Транскрипция Резяпкин Виктор

Транскрипция Резяпкин Виктор Ильич доцент кафедры биохимии v. rezyapkin@grsu. by

• В результате транскрипции происходит матричный синтез РНК • В результате транскрипции образуются и. РНК, т. РНК, р. РНК и др. РНК. • Катализирует синтез РНК фермент РНК-полимераза • Транскрибируемый участок ДНК ограничен со стороны 3’-конца промотором – участком с которым связывается РНК-полимераза, со стороны 5’-конца – терминатором – участком, в котором прерывается синтез РНК • Последовательность ДНК, ограниченная промотором и терминатором, представляет собой единицу транскрипции – транскриптон

• В состав транскриптона эукариот, как правило, входит один ген, прокариот – несколько генов • Транскриптон прокариот называют также опероном

• РНК-полимераза в качестве субстратов для синтеза РНК использует рибонуклеозид-5’-фосфаты (АТФ, ГТФ, ЦТФ и УТФ). • РНК-полимераза удлиняет цепь, присоединяя нуклеотиды к 3’-концу, т. е. наращивает цепь в направлении 5’ 3’. • РНК-полимераза требует для своей работы в качестве матрицы одну из цепей ДНК. • РНК-полимераза не нуждается в затравке. • Удлинение цепи РНК описывается уравнением:

• РНК-полимераза последовательно добавляет нуклеотиды к 3’ – концу полинуклеотидной цепи

• Нуклеотиды в процессе транскрипции присоединяются к цепи в соответствии с принципом комплементарности. • Т. о. , образовавшаяся в результате транскрипции РНК комплементарна матричной цепи ДНК

• В процессе транскрипции выделяют три стадии: инициацию, элонгацию и терминацию. • На стадии инициации РНК-полимераза, взаимодействуя с промотором, вызывает расхождение цепей ДНК и начинает синтез молекулы РНК. • В ходе элонгации новосинтезированная цепь РНК образует короткие отрезки гибридной двойной спирали ДНК-РНК, которые необходимы для правильного считывания цепи ДНК. • Как только РНК-полимераза достигнет терминирующих последовательностей, запускается последняя стадия – терминация. • По ее завершению происходит освобождение вновь синтезированной цепи РНК).

Транскрипция прокариот Прокариоты содержат одну РНК-полимеразу. Ее субъединичный состав - a 2 bb’s. s -субъединица необходима для узнавания промотора После инициации s-субъединица отделяется Элонгацию осуществляет комплекс a 2 bb’ (кор-фермент) s -субъединицы различаются в зависимости от того, какую группу промоторов должна узнавать РНК- полимераза.

• Как правило s-факторы узнаются блоки, отстоящие на 10 и 35 нуклеотидов от точки начала транскрипции

s -35 -10 • Различные E. coli s 70 TTGACA TATAAT s -факторы отвечают за E. coli s 32 TCTC-CCCTTGAA CCCCAT-TA узнавание различных E. coli s 54 (-24)CTGG-A (-12)TTGCA классов промоторов B. sub s. A TTGACA TATAAT B. sub s. B AGGTTTAA GGGTAT B. sub s. D CTAAA CCGATAT B. sub s. E ATATT ATACA B. sub s. K AC CATA- - -T B. sub s. H CAGGA GAATT-T

• Механизм инициации включает : • образование «закрытого» комплекса (без расплетения цепей ДНК) • образование «открытого» комплекса (с локальным расплетением ДНК) • синтез коротких РНК (без диссоциации s-фактора) • После того, как синтезируется фрагмент РНК более 9 нуклеотидов, s -фактор необратимо диссоциирует и транскрипция вступает в стадию элонгации.

Элонгация • Кор-фермен способен перемещаться по ДНК со скоростью до 50 нуклеотидов в секунду • Кор-фермент при прохождении определенных сигналов терминации завершает синтез ДНК.

