РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ Резяпкин
РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ Резяпкин Виктор Ильич доцент кафедры биохимии v. rezyapkin@grsu. by
• Продукты генов нужны различным клеткам в разное время и в неодинаковых количествах. • Одни гены в определенный момент развития организма экспрессируются с высокой интенсивностью, другие гены могут находиться в репрессированном состоянии. • Экспрессия генов в клетке должна быть согласованной.
Регуляция экспрессии генов может осуществляться • на уровне организации ДНК • на уровне транскрипции • на уровне созревания РНК • на уровне деградации РНК • на уровне трансляции • на уровне посттрансляционных модификаций • на уровне деградации белка
РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ НА УРОВНЕ ОРГАНИЗАЦИИ ДНК • Активное и неактивное состояние гена может определятся уровнем компактизации ДНК • Гетерохроматин – компактный хроматин – транскрипционно неактивен • Эухроматин – деконденсированный хроматин – транскрипционно активен
Схема иллюстрирующая различные уровни организации ДНК Активность хроматина пропорциональна его компактности При активации хроматина происходит его деконденсация
Регуляция активности генов обусловленная метилированием ДНК • Метилирование ДНК осуществляется в результате обратимого метилирования цитозина
• Механизм действия метилтрансферазы
• Цитозин метилируется в том случае, если рядом с ним находится гуанин – ЦГ • После репликации метилированной ДНК образуется полуметилированная ДНК • ДНК-метилтрансфераза восстанавливает исходный рисунок метилирования
• Метилирование необходимо для нормального развития организма • Если инактивировать ген метилтрансферазы у мышей, то развитие эмбриона приостановится на ранних стадиях развития • Наличие метилцитозина опасно для организма, так как при его дезаминировании образуется тимин.
• В результате репликации в одной из двух дочерних молекул ДНК пара ЦГ заменится на ТА – произойдет мутация
• В геноме млекопитающих ЦГ пары образуют островки, которые чаще встречаются в районе промоторов, распространяясь в область начала гена • Метилирование промоторов препятствует образованию транскрипционного комплекса • Степень репрессии гена пропорциональна метилированию цитозинов.
• Красным показан цитозин • Синим – метилцитозин • Стрелкой – направление транскрипции
• В отдельных случаях метилирование может препятствовать связыванию репрессорного белка с сайленсером – это приведет к увеличению экспрессии гена
РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ НА УРОВНЕ ТРАНСКРИПЦИИ ПРОКАРИОТЫ Транскрипция у прокариот может регулироваться на стадиях инициации, элонгации и терминации.
• Эффективность транскрипции зависит от силы промотора. • Чем ближе структура природного промотора к структуре канонического промотора, тем сильнее промотор • Специфичность связывание РНК-полимеразы прокариот с промотором определяет - субъединица. • В бактериальных клетках имеется несколько различных -субъединиц, обеспечивающих транскрипцию с различных генов.
• -субъединица необходима только для узнавания промотора, в синтезе РНК она не участвует
В клетках прокариот существуют: • белки-репрессоры, они блокируют синтез РНК • белки-активаторы, они включают синтез РНК
• Транскрипции способствует успешная трансляция. Рибосома как бы подталкивает РНК-полимеразу • При отсутствии трансляции синтез РНК может быть приостановлен. Специальные белок «выдергивает» образующуюся РНК
• Активность промоторов регулируется белками-регуляторами – репрессорами и активаторами. • Репрессры снижают активность РНК- полимеразы. • Участок связывания ДНК с репрессором называется оператором. • Существуют низкомолекулярные вещества, влияющие на сродство репрессора к оператору – эффекторы.
• Различают индукторы и корепрессоры. • Индукторы снижают сродство репрессора к оператору. • Корепрессоры увеличивают сродство репрессора к оператору. • Активаторы усиливают активность РНК- полимеразы. • Некоторые белки могут выступать в одних случаях в качестве репрессора, в других – в качестве активатора.
