 Колонка: Acclaim® 120 С 18, 5 μm Элюент: градиент ацетонитрилвода Скорость потока: 1. 0 мл/мин Объём пробы: 10 мкл Детектирование: 360 нм Пики: 1. формальдегид 2. ацетальдегид 3. акролеин 7 9 4. ацетон 3 6 8 4 5. пропионовый альдегид 5 10 11 13 6. кротоновый альдегид 12 7. метаакролеин 8. масляный альдегид 9. метилэтилкетон 10. бензальдегид 11. валериановый альдегид 10 15 20 12. м-метилбензальдегид 13. гексаналь Минуты 36 В виде производных с динитрофенилгидразином (ДНФГ)

Нитрозамины 220 1 4 56 7 m. AU 2 3 89 0 0 Минуты Колонка: Acclaim® PA, 5 μm Элюент: градиент ацетонитрилвода Скорость потока: 1. 0 мл/мин Объём пробы: 10 мкл Детектирование: 230 нм Пики (300 нг каждого): 1. N-нитрозо-диметиламин 2. N-нитрозо-морфолин 3. N-нитрозометилэтиламин 4. N-нитрозо-пирролидин 5. N-нитрозо-диэтиламин 6. N-нитрозо-пиперидин 7. N-нитрозодипропиламин 8. N-нитрозо-дибутиламин 9. N-нитрозо-дифениламин 30 Без дериватизации 37

Фенолы Колонка: Acclaim® PA, 3 μm Элюент: градиент метанол-вода с МСК Скорость потока: 1. 0 мл/мин Объём пробы: 5 мкл Детектирование: 285 нм Пики (50 -250 мкг/л каждого): 1. фенол 2. 2 -хлорфенол 3. 4 -нитрофенол 4. 2 -нитрофенол 5. 2, 4 -диметилфенол 6. 4 -хлор-3 -метилфенол 7. 2, 4 -дихлорфенол 8. 2, 4 -динитрофенол 9. 2 -метил-4, 6 дихлорофенол 10. 2, 4, 6 -трихлорфенол 11. пентахлорфенол Для повышения чувствительности можно использовать амперометрическое детектирование 38

Общий органический углерод (TOC) Параметр TOC (ООУ – общий органический углерод) – показатель чистоты воды от органических примесей (отличная замена метода ХПК – химически потребляемый кислород). Анализатор TOC Образец сжигается при 800 -950 Cº в присутствии катализатора в токе синтетического воздуха. Смесь продуктов окисления очищается на сорбентах. Оксиды углерода определяется на ИК-детекторе. 39

Сульфопрепараты Колонка: Acclaim® PA 2, 5 μm Температура: 30 °C Элюент: ацетонитрил-вода Скорость потока: 1. 0 мл/мин Объём пробы: 10 мкл Детектирование: 265 нм 1 AU 3 2 4 5 Пики: 6 7 8 9 0 5 10 Минуты 15 20 (50 ppm каждого) 1. Сульфаниламид 2. Сульфатиазол 3. Сульфамеразин 4. Сульфаметазин 5. Сульфоксазол 6. Сульфапиридазин 7. Сульфаметоксазол 8. Сульфадиметоксин 9. Сульфахиноксалин 40

Тетрациклиновые антибиотики Колонка: Acclaim® PA C 16, 5 μm, 4. 6 x 150 мм Температура: 30°C Элюент: градиент ацетонитрил – фосфатный буфер Скорость потока: 1. 5 мл/мин Объём пробы: 60 мкл Детектирование: 360 нм Пики: 1. окситетрациклин 2. тетрациклин 3. хлортетрациклин 4. доксициклин (А) – образец свинины с добавлением 1 мкг/г каждого компонента (B) – контрольный образец свинины (С) – стандарт тетрациклинов, 0. 33 мкг/мл каждого в воде 41

Гормоны Колонка: Acclaim 120, C 18, 5 μm (4. 6 x 250 мм) Температура: 30°C Элюент: изократика - метанол / тетрагидрофуран / вода Скорость потока: 1. 0 мл/мин Объём пробы: 60 мкл Детектирование: 240 нм Пики: 1. преднизон 2. преднизолон 3. кортизол 4. флудрокортизон (ISTD) 5. метилпреднизолон 6. 11 -дезоксикортизол 7. дексаметазон 42

Подходы к повышению производиительности 43

Параллельная хроматография Кран-переключатель подключает автосамплер то к одному, то к другому каналу анализа 44

Тандемная хроматография • Исключает фазы промывки и уравновешивания колонки из времени аналитического цикла • Сокращает время на 20 -50% 45

On-line ТФЭ Гомогенизация Экстракция растворителем Очистка экстракта (ТФЭ): нанесение на патрон, отмывка, элюирование Упаривание 5 -15 мин 20 -60 мин 30 -120 мин 10 -30 мин Автоматическая on-line ТФЭ: введение в прибор экстракта напрямую с отделением мешающих компонентов на специальной колонке 46

On-line ТФЭ 1, 2 – двойной градиентный насос4 – колонка для ТФЭ 6 – детектор 3 – автосамплер 5 – аналитическая колонка 7 – кран-переключатель 47

Скоростная хроматография 0 5 10 15 20 48

Скоростная хроматография Влияние размера частиц Эффективность 80 Давление [bar] H [µm] 1000 dp = 10 µm dp = 5 µm dp = 3 µm dp = 1. 7 µm 60 Давление 1200 40 dp= 1. 7 µm dp= 3 µm dp= 5 µm dp= 10 µm 800 600 400 20 200 0 2 4 6 u [mm/s] 8 10 0 2 4 6 8 10 u [mm/s] t Меньший размер частиц позволяет увеличивать скорость потока без потели эффективнос 49 t Уменьшение размера частиц резко повышает давление в системе

