СХА Серологич. методы диагностики 1.ppt
- Количество слайдов: 41
СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ Сбитнева Н. Н. 2012 г.
В основе всех серологических методов диагностики лежит специфическая реакция между АГ и АТ В общем виде реакция антиген-антитело может быть описана простой схемой: [AT]+[АГ]↔[АТАГ]
Антигены и иммуногены (от antigen = antibodygenerating, «производитель антител» ) — это генетически чужеродные вещества (белки или полисахаридs)? представляющие собой части бактериальных клеток, вирусов и других микроорганизмов.
Антигены бактерий
Антитела (АТ) относят к различным классам иммуноглобулинов — это растворимые гликопротеины, присутствующие в сыворотке крови, тканевой жидкости или на клеточной мембране, которые распознают и связывают антигены (АГ). Против АГ макроорганизм начинает вырабатывать собственные антитела — этот процесс называется иммунным ответом. В настоящее время известно, что иммунная система состоит не только из антител. Под иммуногенами понимают все соединения, которые могут быть распознаны адаптивной иммунной системой. Иммуногены — это вещества, которые вызывают ответ иммунной системы, в то время как антигены связываются с соответствующими антителами.
Серодиагностика инфекционных заболеваний животных Определение специфических АТ Исследование парных проб крови на наличие специфических АТ методы: Ø РТГА Ø РНГА (РПГА) Ø РСК Ø РДПА и ВИЭФ
РЕАКЦИЯ ДИФФУЗНОЙ ПРЕЦИПИТАЦИИ В АГАРЕ
РЕАКЦИЯ ДИФФУЗНОЙ ПРЕЦИПИТАЦИИ В АГАРЕ
Люминесцентная микроскопия МЕТОД ФЛЮОРЕСЦИРУЮЩИХ АНТИТЕЛ Люминесцентная микрофотография зоны локализации вирусного антигена обладают зеленоватым свечением
АГГЛЮТИНАЦИОННЫЕ ТЕСТЫ Сбитнева Н. Н. 2012 г.
РЕАКЦИЯ гемагглютинации (РГА) — является методом детекции (выявления) и идентификации (определения) вирусов. Метод основан на способности некоторых белков (АГ) выборочно агглютинировать эритроциты. Под реакцией гемагглютинации также подразумевают воздействие различных агентов на эритроциты, посредством которых они склеиваются.
ГЕМАГГЛЮТИНАЦИЯ (ГА) может быть активная и пассивная. Ø Под активной ГА понимают способность эритроцитов к склеиванию при действии на них вирусов, бактерий, продуктов обмена бактерий, экстрактов трав, змеиных ядов и т. д. Ø Прямая гемагглютинация не является специфичной.
Скорость и проявление РГА напрямую зависит от: количества эритроцитов, вида эритроцитов ( животные – доноры эритроцитов) концентрации АГ (АТ), температуры, ионной сила раствора, РГА происходит в том случае, когда силы связывания превосходят силы отталкивания. Силы отталкивания обусловлены отрицательным зарядом клеточной поверхности эритроцитов.
РГА Ø Используют для выявления группы агглютинирующих вирусов. Ø Определение титра этих вирусов. Ø Титр вирусов выражают в гемагглютини-рующих единицах (ГАЕ). Ø За 1 ГАЕ принимают дозу вируса, способную агглютинировать 50% эритроцитов, которые содержатся в том же, что и вирус объеме 1% суспензии эритроцитов.
Учет результатов РГА o+++ - Все эритроциты агглютинированы и образовали «зонтик» . o ++ - основная масса эритроцитов (50%) агглютинирована и образует «зонтик» , но часть эритроцитов осели в центре лунки в виде небольшой «пуговки» . o + - основная часть эритроцитов осели на дно лунки в виде «пуговки» с небольшой каймой агглютинированных эритроцитов. o- - Все эритроциты осели на дно лунки в виде «пуговки» .
