ВЭЖХ и масс-спектрометрия Раздел 1 ВЭЖХ Часть

ВЭЖХ и масс-спектрометрия Раздел 1. ВЭЖХ

Часть 2 - Выбор неподвижной фазы. Современные тенденции в разработке сорбентов. - Общий подход к выбору подвижной фазы. - Основные свойства растворителей, применяемых в ВЭЖХ и их совместимость. - Оптимизация хроматографического разделения. 2

Классическая ЖХ vs. ВЭЖХ Классическая ЖХ ВЭЖХ Медленная и трудоемкая Быстрая Открытые стеклянные колонки большого диаметра Сбор каждой фракции и её off-line анализ Многоразовые запечатанные стальные колонки Непрерывное чувствительное детектирование Малый размер частиц, короткие колонки Высокое разрешение Частицы большого размера, длинные колонки Низкое разрешение 3

Типы сорбентов Объемнопористый сорбент Поверхностнопористый сорбент (пелликулярный) 4

Сорбенты для ЖХ Матрица: силикагель, оксид алюминия, полимеры собственные взаимодействия матрицы с сорбатом Привитые группы: Алкил (C 2, C 4, C 8, C 16, C 18…), арил (фенил), CN, NH 2, Diol. Размер частиц: 1. 7 -2. 2 μm, 3 μm, 5 μm, 10 μm, 12 -15 μm, 25 -40 μm… 5

Силикагель Наиболее широко используемый (исторически, легко производится, легко модифицируется, относительно инертен, стабилен в диапазоне p. H 3 -7) - Силикагель тип A (растворенный и переосажденный песок) - Силикагель тип B (из перегнанных летучих кремний- органических соединений) – свободен от переходных металлов >85% от общего количества сорбентов для ВЭЖХ в мире 6

Тип частиц силикагеля Неправильной формы - Тип A Сферический Тип A или B Монолитный Тип B 7

Монолитный силикагель Глобул ы Эффективность сорбента 3. 5 мкм, но минимальное давление Monolith ODS 50 x 4. 6 мм Ацетонитри л – вода (град. ) Поры 1 мл/мин; 118 (190) psi 3 мл/мин; 370 (590) psi 5 мл/мин; 660 (1030) psi 7 мл/мин; 820 (1340) psi 10 мл/мин; 1060 (1760) psi 8

Поры и поверхность силикагеля Чем больше размер пор, тем меньше площадь поверхности 9

Связывание силанольных групп Группы-радикалы: -CH 3 (C 1) -C 8 H 17 (C 8) -C 18 H 37 (C 18 – ODS) -CH 2 C 6 H 5 и CH(C 6 H 5)2 (фенил и бифенил) -(CH 2)3 NH 2 (амино) -(CH 2)3 CN (CN, нитрил) (CH 2)3 OCH 2 CH(OH)CH 2 OH (диол) -(CH 2)3 NR 3+ (SAX) -(CH 2)3 SO 3 - (SСX) 10

Защита поверхности (end capping) Триметилсилильная защита Гидрофильная защита 11

Защита поверхности (end capping) C 8 TMS Остаточные силанольные 2 8 мкмоль/м – доступно 4 мкмоль/м 2 – максимальное покрытие Около 50% остается незакрытыми 12

Защита поверхности (end capping) 13

Специальные силикагели BD или DB – base deactivated или deactivated base. Специально модифицированные силикагели для работы с осн. Овными компонентами (аминами), дающими хвостатые пики. SB – stable bond. Силикагель с защищенными группами прививки за матрицу. Более длительная устойчивость. PE – polar embedded (с полярной вставкой). Дает возможность работать с высоким содержанием воды. 14

Силикагель Сорбат растворим: -CN -NH 2 В полярных органических растворителях нормальнофазовый Выбор неподвижной фазы -C 8 -Phenyl -C 18 (-C 16) В гексане -CN обращеннофазовый -C 1 В воде -C 18 -C 8 -Phenyl Сорбат ионогенный -NH 2 -NR 3+ -SO 3 - ионообменный Сорбат неионогенный ионпарный -NH 2 15