Lac-оперон E. coli • Оперон кодирует белки катаболизма лактозы, менее предпочтительного по сравнению с глюкозой источника энергии. • Транскрипция lac-оперона происходит только, если в среде отсутствует глюкоза и присутствует лактоза
• В состав оперона входят: 1. три гена, кодирующих белки, участвующих в метаболизме лактозы: β-галактозидазу (гидролизует лактозу), пермеазу (ответственна за транспорт галактозы в клетку), белок А (β- галактозидтрансацетилаза - функция до конца не выяснена) 2. Промотор (40 п. н. ) 3. Оператор (27 п. н. ) 4. Область связывания белка САР*ц. АМФ (38 п. н. )
В среде отсутствует лактоза и присутствует глюкоза • Ген репрессора транскрибируется • Синтезируется репрессор • Репрессор взаимодействует с оператором и препятствует РНК-полимеразе – начать транскрипцию структурных генов
В среде присутствует лактоза и отсутствует глюкоза • Лактоза взаимодействует с репрессором • Комплекс репрессор-лактоза теряет сродство к оператору и покидает его • При недостатке глюкозы в клетке начинает накапливается ц. АМФ, • ц. АМФ связывается с белком CAP • Комплекс CAP*ц. АМФ связывается с определенным участком ДНК. • Связывание CAP*ц. АМФ включает транскрипцию лактозного оперона. • Транскрипция lac-оперона происходит только если в среде отсутствует глюкоза и присутствует лактоза
В среде присутствует лактоза и присутствует глюкоза • Оператор не связан с репрессором • РНК-полимераза не может начать синтез РНК, так как в клетке концентрация ц. АМФ недостаточна для образования комплекса CAP*ц. АМФ
Триптофановый оперон • Триптофановый оперон содержит 5 генов, ответственных за синтез триптофана промотор оператор
Содержание триптофаны в клетке высокое • Триптофан образует комплекс с репрессором • Комплекс взаимодействует с оператором • РНК-полимераза не может начать синтез РНК
Содержание триптофаны в клетке снизилось • Комплекс триптофан-репрессор диссоциирует • РНК-полимераза начинает транскрипцию структурных генов
Регуляция транскрипции на уровне элонгации Аттенюация Регуляция триптофанового оперона может осуществляться благодаря наличию в нем аттюниаторной последовательности (аттенюатора). Эта последовательность входит в состав лидерной области, в которой закодирован лидерный пептид. Лидерный пептид в 10 и 11 положениях содержит два остатка триптофана
• Транскрипция триптофанового оперона E. coli происходит, когда концентрация триптофана в клетке мала • Трансляция лидерного участка м. РНК сопряжена с транскрипцией • Если рибосома быстро транслирует лидерный участок м. РНК (при высоких концентраций триптофана), то формируется структура, способствующая преждевременной терминации транскрипции.
• Если рибосома медленно транслирует лидерный участок м. РНК (при низких концентраций триптофана), то формируется структура, способствующая продолжению транскрипции • В результате синтезируется м. РНК, при трансляции которой образуются белки, ответственные за синтез триптофана
Регуляция на уровне терминации • Антитерминация - прочитывание терминатора • Антитерминацию осуществляют белки-антитерминаторы • В результате антитерминации прочитываются гены, расположенные за терминатором
ЭУКАРИОТЫ Эффективность транскрипции у эукариот зависит • от силы и структуры промотора • от факторов транскрипции • от регуляторных белков, взаимодействующих с энхансерами и сайленсерами • от фосфорилирования РНК-полимеразы • от гормонов • и др
• Механизм действие стероидных гормонов
Механизм действия тироксина
Влияние гормонов, рецепторы которых находятся на клеточной мембране, на экспрессию генов • Большинство гормонов регулируют экспрессию генов, не проникая внутрь клетки. • Известно несколько вариантов передачи сигнала от гормона через рецепторы в ядро.
• Вариант 1
• Вариант 2
• Вариант 3
Регуляция экспрессии генов на уровне созревания РНК • и. РНК прокариот, как правило, процессингу не подвергается. • • У эукариот в отличие от прокариот и. РНК подвергается модификациям. • Удаляются интроны. • К 5’-концу присоединяется кэп, • 3’-конец – полиаденилируется.
Механизм сплайсинга
Альтернативный сплайсинг
• Альтернативный сплайсинг имеет большое биологическое значение. • От его направления зависит формирование пола у дрозофилы. • Случаи альтернативного сплайсинга имеют место в мышечной ткани, нервной ткани. • В результате альтернативного сплайсинга образуются в чем-то схожие и чем-то отличающиеся белки.