Терминация транскрипции прокариот Существует два типа терминаторов: r-зависимые терминаторы и r-независимые терминаторы r-Независимая терминация обеспечивается образованием РНК шпильки в процессе транскрипции и последующей олигоуридиловой последовательностью Шпилька приводит к паузе в транскрипции, а олигоуридил-олигоадениловый дуплекс, как наименее стабильный, диссоциирует в ходе паузы

r-Зависимая терминация • На последовательности РНК присутствует участок, служащий местом посадки r-фактора • Сам r-фактор представляет собой гексамерную НТФазу, способную использовать энергию гидролиза НТФ для продвижения по РНК в сторону ее 3’-конца • Когда r-фактор “догоняет” работающую РНК- полимеразу, происходит терминация

Регуляция транскрипции Транскрипция может регулироваться на стадии инициации, элонгации и терминации • Наиболее часто транскрипция регулируется на стадии инициации транскрипции • Активность многих промоторов регулируется с помощью особых белков-регуляторов

Факторы, участвующие в регуляции транскрипции на стадии инициации

• Негативная регуляция – белок - репрессор, взаимодействуя с ДНК, снижает активность РНК- полимеразы. Участок связывания ДНК с репрессором называется оператором • Эффекторы – низкомолекулярные вещества – влияют на сродство репрессора к оператору Эффекторы, снижающие сродство репрессора к оператору, называются индукторами Эффекторы, увеличивающие сродство репрессора к оператору, называются корепрессорами • Белки-активаторы – усиливают активность РНК- полимераз, таким образом осуществляют позитивную регуляцию • Некоторые белки могут выступать в одних случаях в качестве репрессора, в других – в качестве активатора

• Инициация транскрипции может регулироваться в результате изменения количества и активности различных s-факторов в клетке • Таким способом регулируется метаболизм азота • При недостатке азота происходит фосфорилирование белка Ntr. C • фосфорилированный белок Ntr. C взаимодействует с комплексом РНК-полимеразы и s 54. • Происходит активация транскрипции генов, необходимых для восстановления азотного баланса

Lac-оперон E. coli • Оперон кодирует белки катаболизма лактозы, менее предпочтительного по сравнению с глюкозой источника энергии. • Транскрипция lac-оперона происходит только, если в среде отсутствует глюкоза и присутствует лактоза • В состав оперона входят: 1. три гена, кодирующих белки, участвующих в метаболизме лактозы: β-галактозидазу (гидролизует лактозу), пермеазу (ответственна за транспорт галактозы в клетку), белок А (β- галактозидтрансацетилаза - функция до конца не выяснена) 2. Промотор (40 п. н. ) 3. Оператор (27 п. н. ) 4. Область связывания белка САР*ц. АМФ (38 п. н. )

В среде отсутствует лактоза и присутствует глюкоза • Ген репрессора транскрибируется • Синтезируется репрессор • Репрессор взаимодействует с оператором и препятствует РНК-полимеразе – начать транскрипцию структурных генов

В среде присутствует лактоза и отсутствует глюкоза • Лактоза взаимодействует с репрессором • Комплекс репрессор-лактоза теряет сродство к оператору и покидает его • При недостатке глюкозы в клетке начинает накапливается ц. АМФ, • ц. АМФ связываеися с белком CAP • Комплекс CAP*ц. АМФ связывается с определенным участком ДНК. • Связывание CAP*ц. АМФ включает транскрипцию лактозного оперона. • Транскрипция lac-оперона происходит только если в среде отсутствует глюкоза и присутствует лактоза

В среде присутствует лактоза и присутствует глюкоза • Оператор не связан с репрессором • РНК-полимераза не может начать синтез РНК, так как в клетке концентрация ц. АМФ недостаточна для образования комплекса CAP*ц. АМФ

Триптофановый оперон • Триптофановый оперон содержит 5 генов, ответственных за синтез триптофана промотор оператор

Содержание триптофаны в клетке высокое • Триптофан образует комплекс с репрессором • Комплекс взаимодействует с оператором • РНК-полимераза не может начать синтез РНК

