РЕЦЕПТОР ЭПИДЕРМАЛЬНОГО ФАКТОРА РОСТА (ЭФР): ЭНДОЦИТОЗ И ПЕРЕДАЧА
vezikulyarnyy_transport_lecture8-signaling2.ppt
- Размер: 89.8 Мб
- Автор:
- Количество слайдов: 54
Описание презентации РЕЦЕПТОР ЭПИДЕРМАЛЬНОГО ФАКТОРА РОСТА (ЭФР): ЭНДОЦИТОЗ И ПЕРЕДАЧА по слайдам
РЕЦЕПТОР ЭПИДЕРМАЛЬНОГО ФАКТОРА РОСТА (ЭФР): ЭНДОЦИТОЗ И ПЕРЕДАЧА СИГНАЛА ЭФР через свой трансмембранный рецептор участвует в эмбриогенезе, регулирует пролиферацию, дифференцировку, апоптоз и подвижность многих типов клеток. В то же время, ЭФР после связывания с рецептором на ПМ подвергается эндоцитозу. ЭФР-рецепторная система, таким образом, является прекрасной моделью для изучения как механизмов регуляции сигналинга и эндоцитоза, так и механизмов координации сигнальных путей и их организации во времени и в пространстве.
Стимуляция сигнальных каскадов эндоцитоз ЭФР-рецепторных комплексов. STAT PLC Src GRB 2 SHC, c-Cbl ……out ПМ in активация ТК
Как организован эндоцитозный путь рецептора ЭФР активация GEF для Rab 5, RIN 1 активация Eps 8 активация GAP для Rab 5, RN-tre Rab 5 * Rab 5 Тирозинкиназный домен рецептора PI 3 P HOPS Rab 7*
Эндосомы укрупняются в результате слияний YEEA 1 Y MT EE EE VAMP 8 Rab 5 -GDPRab 5 -GTP Rabex 5 Rabaptin 5 P 150 Vps 34 Syntaxin 13 Dynein PI 3 P EGFR Y В результате серии слияний эндосомы изменяют свой размер со 100 -200 нм до 1 -2 мкм. Укрупнение необходимо для созревания (источник мембраны для мультивезикулярных поздних эндосом)
Эндосомы претерпевают множественные слияния На раннем этапе , по всей видимости, слияние обеспечивается участием везикул-посредников, несущих фактор дистанционного взаимодействия ЕЕА 1 «опосредованное слияние» сегрегация. РЭ с грузом РЭ-посредник Фрагментация до исходных размеров, возвращение во внутриклеточный пул «посредников» Вступление в новые циклы слияний ЕЕА 1 Клетки линии РАЕ EGFR-GFP EEA 1 Димер ЕЕА 1 RBDRBD FYVERBDRBD Rab
No EGF after cold 15 min 30 60 90 E G F R
«структуры рядом» «сложная структура» «структуры близко»
30 ’Двудоменные структуры сливаются, формируя мультидоменные органеллы, часть из которых впоследствии могут формировать агрегаты Клетки РАЕ AII Клетки РАЕ AII 30 ’ Клетки He. La 3 мкм GFP-EGFR EEA 1 -Alexa 568 GFP-EGFR EGF-QD 655 EGF-QD 565 EGF-QD 655 Стимуляция эндоцитоза по схеме “pulse-chase-p ulse” GFP-EGFR EEA 1 -Alexa 568 30’ 3 мкм
Нокодазол Цитохалазин 15 30 60 90 мин Микротрубочки служат базовой платформой как для слияний, так и для сегрегации. Актиновые структуры критичны для сегрегации эндосом и ЕЕА 1 -везикул
эндосомы ЕЕА 1 -везикулы Попарное формирование гибридных эндосом «вторичные слияния» и / или образование кластеров эндосом и ЕЕА 1 -везикул Возникновение крупных доменов эндосом, содержащих рецептор ЭФР Сегрегация везикул возвращение ЕЕА 1 -везикул в исходный пул ЛИЗпоздние эндосомы. МТ -, МФ — МТ + , МФ +Укрупнение ранних эндосом опосредуется формированием гибридных структур с участием ЕЕА 1 -везикул Микротрубочки работают как платформа, обеспечивающая слияния везикул. Последующая актин-зависимая сегрегация везикул без МТ невозможна
По всей видимости, параллельно с ЕЕА 1 -зависимыми слияниями идет процесс созревания, приводящий к формированию мультивезикулярных поздних эндосом. После сегрегации ЕЕА 1 -везикул (ранних эндосом) и рецептор-содержащих эндосом последние , возможно, взаимодействуют с Rab 7 — везикулами, роль которых в основном в позиционировании поздних эндосом в ОЯО (через RILP_dynein) , что способствует формированию гибридных органелл с лизосомами Т. обр. , ЕЕА 1 -везикулы, Rab 7 — везикулы и Lamp 1 — лизосомы можно рассматривать как истинные «предсуществующие» компартменты эндоцитозного пути, везикулярного типа, каждому из которых свойственна строго определенная функция ЕЕА 1 -зависимые слияния и сегрегация ЕЕА 1 -доменов и груз-содержащих доменов поддерживается динамичными микротрубочками, тогда как поздние этапы – стабильными высокоацетилированными МТ Актин ввиде коротких филаментов, объединенных с динамичные сети через Arp 2/3 , участвует в поддержке искривления мембран и процессах сегрегации доменов
ЯДРО EGFR* c-Cblubiquitin RIN 1 > Rab 5* Vps 34 эндосома PI 3 PЧто происходит на эндосоме «с точки зрения рецептора» ?