Размер частиц и размер колонок Размеры колонки Размер частиц 5 4 3 2 1 [µm] Эффективность Давление в колонке 5 x 250 4. 6 x 1 5 0 3 x 75 2 x 50 [mm] Чувствительность детектирования Расход элюента Время жизни колонки Идеальный диапазон для большинства хроматографических50 приложений

Скоростная хроматография Стандартная ВЭЖХ 5 µm 4. 6 x 150 мм 1. 2 мл/мин, 30°C, 110 bar 0 2 4 6 8 10 12 Минуты 5 x 0 0. 4 0. 8 1. 2 1. 6 2. 0 0. 1 0. 2 0. 3 0. 4 0. 1 0. 2 Быстрая ВЭЖХ 3 µm 3 x 33 мм 3. 5 мл/мин, 60°C, 300 bar Минуты 38 x 0 3 µm 3 x 75 мм 1. 2 мл/мин, 50°C, 170 bar 2. 4 Минуты 26 x 0 Быстрая ВЭЖХ 0. 3 Минуты Ультрабыстрая ВЭЖХ 2 µm 2. 1 x 30 мм 2. 0 мл/мин, 82°C, 390 bar Время анализа 0. 3 мин ширина пика 220 мс 51

Требования к прибору для быстрой ВЭЖХ – Повышенное максимальное давление (800 атм и выше) – Широкий диапазон скоростей потока (до 3 мл/мин) – Быстрый цикл ввода пробы (< 15 с) – Термостатирование колонки при повышенной температуре (свыше 100°C) – Повышенная скорость сбора данных с детектора: до 100 Гц – Колонки с сорбентами менее 3 мкм – Инструментальные программные средства для ускорения и валидации 0 5 10 15 20 52

Определение аминокислот Предколоночная автоматическая дериватизация аминокислот в автосамплере с OPA (о-фталевым альдегидом) или с FMOC (9 -флуоренилметил хлороформат) Пики (стандарт 100 пмоль): 1. Аспартат 12. 2. Глутамат 13. 3. Аспарагин 14. 4. Серин 15. 5. Глутамин 16. 6. Гистидин 17. 7. Глицин 18. 8. Треонин 19. 9. Аргинин 20. 10. Аланин 22. 11. Тирозин Цистин Валин Метионин Триптофан Фенилаланин Изолейцин Лизин Гидроксипролин Пролин 53

Определение аминокислот в режиме быстрой ВЭЖХ Колонка 2 мкм Пики (стандарт 100 пмоль): 1. Аспартат 12. 2. Глутамат 13. 3. Аспарагин 14. 4. Серин 15. 5. Глутамин 16. 6. Гистидин 17. 7. Глицин 18. 8. Треонин 19. 9. Аргинин 20. 10. Аланин 22. 11. Тирозин Цистин Валин Метионин Триптофан Фенилаланин Изолейцин Лизин Гидроксипролин Пролин 54

Определение аминокислотного состава Определение Аминокислот Без С дериватизацией Предколоночная дериватизации Послеколоночная СФ ЭХ МС СФ Флуоресц. 55

Определение аминокислотного состава на системе AAA-Direct Элюент (Na. OH, Na. OAc) Время (с) Потенциал Интегрирование Образец: Смесь аминокислот Разделяющая колонка (анионообменная) Электрохими -ческий детектор -e– Амперометричес кая ячейка Слив Рабочий электрод (Au) Электрод сравнения (Ag/Ag. Cl) 0. 00 0. 05 0. 20 0. 45 0. 50 0. 55 0. 58 0. 60 – 0. 20 0. 00 +0. 40 0. 00 – 2. 00 +0. 50 – 0. 20 Старт Стоп n C Время 56

Определение аминокислотного состава гидролизатов различных видов мяса на системе AAA-Direct Колонка: Amino. Pac PA 10 Детектирование: амперометрическое 57

Определение аминокислотного состава классическим методом Прибор соответствует «Золотому стандарту AAA» , принятому AOAC в качестве референсного метода для аминокислотного анализа и утвержденному Директивой 98/64/EC и 2000/45/EC Aracus (производства компании PMA Gmb. H, Германия) – автоматическая система для аминокислотного анализа с послеколоночной дериватизацией нингидрином 58

Определение аминокислотного состава классическим методом Анализ физиологически х жидкостей и гидролизатов с одной и той же колонке, с одним комплектом реагентов 59

Определение общего азота/белка Анализатор общего белка По Кьельдалю 1. Подготовка образца, взвешивание, измельчение, гомогенизация 2. Озоление серной кислотой в присутствии катализаторов 3. Отгонка аммиака 4. Титрование Итого: время анализа от 0. 5 до 2 часов 60

Определение общего азота/белка Элементный анализатор азота по методу Дюма Время анализа: 3 -5 минут (в зависимости от типа образца) Пробоподготовка: не требуется Учёт влажности: не требуется Воспроизводимость: <1% Опасные реактивы: не требуются Утверждён в мире: AOAC, ASBC, AACC, FGIS, CGL, DIN, EN, ISO, LUFA, MEBAK В России: МВИ аттестована 61 В 2011 г. будет принят ГОСТ Р

Конец части 5 Конец раздела 1 (ВЭЖХ) Вопросы?