Содержание триптофаны в клетке снизилось • Комплекс триптофан-репрессор диссоциирует • РНК-полимераза начинает транскрипцию структурных генов

Регуляция транскрипции на уровне элонгации Аттенюация Регуляция триптофанового оперона может осуществляться благодаря наличию в нем аттенюаторной последовательности (аттенюатора). Эта последовательность входит в состав лидерной области, в которой закодирован также лидерный пептид). Лидерный пептид в 10 и 11 положениях содержит два остатка триптофана

• Транскрипция триптофанового оперона E. coli происходит, когда концентрация триптофана в клетке мала • Трансляция лидерного участка м. РНК сопряжена с транскрипцией • Если рибосома быстро транслирует лидерный участок м. РНК (при высоких концентраций триптофана), то формируется структура, способствующая преждевременной терминации транскрипции. • Если рибосома медленно транслирует лидерный участок м. РНК (при низких концентраций триптофана), то формируется структура, способствующая продолжению транскрипции • В результате синтезируется м. РНК, при трансляции которой образуются белки, ответственные за синтез триптофана

Регуляция на уровне терминации • Антитерминация - прочитывание терминатора • Антитерминацию осуществляют белки- антитерминаторы • В результате антитерминации прочитываются гены, расположенные за терминатором

Регуляция транскрипции фага T 4 • Вместе с ДНК фага T 4 в клетку проникает белок, ADP- рибозилирующий альфа-субъединицу РНК-полимеразы. • Модификация препятствует взаимодействию РНК- полимеразы с промоторами клетки • Модифицированная РНК-полимераза узнает промоторы фага и транскрибирует ранние гены фага T 4 • Ранние гены отвечают за активацию средних генов и выключение промоторов клетки-хозяина. • При экспрессии средних генов бактериофаг вместо клеточного сигма-фактора использует белок gp 55, узнающий промоторы поздних генов.

Транскрипция эукариот РНК-полимеразы • В клетках эукариот присутствуют три РНК- полимеразы • РНК-полимераза I транскрибирует гены р. РНК 18 S, 28 S и 5, 8 S • РНК-полимераза II транскрибирует гены и. РНК • РНК-полимераза III транскрибирует гены т. РНК, 5 S р. РНК и мя. РНК

РНК-полимераза I • РНК-полимераза I эукариот является большим ферментом, построенным по меньшей мере из 11 субъединиц, транскрибирует гены р. РНК • Гены р. РНК представлены в геноме клетки большим числом копий • Гены р. РНК кодируют три наиболее крупных р. РНК – 18 S р. РНК, 5, 8 S и 28 S р. РНК • Рибосомные гены транскрибируются в ядрышках в виде единого 45 S-РНК транскрипта (13000 н) • 45 S-РНК расщепляется с образованием 28 S-РНК (около 5000 нуклеотидов), 18 S-РНК (около 2000 нуклеотидов) и 5, 8 S-РНК (около 160 нуклеотидов)

• 5 S р. РНК транскрибируется отдельно от других р. РНК-полимеразой III • Транскрипция генов р. РНК соответствует 30 - 40% от общего объема клеточной транскрипции • Гаплоидные клетки человека содержат около 200 генов р. РНК, которые распределены в виде небольших кластеров по пяти хромосомам • Гены р. РНК расположены в виде серии тандемных повторов, отделенных друг от друга спейсером • В конце спейсера находится сайт терминации (Т), он же отвечает и за реинициацию нового транскрипта • В спейсере имеются энхансеры (40 -60 п. н. ), активирующие транскрипцию в десятки раз • Степень активации пропорциональна числу энхансеров

РНК-полимераза II • РНК-полимераза II, транскрибирует гены, которые затем будут транслированы в белки • РНК-полимераза II содержит более 10 субъединиц • Но самостоятельно она не в состоянии осуществлять транскрипцию • Чтобы РНК полимераза могла транскрибировать ген, требуется взаимодействие около 40 - 50 белковых молекул – факторов транскрипции • В промоторе, узнаваемом РНК-полимеразой II, в пределах 100 -200 п. н. перед стартом транскрипции выявлены нуклеотидными последовательности ("мотивы"): TATA, CAAT, GC -блоки и др