РЕДАКТИРОВАНИЕ РНК • Редактирование характерно для митохондриальной РНК • У высших растений исправляется 3 -15 % митохондриальной РНК, простейших – до 50 %, • Редактирование наблюдается и в пластидах, там оно составляет 0, 13 % кодонов • В процессе редактирования обычно Ц заменяется на У, • Иногда происходит замена У на Ц. • Процесс осуществляется специфическими ферментами • Исправляются преимущественно кодирующие последовательности, но могут модифицироваться стоп- кодоны и последовательности внутри интронов
Регуляция на уровне деградации м. РНК • Время полужизни м. РНК прокариот составляет несколько минут • Деградация РНК может быть во времени сопряжена с транскрипцией и трансляцией • Время полужизни РНК эукариот может составлять от нескольких десятков часов до суток
• Скорость поступления железа в клетку зависит от наличия на ее поверхности рецептора трансферина – белка переносчика железа
Регуляция экспрессии генов с помощью si. РНК (РНК-интерференция) • С целью получения сорта петуний с более яркими бордовыми лепестками, генетики ввели в ее клетки ген, отвечающий за синтез красного пигмента. • К удивлению ученых, многие цветы, вместо того, чтобы усилить окраску, теряли пигмент и получались белыми. • Эти эксперименты стали предпосылкой для открытия малых интерферирующих (small interfering) РНК (si. РНК)
• si. РНК (малых РНК) состоят из 21 -28 (у млекопитающих из 21 -23) нуклеотидов. • Они являются двунитчатыми. • По краям каждой из цепей si. РНК всегда остается два неспаренных нуклеотида. • Если молекула si. РНК появляется в клетке, с ней связываются хеликаза и нуклеаза (этап 1), формируя комплекс RISC. • Хеликаза раскручивает нити si. РНК (этап 2). • Одна из нитей, к которой прикреплена нуклеаза, может связаться с комплементарным участком однонитчатой м. РНК (этап 3), позволяя нуклеазе разрезать ее.
• Разрезанные же участки м. РНК подвергаются действию других клеточных РНКаз , которые разрезают их на более мелкие куски (этап 4). • Основное назначение si. РНК в клетке - это блокирование тех РНК, которые соответствуют одной из цепочек si. РНК. • si. РНК образуются из длинных дц. РНК.
• si. РНК в клетке может образоваться следующим образом. • Одна из цепей si. РНК присоединившись к цепи и. РНК, может с помощью комплекса ферментов, обладающего РНК- зависимой РНК-полимеразной и и РНК-эндонуклеазной активностями, сначала достроить вторую цепь и. РНК, а затем разрезать ее с образованием "вторичных" si. РНК
Значение РНК-интерференции • С помощью si. РНК клетка может защищать себя от проникновения РНК-вирусов. • С помощью si. РНК клетка может контролировать активность и расселение транспозонов по геному. • РНК-интерференция может использоваться для изучения функций генов. С помощью si. РНК можно выключить определенный ген. • РНК-интерференция может использоваться в генотерапии для выключения «больных генов» . • РНК-интерференция может использоваться в медицине для борьбы с вирусными заболеваниями.
Маскирование и. РНК у экариот • Связывание маскирующего белка с сегментом маскирования приводит к инактивации функций м. РНК. • Она становится недоступной для инициации трансляции, деградации, модификации 3’-конца
• Маскирование-демаскирование и. РНК характерно для многих биологических процессов (гаметогенез, ранние эмбриональное развитие, клеточная дифференцировка и др. ). • В яйцеклетках происходит запасание и. РНК в маскированной форме, которая демаскируется после оплодотворения, обеспечивая синтез белка на ранних стадиях развития эмбриона.
Регуляция экспрессии генов на уровне трансляции • Существуют три основных способа регуляции трансляции: 1. позитивная регуляция трансляции (дискриминация и. РНК), основанная на сродстве и. РНК к рибосомам и факторам инициации трансляции; 2. негативная регуляция (трансляционная репрессия), осуществляющаяся с помощью белков-репрессоров, которые, связываясь с и. РНК, блокируют инициацию трансляции 3. тотальная регуляция – регуляция трансляции всей совокупности и. РНК
ПОЗИТИВНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ТРАНСЛЯЦИИ • У прокариот для эффективной трансляции инициирующий кодон должен находиться на вершине шпилечной структуры • Предшествовать ему примерно за 3 -10 нуклеотидов должна последовательность Шайна-Дальгарно, комплементарная р. РНК и способствующая связыванию рибосомы в районе инициирующего кодона
• У эукариот инициация происходит чаще всего с первого АУГ, однако если он находится в оптимальном контексте ГЦЦГССА/ГССАУГГА/ЦУ обязательные для инициации нуклеотиды выделены красным • Если первый АУГ находится не в оптимальном контексте, то инициация начинается со следующего АУГ.
