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Struktur und Regulation von Proteinkomplexen Dr. Caroline C. Friedel Lehr- und Forschungseinheit Bioinformatik Institut Struktur und Regulation von Proteinkomplexen Dr. Caroline C. Friedel Lehr- und Forschungseinheit Bioinformatik Institut für Informatik LMU München

Motivation Paarweise Interaktionen Yeast two-hybrid, Co-IP, BRET Proteinkomplexe Affinitätspurifikation Regulation von Proteinkomplexen RNA Umsatz Motivation Paarweise Interaktionen Yeast two-hybrid, Co-IP, BRET Proteinkomplexe Affinitätspurifikation Regulation von Proteinkomplexen RNA Umsatz (Halbwertszeit) Friedel & Zimmer, 2006 von Brunn et al. , 2007 Friedel & Zimmer, 2007 Fossum et al. , 2009 Friedel et al. , 2008 Friedel & Zimmer, 2008 Krumsiek et al. , 2009 Friedel & Zimmer, 2009 Dölken et al. , 2008 Friedel et al. , 2009 Friedel & Dölken, 2009 Microarrays / RNA-seq Caroline C. Friedel, LFE Bioinformatik, Institut für Informatik, LMU München 2

Motivation Proteinkomplexe Affinitätspurifikation Regulation von Proteinkomplexen RNA Umsatz (Halbwertszeit) Microarrays / RNA-seq Caroline C. Motivation Proteinkomplexe Affinitätspurifikation Regulation von Proteinkomplexen RNA Umsatz (Halbwertszeit) Microarrays / RNA-seq Caroline C. Friedel, LFE Bioinformatik, Institut für Informatik, LMU München 3

Proteinkomplexe Caroline C. Friedel, LFE Bioinformatik, Institut für Informatik, LMU München 4 Proteinkomplexe Caroline C. Friedel, LFE Bioinformatik, Institut für Informatik, LMU München 4

Identifikation von Proteinkomplexen • Proteinkomplexe sind wichtig für alle zellulären Prozesse • Können vorhergesagt Identifikation von Proteinkomplexen • Proteinkomplexe sind wichtig für alle zellulären Prozesse • Können vorhergesagt werden aus Netzwerken von paarweisen Interaktionen (z. B. bestimmt mit Y 2 H) • Affinitätspurifikation ermöglicht die direkte Purifikation von Proteinkomplexen • Probleme: – Unspezifische Bindungen – Fehlende Interaktionen – Große Datenmengen Caroline C. Friedel, LFE Bioinformatik, Institut für Informatik, LMU München Bait Komplex Preys Vorhersage 5

Vorhersage von Komplexen 2 unabhängige Genom-weite Screens für Hefe: – Gavin et al. + Vorhersage von Komplexen 2 unabhängige Genom-weite Screens für Hefe: – Gavin et al. + Krogan et al. (2006) Purifikationen • Wenig Übereinstimmung zwischen ursprünglichen Vorhersagen • Verbesserte Methoden angewendet auf kombinierte Daten Beschränkung auf konfidente Interaktionen • • Bekannte Komplexe notwendig als Trainingsdaten • Daten über Proteinkomplexe nur begrenzt vorhanden Caroline C. Friedel, LFE Bioinformatik, Institut für Informatik, LMU München Berechnung von Interaktionsgewichten Netzwerkclustering Identifikation von überlappenden Komplexe 6

Bootstrap Algorithmus • Unsupervised Vorhersagealgorithmus • Beobachtung: – Manche Proteine nie als Baits verwendet Bootstrap Algorithmus • Unsupervised Vorhersagealgorithmus • Beobachtung: – Manche Proteine nie als Baits verwendet – Manche Baits mehrmals • Frage: Wie stabil sind Interaktionen und Komplexe unter Perturbationen der Daten? Verwende Bootstrap Sampling um die Stabilität von Interaktionen und Komplexen zu bewerten Friedel et al. J Comput Biol. 16(8): 971 -87, 2009 Caroline C. Friedel, LFE Bioinformatik, Institut für Informatik, LMU München 7