TK Убиквитин-лигаза c-CBLHRSSTAM / Hbp SNX 1 ESCRT III Doa 4 Vps 4 Деубиквитинирующие ферменты «Раздевающая» АТФаза. Все усилия сводятся к концентрированию рецептора в доменах, из которых пойдет инвагинация внутрь МВТ. ESCRT 0 -I критичны для сортировки и концентрирования грузов, а ESCRTII-III обеспечивают инвагинацию и отщепление внутреннего пузырька AMSH, UBPY TSG 101 Vps 28 Vps 37 (HCPR 1) Bcr ? Eap 30 Eap 25 Eap 45 Eap 20 CHMP 1 A CHMP 1 B CHMP 2 A, B CHMP 3 CHMP 4 A, B, C CHMP 5 CHMP 6 CHMP
Nature. 2009 March 12 Lippincott-Schwartz Nature, 458(7235): 172– 177 (2009 )Как ESCRTIII b Vps 4 замыкают инвагинацию в МВТ: Комплекс собирается в спиральный полимер, начиная с края инвагинации внутрь, подтягивая мембрану. Vps 4 , разбирая разбирает всю конструкцию в том же порядке, достигая внутреннего круга. Финальная стадия цитокинеза – абсцизия (abscission) – замыкание узкой перемычки между мембранами дочерних клеток, В этом процессе тоже участвуют Компоненты ESCRTIII -комплекса Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Mar 22; 108(12): 4846 -51 , Lippincott-Schwartz
Rab 5 –Vps 34 Rab 7 — Vps 34 Vps 4 HRS STAM SNX 1 SNX 2 TSG 101 Vps 28 Vps 37 (HCPR 1) Bcr ? Eap 30 Eap 25 Eap 45 Eap 20 CHMP 1 A CHMP 1 B CHMP 2 A, B CHMP 3 CHMP 4 A, B, C CHMP 5 CHMP 6 CHMP 7 Uncoating ATPase Early endosomes late endosomes. HRS ESCRT III Doa 4 PI 3 P“ Cross-talk” белков, регулирующих динамику МТ, и сортирующих комплексов Spastin Rho. Bstathmin Contains MIT – MT interacting domain
15 min 60 min. Ранние эндосомы связаны с динамичными микротрубочкам, перемещаются в околоядерную область, где и происходит их созревание вортманнин, EGFR, Golgi EGFR , acetyl-tubulin EGFR , LAMP
EGF EGFR* (active) EGFR EEA 1 SNAREs Сортирующие комплексы ESCRT 0 -III Сигнальные комплексы Моторные белки. Регуляция слияний. Регуляция сигнализации с эндосом Созревание, вступление на путь лизосомной деградации МТ Поддержание доменной структуры эндосом могут обеспечивать Rab 5, существующие ввиде 3 х изоформ : Rab-a, Rab-b, Rab-c, по-разному фосфорилированнные, а также Rab 4, Rab 11, Rab 9 …. ( см. схему EE-LE , вложенную в папку лекции № 8 )актин Н+Са 2+ О 2 — 100 – 600 нм. Маленькая эндосома — сложная молекулярная машина. Существование разделенных доменов на поверхности эндосомы позволяет одной везикуле участвовать в нескольких процессах одновременно
«Динамическая нестабильность» эндоцитоза – механизм адаптации к внешним сигналам
Рециклированиеинтернализация. ПМ Сортировка на путь деградации ( ТК-зависимое убиквитинирование) РЭ ПЭ (МВТ)созревание лиз
Семейство c-Erb. B: EGFR (c-Erb. B 1), c-Erb. B 2, c-Erbb-3, c-Erb. B-4 Более 12 членов семейства ЭФР-подобных лигандов EGFR: EGF, TGF-alpha, amphyregulin, etc градиент р. Н деградация в лизосомах Рециклирование на ПМранние эндосомы поздние эндосомы градиент формируется за счет работы вакуолярной протонной помпы Vo/V
EGF + Baf. A 1 TGF + Baf. A 1 15 min 30 min 60 min 90 min 120 min
Первоначально эндоцитоз сигнальных рецепторов рассматривали исключительно как способ аттенюации генерируемого на плазматической мембране сигнала: эндоцитоз просто убирает лишние рецепторы с ПМ, «десенситизируя» клетку к действию ростового фактора Но: рецептор в эндосомах может сохранять тирозинкиназную активность вплоть до попадания в МВЭ
Время жизни активированного рецептора ЭФР на ПМ значительно меньше, чем в эндосомах. Рецептор ЭФР в эндосомах проведение сигнала?