Схема проведения РГА Этапы выполнения РГА № лунок 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Разведение вируса 1: 2 1: 4 1: 8 1: 16 1: 32 1: 64 1: 128 1: 256 1: 512 1: 1024 Физ. р-р (мл) 0, 5 0, 5 0, 5 Контроль эритоцитов Вируссодер. материал (мл) 1% суспензия эритроцитов (мл) * Последовательный перенос по 0, 5 0, 5 Экспозиция (мин. t С) Результат 0, 5 0, 5 30 -40 мин. при комнатной температуре +++ +++ +++ ++ +/- - - Примечание: из последней лунки 0, 5 мл вируссодержащей жидкости удаляют в дезинфицирующий раствор.
Трактовка РГА (табл) Так, 1 ГАЕ определена в лунке с разведением 1: 128. Значит в исходном материале содержться 128 ГАЕ вируса.
Реакция гемагглютинации (РГА) и реакция торможения гемагглютинации (РТГА)
Реакция торможения (задержки) гемагглютинации (РТГА, РТЗА) основана на феномене предотвращения (торможении) иммунной сыворотки гемагглютинации эритроцитов вирусами. При встрече с гомологичным вирусом (АГ) сыворотка нейтрализует не только его инфекционность, но и гемагглютинирующую активность, т. к образует комплекс АГ-АТ, блокируя рецепторы вирионов, ответственных за агглютинацию.
РТГА позволяет решать следующие задачи: идентифицировать вирусы с применением известных (референс) сывороток, ü устанавливать степень родства вирусов, ü определять титр специфических антител с целью мониторинга за течением заболевания, оценки качества проводимого лечения, оценки поствакцинального иммунитета. ü РТГА является важным методом серодиагностики вирусных инфекций, возбудители которых обладают гемагглютинирующими свойствами.
Схема проведения РТГА Этапы выполнения РГА № лунок 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Разведение вируса 1: 2 1: 4 1: 8 1: 16 1: 32 1: 64 1: 128 1: 256 1: 512 1: 1024 Физ. р-р (мл) 0, 2 0, 2 0, 2 Сыворотка (мл) Вирус Т= 4 ГАЕ Последовательный перенос по 0, 2 0, 2 Контакт вируса с сывороткой 1% суспензия эритроцитов (мл) 0, 2 40 -60 мин. при комнатной температуре 0, 4 Экспозиция (мин. t С) Результат 0, 2 0, 4 0, 4 +++ 30 -40 мин. при комнатной температуре - - - ++ +++ Примечание: из последней лунки 0, 2 мл с ыворотки удаляют в дезинфицирующий раствор.
Контроли РТГА Компоненты РТГА Контроль сыворотки эритроцитов ГАЕ вирусов 2 Физ. р-р (мл) Сыворотка (мл) 1/2 1/4 0, 4 0, 4 - 0, 2 1 - - - 0, 4 0, 2 Вирус Т=4 ГАЕ (мл) - Контакт вируса с сывороткой Эритроциты 1% (мл) 40 -60 мин. при комнатной температуре 0, 4 Экспозиция (мин. t С) Результат Перенос по 0, 4 * 0, 4 0, 4 - - 30 -40 мин. при комнатной температуре - - +++ Примечание: из последней лунки 0, 4 мл вируса удаляют в дезинфицирующий раствор. ++
Трактовка РТГА (табл 2) Так, максимальное разведение сыворотки, способной тормозить гепагглютинацию является 1: 32. Значит титр антител - Т= 1: 32.
Факторы, влияющие на результатов РТГА На точность определения титра АТ влияет: Ø кратность разведения сыворотки (чем меньше – тем точнее). Ø Концентрация вируса (чем выше ГАЕ, тем ниже титр АТ) Ø Наличия термостабильных ингибиторов (необходима предобработка сывороток каолином, активированным углем и др. )
Модификации РТГА Важно знать, что АТ и АГ всегда взаимодействуют в строго определенных соотношениях. В РТГА всегда один из компонентов известен, а другой – нет. Варианты РТГА: v используют одинаковую дозу вируса (АГ) и различные дозы АТ v используют одинаковую дозу АТ и различные дозы вируса (АГ).