Kombinierte Purifikationen Bootstrap sampling Ziehen mit Zurücklegen, 1, 000 Replikate Komplex Identifikation Bootstrap Netzwerk Kombinierte Purifikationen Bootstrap sampling Ziehen mit Zurücklegen, 1, 000 Replikate Komplex Identifikation Bootstrap Netzwerk Verbinde Proteine die in mindestens einem Sample im selben Komplex sind Kantengewicht = Anteil der Samples in denen sie verbunden sind Komplex Identifikation Vollständig unsupervised Caroline C. Friedel, LFE Bioinformatik, Institut für Informatik, LMU München 8

Results • Angewendet auf kombinierte Gavin und Krogan Daten • Bootstrap Netzwerk mit 62, Results • Angewendet auf kombinierte Gavin und Krogan Daten • Bootstrap Netzwerk mit 62, 876 Interaktionen – Höhere Vorhersagegenauigkeit als alle anderen bisher publizierten Methoden • Vorhersage von Komplexen: – Verschiedene Konfidenzlevels – Mittlere Konfidenz: 409 Komplexe (BT-409) Proteinkomplexe können mit hoher Genauigkeit • Vergleichbare Qualität zu besten supervised Ansätze nur aus Purifikationsdaten vorhergesagt werden – Ähnlichkeit der Funktionen und Lokalisationen in Komplexen – Vorhersagegenauigkeit von bekannten Komplexen Caroline C. Friedel, LFE Bioinformatik, Institut für Informatik, LMU München 9

Vorhersage der Komplexstruktur • Vorhersage von Proteinkomplexen als Mengen von Proteinen – Direkte physikalischen Vorhersage der Komplexstruktur • Vorhersage von Proteinkomplexen als Mengen von Proteinen – Direkte physikalischen Interaktionen unbekannt – Interne Struktur wird ignoriert • Die meisten Komplexvorhersagemethoden berechnen Interaktionsgewichte als Zwischenschritt • Vorhersage von direkten Interaktionen (Scaffold) aus den Interaktionsgewichten Caroline C. Friedel, LFE Bioinformatik, Institut für Informatik, LMU München 13

Mehr als nur Komplexe … Vorhersage der physikalischen Interaktionen basierend nur auf Purifikationsdaten Friedel Mehr als nur Komplexe … Vorhersage der physikalischen Interaktionen basierend nur auf Purifikationsdaten Friedel & Zimmer. Bioinformatics. 15; 25(16): 2140 -6, 2009. Caroline C. Friedel, LFE Bioinformatik, Institut für Informatik, LMU München 14

Der Scaffold • Idee: – Finde die minimale Menge von Interaktionen – mit maximaler Der Scaffold • Idee: – Finde die minimale Menge von Interaktionen – mit maximaler Summe der Gewichte – so dass der Komplex verbunden ist ═ Maximaler Spannbaum (Maximum Spanning Tree) • MST ist nicht eindeutig • Scaffold = Vereinigung aller MSTs Friedel & Zimmer. Bioinformatics. 15; 25(16): 2140 -6, 2009. Caroline C. Friedel, LFE Bioinformatik, Institut für Informatik, LMU München 15

MST Netzwerk • Baum-artige Struktur • Stark vereinfacht • Viele Interaktionen fehlen Erweitere das MST Netzwerk • Baum-artige Struktur • Stark vereinfacht • Viele Interaktionen fehlen Erweitere das MST Netzwerk um Interaktionen, die nicht durch alternative indirekte Interaktionen erklärt werden Friedel & Zimmer. Bioinformatics. 15; 25(16): 2140 -6, 2009. Caroline C. Friedel, LFE Bioinformatik, Institut für Informatik, LMU München 16

Erweiterung • Annahme: – Kantengewichte sind als Konfidenzwerte gegeben [0: 1] – Können als Erweiterung • Annahme: – Kantengewichte sind als Konfidenzwerte gegeben [0: 1] – Können als Wahrscheinlichkeiten interpretiert werden • Algorithmus: – Berechne MST Netzwerk – Sortiere übrige Kanten nach Gewicht – Für jede Kante e in absteigender Sortierung § Finde optimalen Pfad P im aktuellen Netzwerk (Dijkstra) § Falls p(e) >= p(P) Füge die Kante zum aktuellen Netzwerk hinzu Friedel & Zimmer. Bioinformatics. 15; 25(16): 2140 -6, 2009. Caroline C. Friedel, LFE Bioinformatik, Institut für Informatik, LMU München 17