• В некоторых м. РНК эукариот инициация не путем сканирования 5’-конца, а за счет узнавания определенного внутреннего АУГ. • Для такого узнавания требуется протяженная последовательность м. РНК. • Эта последовательность узнается определенными белками, которые обеспечивают инициацию с внутреннего кодона
Прокариоты • Скорость и частота трансляции рибосомами может сильно отличаться для разных и. РНК • Выделяют «слабые» и «сильные» и. РНК
• У эукариот и. РНК также бывают «слабыми» и «сильными» • Эффективность инициации трансляции у них обусловлена различным сродством факторов инициации к 5’-концевым структурам и. РНК. • Белки, необходимые клетки в больших количествах, кодируются «сильными» м. РНК, в малых количествах – «слабыми» м. РНК • Мембранный комплекс бактериальной протонной АТФазы – a 1 b 2 g 10. • Субъединица a кодируется слабым цистроном Субъединица b кодируется сильным цистроном Субъединица g кодируется цистроном средней силы
• У прокариот м. РНК может содержать несколько цистронов • Рибосомы могут инициировать трансляцию цистронов в одних случаях независимо друг от друг
• в других – инициация трансляции внутреннего цистрона зависит от трансляции предшествующего • В третьих - инициация трансляции внутреннего цист- рона невозможна без трансляции предшествующего
Негативная регуляция трансляции • Негативная регуляция осуществляется при участии репрессорных белков. • Репрессорный белок связывается с м. РНК. • Часто в месте связывания имеется не стабильная шпилька. • Белок-репрессор стабилизирует шпильку, и препятствует взаимодействию рибосомы с и. РНК (а) или продвижению рибосомы по м. РНК (б). • В ряде случаев репрессором является белок кодируемой данной м. РНК.
• Рассмотрим в качестве примера регуляцию синтеза ферритина. • Этот белок связывает избыток свободного железа в клетке. • Его содержание зависит от концентрации ионов указанного металла. • В присутствии железа в клетке происходит синтез ферритина, при его недостатке белок не синтезируется.
• Трансляция и. РНК ферритина зависит от белка-репрессора, который в отсутствии железа связывается с последовательностью, образующую шпилечную структуру на 5’-конце и. РНК. • Такое связывание стабилизирует шпильку и подавляет трансляцию на стадии инициации. • В присутствии ионов железа репрессор образует с ними комплекс и вследствие этого теряет сродство к и. РНК. • После отделения репрессора и. РНК начинает транслироваться.
• Увеличение содержания ферритина приведет к связыванию железа и снижению концентрации сводного железа в клетке. • В результате комплекс репрессора с железом распадается, и репрессор вновь приобретает сродство к и. РНК и, взаимодействуя с ней, блокирует ее трансляцию.
Тотальная регуляция трансляции у эукариот • Фосфорилирование фактора инициации e. IF 2 при участии протеинкиназы приводит к подавлению инициации трансляции всех м. РНК • Сигналами к активации протеинкиназы служат тепловой шок, недостаток ростовых факторов, аминокислотное голодание, недостаток железа, вирусные инфекции
Неоднозначность трансляции Cуществуют многочисленные примеры, когда генетическая информация расшифровывается не строго по правилам генетического кода и трансляции. • Некоторые и. РНК в транслируемой области содержат терминирующие кодоны, но они игнорируются за счет сдвига рамки считывания. Рамка может сдвигаться на -1, +2. • В процессе трансляции некоторых генов рибосома может совершать прыжки на десятки нуклеотидов.
• У ретровирусов при трансляции гена, кодирующего обратную транскриптазу происходит закономерный сдвиг рамки считывания на один нуклеотид. Если бы не происходил сдвиг рамки считывания, фермент бы не образовывался • Если бы с частотой 3% не происходило прочтения нонсенса в конце гена, кодирующего белок оболочки одного из РНК- содержащих бактериофагов, его частицы не проявляли инфекционности по отношению к клеткам E. coli.
• У многих живых существ т. РНК, которые обусловливают нестандартное чтение кодовой таблицы. • У бактерий нашли т. РНК, читающую кодон UUU (финилаланин) как кодон для лейцина, у дрожжей – т. РНК, читающие нонсенсы UAA и UAG как кодоны для глутамина, . Интересно, что их антикодоны не были комплементарны считываемым кодонам. • В процессе трансляции может включаться в белок нестандартная аминокислота селеноцистеин. Его кодирует нонсенс УГА, если за ним находится особая стимулирующая последовательность.
Спасибо за внимание