ПАССИВНАЯ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИЯ Ø Пассивная ГА - способность эритроцитов, сенсибилизированных (нагруженных) АГ (или АТ), гглютинироваться в присутствии специфических АТ (или АГ). Ø Пассивная гемагглютинация (РПГА или РНГА) широко применяется для диагностирования возбудителей инфекционных заболеваний вирусной этиологии.
Реакция гемагглютинации (РГА) и реакция торможения гемагглютинации (РТГА)
РЕАКЦИЯ НЕПРЯМОЙ (ПАССИВНОЙ) ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ
Антигенный эритроцитарный диагностикум Реакция непрямой (пассивной) агглютинации (РПГА)
РСК Опытная система: АНТИГЕН (Бактерия, клетка, вирус и т. д. ) КОМПЛЕМЕНТАНТИТЕЛО (сыворотка) Комплемент связался с комплексом антигенантитело Индикаторная гемолитическая система ЭРИТРОЦИТЫ БАРАНА (АНТИГЕН) ГЕМОЛИТИЧЕСКАЯ СЫВОРОТКА (АНТИТЕЛО) Комплемента нет - связался с опытной системой. Без комплемента гемолиз эритроцитов невозможен.
Реакция связывания комплемента (РСК) – принцип методв: a. b. c. при соответствии другу АГ и А образуют иммунный комплекс, к которому через Fc-фрагмент антител присоединяется комплемент (С), происходит связывание комплемента комплексом антиген - антитело. Если комплекс АГ-АТ не образуется, то комплемент остается свободным.
Реакция связывания комплемента a. PCK проводят в две фазы: - 1 -я фаза - инкубация смеси, содержащей АГ + АТ + К (комплемент), - 2 -я фаза (индикаторная) - выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемолитической системы. , состоящей из эритроцитов барана, и гемолитической сыворотки, содержащей антитела к ним. В 1 -й фазе реакции при образовании комплекса антиген - антитело происходит связывание им комплемента, и тогда во 2 -й фазе гемолиз сенсибилизированных антителами эритроцитов не произойдет (реакция положительная). Если антиген и антитело не соответствуют другу (в исследуемом образце нет антигена или антитела), комплемент остается свободным и во 2 -й фазе
РСК v. Если АГ и АТ не соответствуют другу , то: - комплемент остается свободным - во 2 -й фазе присоединится к комплексу эритроцит - антиэритроцитарное антитело, вызывая гемолиз (реакция отрицательная).
РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА (РСК) Схема РСК с сывороткой больного Схема РСК с сывороткой здорового
Результат РСК
Иммуноферментный анализ. ИФА появился в середине 60 -х годов и первоначально был разработан как: : -- - метод для идентификации АГ- в гистологическом препарате; - для визуализации линий преципитации в тесте иммунодифузии и иммуноэлектрофореза - для количественного определения АГ и АТ в биологических жидкостях. В разработке ИФА принимали участия Е. Энгвалл и Р. Пэлман, а также независимо от них В. Ван Вееман и Р. Шурс.
v ИФА применяют для выявления АГ и АТ: v Метод основан на специфическом связывании АТ с АГ, v один из компонентов конъюгирован с ферментом, v в результате реакции с соответствующим хромогенным субстратом образовывается окрашенный продукт, v количество окрашенного продукта можно определить спектрофотометрически (рис. 1). v Открытие возможности иммобилизации антигена и антитела на различных носителях с сохранением их связывающей активности позволило расширить использование ИФА в различных областях биологии
q Разнообразие объектов исследования (от низкомолекулярных соединений до вирусов и бактерий), q Широкий круг задач, обусловлен: o многообразием условий применения ИФА, o Большим количеством вариантов этого метода. Любой вариант ИФА содержит 3 обязательные стадии: 1. узнавания тестируемого соединения специфическим к нему антителом, с образованием иммунного комплекса; 2. формирования связи конъюгата с иммунным комплексом или со свободными местами связывания; 3. превращение ферментной метки в регистрируемый сигнал.
Принцип ИФА Рисунок 1. Основной принцып ИФА.
СХА Серологич. методы диагностики 1.ppt