Results • Angewendet auf Bootstrap Komplexe and Konfidenzwerte – etwa 63, 000 Interaktionen insgesamt Results • Angewendet auf Bootstrap Komplexe and Konfidenzwerte – etwa 63, 000 Interaktionen insgesamt – 9, 918 Interaktionen innerhalb von Komplexen – MST Ansatz: 1, 658 Interaktionen – Erweiteter MST Ansatz: 3, 085 Interaktionen • Auswertung – Testset: § Experimentell bestimmte direkte Interaktionen (Y 2 H) – Performanzkriterium: § TPR/FPR = True Positiv Rate/False Positive Rate – Ranking der Methoden kann mit hoher Konfidenz bestimmt werden trotz Meßfehlern Friedel & Zimmer. Bioinformatics. 15; 25(16): 2140 -6, 2009. Caroline C. Friedel, LFE Bioinformatik, Institut für Informatik, LMU München 18

Vergleich zu anderen Ansätzen BVH: Bernard et al. RECOMB 2007 Friedel & Zimmer. Bioinformatics. Vergleich zu anderen Ansätzen BVH: Bernard et al. RECOMB 2007 Friedel & Zimmer. Bioinformatics. 15; 25(16): 2140 -6, 2009. Caroline C. Friedel, LFE Bioinformatik, Institut für Informatik, LMU München 19

Vergleich für verschiedene Referenzdaten Friedel & Zimmer. Bioinformatics. 15; 25(16): 2140 -6, 2009. Caroline Vergleich für verschiedene Referenzdaten Friedel & Zimmer. Bioinformatics. 15; 25(16): 2140 -6, 2009. Caroline C. Friedel, LFE Bioinformatik, Institut für Informatik, LMU München 20

Bestimmung von Subkomplexen Netzwerk der direkten Interaktionen kann nur aus den Purifikationsdaten bestimmt werden Bestimmung von Subkomplexen Netzwerk der direkten Interaktionen kann nur aus den Purifikationsdaten bestimmt werden Friedel & Zimmer. Bioinformatics. 15; 25(16): 2140 -6, 2009. Caroline C. Friedel, LFE Bioinformatik, Institut für Informatik, LMU München 21

RNA Halbwertszeiten Caroline C. Friedel, LFE Bioinformatik, Institut für Informatik, LMU München 26 RNA Halbwertszeiten Caroline C. Friedel, LFE Bioinformatik, Institut für Informatik, LMU München 26

RNA tagging Markierung von neu transkribierter RNA Vorher vorhandene, unmarkierte RNA Neu transkribierte, markierte RNA tagging Markierung von neu transkribierter RNA Vorher vorhandene, unmarkierte RNA Neu transkribierte, markierte RNA Gleichzeitige Messung von RNA de novo Transkription Abbau und. Quantifizierung mit Microarrays (oder RNA-seq) Caroline C. Friedel, LFE Bioinformatik, Institut für Informatik, LMU München Dölken et al. RNA 14: 1959 -72, 2008 Friedel & Dölken. Mol. Biosyst. 5: 1271 -8, 2009 27

Vorteile • Untersuche direkt Veränderungen in der Neusynthese – Erhöhte Sensitivität • Beobachtete Veränderungen Vorteile • Untersuche direkt Veränderungen in der Neusynthese – Erhöhte Sensitivität • Beobachtete Veränderungen relativ zur normalen Transkriptionsrate – Unabhängig von der RNA Halbwertszeit • Veränderungen in der Halbwertszeit können zeitnah sowohl für kurz- als auch langlebige Transkripte identifiziert werden – Zeitliche Entwicklung der Zellreaktion kann bestimmt werden • Veränderungen in der Transkription und im RNA Abbau können unterschieden werden Friedel & Dölken. Mol. Biosyst. 5: 1271 -8, 2009 Caroline C. Friedel, LFE Bioinformatik, Institut für Informatik, LMU München 30