При стимуляции эндоцитоза ЭФР белки МАР-киназного каскада Shc, GRB 2, m-Sos, Raf, MEK, ERK локализуются на эндосомах (Pol et al. , 1998, FEBS Lett. , 441: 34 -38; Rizzo et al. , 1999, JBC, 274: 1131 -1139; Oksvold et al. , 2001, Eur. JCB 80: 285 -294; Jiang and Sorkin, 2002, MCB, 13: 1522 -1535)MAP- киназный каскад: МАРККК МАРК EGFR > Shc, GRB 2 > m. Sos> Ras > Raf > MEK > Erk > Elk , Jun, Fos Плазматическая мембрана ядро
Сигнал с эндосом : Поддержание стимулированного на плазматической мембране или генерация нового сигнала?
При простой диффузии и цитозольной локализации фосфатаз пул белков, фосфорилированных на мембране, при достижении ядра сократится на порядок В случае локализации таких белков на эндосомах эффект дефосфорилирования будет гораздо меньше.
KSR 1 Raf Erk. Ras MEKПМ ? РЭМР 1 р14 MEK Erk ПЭ/МВТАссоциация МАР-киназы с ПЭ происходит с помощью комплекса скэффолд-белков р14 и МР 1 Сборка компонентов каскада на ПМ происходит с помощью скэффолд-белка KSR 1 Оказалось, что МАР-киназный каскад локализуется на ПМ и на МВТ с помощью разных адаптеров
A 431: EGF, TGF > CDK inhibitor p 21/CIP 1 > inhibition of DNA synthesis Skarpen et al. , 1998, Exp Cell Res. 243: 161 -172 РЭ ПЭЭФР TG
APPL 1/2(Adaptor protein containing PH domain, PTB domain and Leucine zipper motif) Локализуется на мембранах ранних эндосом (ЕЕА 1 -негативных) В ответ на EGF или окислительный стресс, APPL 1 транслоцируется с мембран в ядро, где взаимодействует с Nu. RD/Me. CP 1 (nucleosome remodeling and histone deacetylase multiprotein complex) – регулятором структуры хроматина и экспрессии генов. APPL 1 и 2 участвуют в регуляции пролиферации. Для их функционирования необходима связь с Rab
Incorporation of Brd. U (1 hr pulse) 48 hr after transfection with APPL si. RNAAPPL 1 ко-локализуется с rab 5 , но не с ЕЕА 1 и кавеолином APPL участвует в стимуляции митогенного ответа
AG 1478 (0. 5 m. M) + monensin EGF (20 -100 ng/ml) — 15 min 0 min 30 min 60 min wash stripping IF, fractionation, WB TK-active EGFR only in endosomes
BT 20 cells EGFR EGFR p. Tyr p. EGFR control AG+monensin
endosomal signaling Сигнал с эндосом достаточен для активации основных сигнальных путей, стимулируемых ЭФР +EG F- serum
G 0 early G 1 late G 1 R S + EGF +AG 1478 37 o C 30 мин отмывка AG 1478 активация EGFR в эндосомах сигнал с эндосом + EGF активация МАРК каскада, пролиферация активация PI 3 K/Akt пути, подавление апоптоза
Соотношение между уровнем рециклирования и деградации постоянно для определенного типа клеток Рециклирование позволяет поддерживать сигнал за счет внутриклеточного пула рецепторов, а путь деградации обеспечивает десенситизацию клеток . K a K dis K int K rec K sort K degr. Ранние эндосомы Поздние эндосомы лизосомы. ПМ «Классические» представления о динамике эндоцитоза ?