• В разных промоторах могут встречаться разные элементы, в разных сочетаниях, на разных расстояниях от точки начала транскрипции (изображена стрелкой) и в различном порядке относительно друга • Организация промотора определяет особенности экспрессии гена Условная схема расположения промоторных элементов

РНК-полимераза II и дополнительные факторы транскрипционного комплекса

• Альфа-аманитин обладает необычно сильным сродством к РНК-полимеразе II. • РНК-полимераза I нечувствительна к нему, а РНК-полимераза III чувствительна слабо. • Попадая в клетку, аманитин связывает этот фермент, что приводит к прекращению синтеза белков и к разрушению клетки (цитолизу). • В человеческом организме при отравлении больше всего страдают клетки печени и почек.

Энхансеры и сайленсеры • Энхансеры и сайленсеры регулируют интенсивность экспрессии генов • Энхансеры – регуляторные последовательности ДНК, с которыми взаимодействуют белки- активаторы, в результате транскрипция генов многократно усиливается • Сайленсеры – регуляторные последовательности ДНК, с которыми взаимодействуют белки- ингибиторы, в результате транскрипция генов ослабевает

• В природе энхансеры могут занимать различное положение 1. Чаще перед геном за несколько сот п. н. и даже за несколько тысяч п. н. 2. Энхансеры обнаружены в интронах 3. Энхансеры встречаются за геном 4. Свойствами энхансера могут обладать кодирующие последовательности • Энхансеры можно переносить от одного гена к другому • Один ген может иметь несколько энхансеров

• Граница энхансера размыта – удаление нуклеотидных последовательностей постепенно снижает активность энхансера • Энхансеры могут содержать блоки, мутации в которых резко снижает их активность • Организация сайленсеров имеют много общего с организацией энхансеров • Энхансеры в зависимости от регуляторного фактора могут вести себя как сайленсоры

РНК-полимераза III • РНК полимераза III транскрибирует гены 5 S р. РНК, т. РНК и нескольких мя. РНК • Эти три класса генов используют свои собственные классы промоторов • Промотор РНК-полимеразы III находится внутри генов • Он состоит, в случае генов т. РНК, из двух блоков • Первый блок начинается через 8 -30 п. н. после точки инициации транскрипции и представлен в усредненном виде последовательностью TGGCNNAGTGG • • Усредненная последовательность для второго блока - (+51…+72) GGTTCGANNCC

• Ген 5 S р. РНК также содержит внутренний промотор • Гены, кодирующие мя. РНК, содержат регуляторные элементы, расположенные перед точкой инициации транскрипции. • У большинства генов этого класса регуляторные элементы состоят из ТАТА-последовательности с центром в положении -30 и из второго элемента с центром в положении -60

РНК-зависимый синтез РНК • Некоторые РНК-содержащие вирусы используют для репликация РНК-зависимую РНК-полимеразу • РНК-полимераза фага Qβ содержит 1 вирусспецифический белок, белок S 1 из малой субъединицы рибосомы (E. coli) и два фактора элонгации полипептидной цепи EF-Tu и EF-TS • Этот фермент может эффективно использовать в качестве матрицы РНК фага и некоторые родственные молекулы • При наличие затравки фермент может использовать любую молекулу РНК

Нематричный синтез РНК • Полинуклеотидполимераза – встречается у бактерий НДФ + (НМФ)n+1 + Фн • Ферменту необходимы 5’-НДФ • НТФ и д. НТФ фермент не может использовать • Фермент катализирует образование 3’-5’- фосфодиэфирных связей • Реакция легко обратима • Фермент не требует матрицы

• Полиаденилатполимераза • Обеспечивает синтез поли А на 3’-конце • В качестве субстрата использует АТФ и РНК • Матрица не нужна • Необходима РНК в качестве затравки • Фермент катализирует образование 3’-5’- фосфодиэфирных связей

Спасибо за внимание