Bestimmung von RNA Halbwertszeit • RNA Halbwertszeit ~ Geschwindigkeit des RNA Auf- und Abbaus Bestimmung von RNA Halbwertszeit • RNA Halbwertszeit ~ Geschwindigkeit des RNA Auf- und Abbaus • Früher identifiziert durch Transkriptionsinhibition und Beobachtung des RNA Abbaus • Zell invasiv • Stabilisierung von Transkripten Nicht-invasive Bestimmung aus dem Verhältnis von neu transkribierter / gesamt RNA Caroline C. Friedel, LFE Bioinformatik, Institut für Informatik, LMU München 31

Berechnung von RNA Halbwertszeit • RNA Halbwertszeiten bestimmt aus de novo Transkription genauer als Berechnung von RNA Halbwertszeit • RNA Halbwertszeiten bestimmt aus de novo Transkription genauer als aus RNA Abbau Caroline C. Friedel, LFE Bioinformatik, Institut für Informatik, LMU München De novo Transcription 34

Warum sind RNA Halbwertszeiten interessant ? • Bestimmen den Effekt auf gesamt RNA für Warum sind RNA Halbwertszeiten interessant ? • Bestimmen den Effekt auf gesamt RNA für eine spezifische Veränderung in de novo Transkription • Wie schnell können Gene transkriptionell reguliert werden ? – Schneller Abbau = Schnelle Regulation – Langsame Abbau = Langsame Regulation • Vorhersage der Art der Regulation für Gene – transkriptionell vs. post-transkriptionell Friedel et al. Nucleic Acids Res. 37: e 115, 2009 Caroline C. Friedel, LFE Bioinformatik, Institut für Informatik, LMU München 36

Beispiel: Hexokinasen Lange Halbwertszeit Hexokinase I ‘House-keeping’ Gen Hexokinase II Kurze Halbwertszeit Expression induziert Beispiel: Hexokinasen Lange Halbwertszeit Hexokinase I ‘House-keeping’ Gen Hexokinase II Kurze Halbwertszeit Expression induziert durch Insulin, Glucose, etc. Friedel et al. Nucleic Acids Res. 37: e 115, 2009 Caroline C. Friedel, LFE Bioinformatik, Institut für Informatik, LMU München 41

RNA Halbwertszeit in Proteinkomplexen • Ähnlichkeit von RNA Halbwertszeiten in Proteinkomplexen Ähnliche Regulation der RNA Halbwertszeit in Proteinkomplexen • Ähnlichkeit von RNA Halbwertszeiten in Proteinkomplexen Ähnliche Regulation der Untereinheiten • Aber signifikante Abweichungen sind möglich • ~100 Proteine in Mensch und Maus mit signifikant kürzerer RNA Halbwertszeit als die restlichen Untereinheiten • 28% der Beobachtungen im Mensch bestätigt für Maus • Konservierung der abweichenden Untereinheiten Friedel et al. Nucleic Acids Res. 37: e 115, 2009 Caroline C. Friedel, LFE Bioinformatik, Institut für Informatik, LMU München 42

Regulation von Proteinkomplexen • Regulation von Proteinkomplexen durch einzelne regulatorische Untereinheiten • Ermöglicht schnelle Regulation von Proteinkomplexen • Regulation von Proteinkomplexen durch einzelne regulatorische Untereinheiten • Ermöglicht schnelle und effiziente transkriptionelle Regulation • “Just-in-time assembly” (de Lichtenberg et al. Science 2005) Die Analyse von RNA Halbwertszeiten Substrat Gemein mit identifiziert konservierte regulatorische Erkennung BAF Komplex ACTL 6 A Prinzipien in Proteinkomplexen TCEB 2 8. 2 / 6. 3 CE 1 AR SM 5. 7 / 9. 2 SMARCC 1 SMARCA 4 11. 9 / 6. 1 5. 1/ 5. 8 PBRM 1 9. 0 / NA ARID 2 SMARCC 2 2. 3 / 1. 7 9. 7 / 5. 6 SMARCB 1 13. 3 / 13. 7 SMARCD 1 5. 4 / 3. 3 Spezifisch für PBAF Komplex 18. 5 / 16 TCEB 1 5. 8 / 8. 7 ASB 6 1. 0 / 0. 7 CUL 5 4. 5 / 2. 8 RNF 7 4. 5 / 4. 6 Ubiquitin Ligase 18. 5 / 16 TCEB 1 5. 8 / 8. 7 ASB 7 0. 3 / 1. 7 CUL 5 4. 5 / 2. 8 RNF 7 4. 5 / 4. 6 Friedel et al. Nucleic Acids Res. 37: e 115, 2009 Caroline C. Friedel, LFE Bioinformatik, Institut für Informatik, LMU München 43