Требования к растворителям - Высокая чистота (защита колонки и высокая чувствительность) - Отсутствие взвешенных частиц (специальная фильтрация) - Высокая УФ-прозрачность (для использования короткие длин волн детектирования) - Отсутствие консервантов (CHCl 3, Et. OH, ТГФ, диоксан…) - Для ОФ ВЭЖХ: вода, Me. OH, Me. CN, ТГФ, диоксан… - Для адсорбционной хроматографии: гептан, гексан, CHCl 3, Et. OAc, Et. OH… (часто требуют дополнительной сушки, например, с помощью молекулярных сит) 16

Свойства HPLC-grade растворителей Cutoff – граница прозрачности: длина волны, при которой оптическая плотность при длине оптического пути 1 см (канал сравнения – воздух) равна единице. 17

Границы прозрачности растворителей 18

Поглощение растворителей 19

Элюирующая сила и селективность растворителей Элюирующая сила – способность элюента вступать в такие межмолекулярные взаимодействия с системой, которые способствуют десорбции сорбата. Селективность элюента – способность к специфическим взаимодействиям с сорбатом. 20

Выбор растворителей для ОФ ВЭЖХ Цена: метанол дешевле ацетонитрила (ТГФ не используется в качестве главного ррителя) Прозрачность: ацетонитрил лучше Вязкость: ацетонитрильные смеси с водой менее вязкие 21

Вязкость растворителей Легко образуют водородные связи с водой 22

Вода для ВЭЖХ Не должна содержать органику и твердые частицы. Может быть HPLC-grade, перегнанная над перманганатом, очищена на RP-колонках или в RO -системах с дополнительной очисткой от органики. При добавлении в элюент буферов, солей, оснований, ион-парных реагентов всегда фильтруйте элюент перед использованием. 23

Загрязнение растворителей грязный удовлетворительн ый чистый Градиент метанола от 20 до 100%. 254 нм Невозможно из этих данных понять источник загрязнения – вода, метанол или оба 24

Дегазация растворителей Дегазация Me. OH Следить, чтобы не изменялся состав элюента при дегезации или барботировании. Барботирование гелия требуется при использовании длин волн <210 нм 25

Параметры оптимизации разделения - Колонка (неподвижная фаза) - p. H элюента, буфер - Тип и содержание органического растворителя (растворителей) - Температура колонки - Характер градиента - Ионная сила -… 26

Выбор p. H Обычно достаточно добавления 1% кислоты (или буфера) 27

Влияние p. H на удерживание кислоты и основания Точка перегиба на графике зависимости от p. H соответствует константе диссоциации 28

Влияние p. H на удерживание 50 p. H 6 30 m. AU Бензиламин p. H 5 p. H 4 p. H 3 40 Колонка C 8 силикагель Элюент: 35% ацетонитрил, фосатный буфер p. H 7 20 p. H 8 10 240 нм 0 0, 5 1, 0 1, 5 2, 0 2, 5 3, 0 3, 5 Время, мин Удерживание контролируется гидрофобными и катионообменными взаимодействиями 29

Влияние p. H на удерживание Никотин (p. Ka 6. 16) Cалициловая кислота (p. Ka 2. 96) ODS (DB) 4 x 250 мм Элюент: 40% Me. OH, 67 м. М цитратный буфер (1. 5 мл/мин) 240 нм 30

Влияние температуры на разделение Температура влияет на растворимость и коэффициент распределения Повышение температуры обычно увеличивает эффективность разделения (уменьшая вязкость) Лучше использовать чуть повышенную температура для лучшей воспроизводимости 31

Состав элюента Начинайте с сильного элюента, уменьшая его силу 32

От двойного элюента к тройному комбинации: Me. OH, Me. CN, вода, диоксана, ИПС… 33

Градиент Если на хроматограмме присутствует свободное место, добавьте градиент, например, шаговый 34

Градиент Если на хроматограмме присутствует свободное место, 35 добавьте градиент, например, шаговый

Формы градиента 36

Размер колонки Использование более короткой колонки для ускорения анализа 37

Растворитель для пробы – проба растворена в Me. OH – те же компоненты в элюенте 38

Растворитель для пробы Элюент: 8% Me. CN Колонка: ODS, 4. 6 x 250 мм Сорбат: фенилаланин 39

Растворитель для пробы в градиенте 3 1 1 0 5 3 4 3 2 Растворено в ацетонитриле 5 4 6 2 2 1 6 3 4 3 1 1 5 2 2 1 0 4 2 4 Растворено в смеси вода-ацетонитрил 50: 50 6 3 4 Растворено в смеси вода-ацетонитрил 70: 30 40

Конец второй части Вопросы?