Zusammenfassung Caroline C. Friedel, LFE Bioinformatik, Institut für Informatik, LMU München 44 Zusammenfassung Caroline C. Friedel, LFE Bioinformatik, Institut für Informatik, LMU München 44

Zusammenfassung • Proteinkomplexe – können nur aus Affinitätspurifikations-Daten identifiziert werden – keine zusätzlichen Trainings-Daten Zusammenfassung • Proteinkomplexe – können nur aus Affinitätspurifikations-Daten identifiziert werden – keine zusätzlichen Trainings-Daten notwendig – Vorhersagegenauigkeit vergleichbar mit besten supervised Ansätzen • Post-Prozessierung von vorhergesagten Proteinkomplexen: – identifiziert direkte physikalische Interaktionen – ermöglicht die Beschreibung der Komplexstruktur • RNA Halbwertszeiten – Ermöglichen die Vorhersage von transkriptioneller Regulation – Identifikation von konservierten regulatorischen Prinzipien in Proteinkomplexen – Regulation von Proteinkomplexen durch transkriptionelle Regulation von wichtigen regulatorischen Untereinheiten Caroline C. Friedel, LFE Bioinformatik, Institut für Informatik, LMU München 45

Projekte Protein-Protein Interaktionen • Analyse von Virus-host Interaktionen • Methoden für Experiment- design und Projekte Protein-Protein Interaktionen • Analyse von Virus-host Interaktionen • Methoden für Experiment- design und Auswertung Proteinkomplexe • Modellierung der Komplex- dynamik und -regulation • Kombination von Affinitätspurifikation mit RNA Halbwertszeiten • Verbesserung der Scaffoldvorhersage RNA tagging • Software für RNA Halbwertszeit- Berechnung (HALO) • RNA-seq zur Analyse von neu transkribierter RNA – Kooperation mit Applied Biosystems (SOLi. D) • Alternatives Splicing und RNA Abbau – DFG Antrag auf Sachbeihilfe • Mechanismen des RNA Abbaus – Einfluß von mi. RNAs • Vergleich von Protein and RNA Halbwertszeiten Caroline C. Friedel, LFE Bioinformatik, Institut für Informatik, LMU München 46

Kollaborationspartner Jürgen Haas Susanne Bailer Albrecht von Brunn Ekaterina Dall'Armi Even Fossum Theo Kraus Kollaborationspartner Jürgen Haas Susanne Bailer Albrecht von Brunn Ekaterina Dall'Armi Even Fossum Theo Kraus Lars Dölken Zsolt Ruzsics Ulrich Koszinowski Reinhard Hoffmann Manfred Koegl Peter Ghazal Paul Dickinson Thorsten Forster Ania Muntau Søren Gersting Mathias Woidy Kevin Robertson Steven Watterson Caroline C. Friedel, LFE Bioinformatik, Institut für Informatik, LMU München 47

Publikationen 2010 2009 2008 Florian Erhard, Caroline C. Friedel, Ralf Zimmer. FERN - Stochastic Publikationen 2010 2009 2008 Florian Erhard, Caroline C. Friedel, Ralf Zimmer. FERN - Stochastic Simulation and Evaluation of Reaction Networks. Sangdun Choi (ed. ): Systems Biology for Signaling Networks, Springer, 2010. Caroline C. Friedel, Ralf Zimmer. Identifying the topology of protein complexes from affinity purification assays. Bioinformatics 2009, 25: 2140 -6. Caroline C. Friedel, Jan Krumsiek, Ralf Zimmer. Bootstrapping the interactome: unsupervised identification of protein complexes in yeast. Journal of Computational Biology 2009, 16: 971 -87. Caroline C. Friedel, Lars Dölken, Zsolt Ruzsics, Ulrich Koszinowski, Ralf Zimmer. Conserved principles of mammalian transcriptional regulation revealed by RNA half-life. Nucleic Acids Research 2009, 37: e 115. Caroline C. Friedel, Lars Dölken. Metabolic tagging and purification of nascent RNA: Implications for transcriptomics. Molecular Bio. Systems, 2009, 5: 1271 -8. Even Fossum, Caroline C. Friedel, Seesandra V. Rajagopala, Björn Titz, Armin Baiker, Tina Schmidt, Theo Kraus, Thorsten Stellberger, Christiane Rutenberg, Silpa Suthram, Sourav Bandyopadhyay, Dietlinde Rose, Albrecht von Brunn, Mareike Uhlmann, Christine Zeretzke, Yu -An Dong, Hélène Boulet, Manfred Koegl, Susanne M. Bailer, Ulrich Koszinowski, Trey Ideker, Peter Uetz, Ralf Zimmer, Jürgen Haas. Evolutionarily conserved herpesviral protein interaction networks. Plo. S Pathogens 2009, 5: e 1000570. Florian Erhard, Caroline C. Friedel, Ralf Zimmer. FERN - A Java framework for stochastic simulation and evaluation of reaction networks. BMC Bioinformatics 2008, 9: 356. Jan Krumsiek, Caroline C. Friedel, Ralf Zimmer. Pro. Cope - Protein complex prediction and evaluation. Bioinformatics 2008, 24: 2115 -6. Lars Dölken, Zsolt Ruzsics, Bernd Rädle, Caroline C. Friedel, Ralf Zimmer, Jörg Mages, Reinhard Hoffmann, Paul Dickinson, Thorsten Forster, Peter Ghazal, Ulrich H. Koszinowski. High resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis, abundance and decay. RNA 2008, 14: 1959 -72. Caroline C. Friedel, LFE Bioinformatik, Institut für Informatik, LMU München 48

Publikationen 2008 2007 2006 2005 Caroline C. Friedel, Jan Krumsiek, Ralf Zimmer. Bootstrapping the Publikationen 2008 2007 2006 2005 Caroline C. Friedel, Jan Krumsiek, Ralf Zimmer. Bootstrapping the interactome: unsupervised identification of protein complexes in yeast. Proceedings of the 12 th International Conference on Research in Computational Biology (RECOMB) 2008, LNBI 4955, pp. 3 -16. Caroline C. Friedel, Ralf Zimmer. Identifying the topology of protein complexes from affinity purification assays. Proceedings of the German Conference on Bioinformatics (GCB) 2008, p. 30‑ 43 Caroline C. Friedel, Ralf Zimmer. Influence of degree correlations on network structure and stability in protein-protein interaction networks. BMC Bioinformatics 2007, 8: 297. Albrecht von Brunn, Carola Teepe, Jeremy C. Simpson, Rainer Pepperkok, Caroline C. Friedel, Ralf Zimmer, Rhonda Roberts, Ralph Baric and Jürgen Haas. Analysis of intraviral protein interactions of the SARS coronavirus ORFeome. PLo. S ONE 2007, 2: e 459. Caroline C. Friedel, Ralf Zimmer. Toward the complete interactome. Nature Biotechnology 2006, 24: 614 -615. Caroline C. Friedel, Ralf Zimmer. Inferring topology from clustering coefficients in protein-protein interaction networks. BMC Bioinformatics 2006, 7: 519. Chad A. Davis, Fabian Gerick, Volker Hintermair, Caroline C. Friedel, Katrin Fundel, Robert Küffner, Ralf Zimmer. Reliable gene signatures for microarray classification: assessment of stability and performance. Bioinformatics 2006, 22: 2356 -2363. Caroline C. Friedel, Ulrich Rückert, Stefan Kramer. Cost curves for abstaining classifiers. Proceedings of the third Workshop on ROC Analysis in Machine Learning, Pittsburgh, USA, 2006. Caroline C. Friedel, Katharina Jahn, Selina Sommer, Stephen Rudd, Hans W. Mewes, Igor V. Tetko. Support vector machines for separation of mixed plant-pathogen EST collections based on codon usage. Bioinfomatics 2005, 21: 1383 -1388. Caroline C. Friedel, LFE Bioinformatik, Institut für Informatik, LMU München 49

Danke für die Aufmerksamkeit Fragen ? Caroline C. Friedel, LFE Bioinformatik, Institut für Informatik, Danke für die Aufmerksamkeit Fragen ? Caroline C. Friedel, LFE Bioinformatik, Institut für Informatik, LMU München 50