ПМ Ранние эндосомы Поздние эндосомы лизосомы • На самом деле: соотношение между путями рециклирования и лизосомной деградации может меняться в широких пределах в клетках одной и той же линии. Скорость протекания поздних стадий также может варьировать
1 60 мин 120 мин время после стимуляции эндоцитоза 125 I-ЭФ Р, доля от первоначально связанного 1 1 деградация ПЭ РЭ рециклирование путь на деградацию рециклирование путь на деградацию рециклирование Время жизни рецептора ЭФР в эндосомах может варьировать от 30 мин до 3 -4 часов
Изменение локализации рецептора ЭФР в ходе эндоцитоза (клетки He. La)control 15 min 60 min 90 min 15 min 30 min 60 min 90 min
«быстрый» эндоцитоз» , ярко выраженная реорганизация МТ control 15 min 60 min 90 min
Динамика эндоцитоза замедлена, реорганизация системы МТ выражена слабо 15 min 30 min 90 min 150 min 60 min
«медленный» эндоцитоз Реорганизация заключается в практически полной деполимеризации МТ. Восстановления за время эксперимента не происходит. 15 min 30 min 60 min 90 min
При стимуляции эндоцитоза ЭФР белки МАР- киназного каскада Shc, GRB 2, m-Sos, Raf, MEK, ERK локализуются на эндосомах (Pol et al. , 1998, FEBS Lett. , 441: 34 -38; Rizzo et al. , 1999, JBC, 274: 1131 -1139; Oksvold et al. , 2001, Eur. JCB 80: 285 -294; Jiang and Sorkin, 2002, MCB, 13: 1522 -1535)MAP- киназный каскад: МАРККК МАРК EGFR > Shc, GRB 2 > m. Sos> Ras > Raf > MEK > Erk > Elk , Jun, Fos Плазматическая мембрана ядро
Эндоцитоз существенен для полной активации МАР-киназы: Inhibitors of clathrin-mediated endocytosis: Эндоцитоз не существенен для полной активации МАР-киназы:
полная активация МАР-киназы происходит тогда, когда рецептор проходит весь деградационный путь; если же рецептор в основном рециклирует, то МАР-киназа активируется не полностью KSR 1 Raf Erk. Ras MEKПМ ? РЭМР 1 р14 MEK Erk ПЭ/МВТАссоциация МАР-киназы с ПЭ происходит с помощью комплекса скэффолд-белков р14 и МР 1 Сборка компонентов каскада на ПМ происходит с помощью скэффолд-белка KSR
Эндоцитоз существенен для полной активации МАР-киназы: Inhibitors of clathrin-mediated endocytosis: Эндоцитоз не существенен для полной активации МАР-киназы:
PC 12 cells: EGF NGF MAPK* пролиферация диференцировка 2 -15 мин 1 — 3 ч
Vps 4 TK Убиквитин-лигаза c-CBL Ras, GRB 2, Shc, MP 1(MAPK)HRSSTAM / Hbp SNX 1 ESCRT ITsg 101 Vps 28 Vps 37 ESCRT IIEap 30 Eap 25 Eap 45 ESCRT IIIVps 20/Snf 7 Vps 2/Vps 24 Doa 4 STAM — signal transducing adapter molecule В Т клетках оверэкспрессия HRS блокирует синтез ДНК, стимулируемый IL 2 , только если нарушено его взаимодействие со STAM НО: оверэкспрессия HRS подавляет деградацию EGFR , что должно приводить к стимуляции синтеза ДНК TSG 101 (tumor susceptibility gene 101) – блокировка работы этого белка подавляет деградацию EGFR, стимулирует трансформацию клеток
APPL ½ ( Adaptor protein containing PH domain, PTB domain and Leucine zipper motif) Локализуется на мембранах ранних эндосом (ЕЕА 1 -негативных), может связываться с ТК рецепторами через РТВ-домен, стимулирует Akt 1 , регулирует транслокацию GLUT 4 В ответ на EGF или окислительный стресс, APPL 1 транслоцируется с мембран в ядро, где взаимодействует с Nu. RD/Me. CP 1 (nucleosome remodeling and histone deacetylase multiprotein complex) – регулятором структуры хроматина и экспрессии генов. APPL 1 и 2 участвуют в регуляции пролиферации. Для их функционирования необходима связь с Rab 5 STAM — signal transducing adapter molecule , партнер HRS по ESCRT 0 — комплексу ; ассоциируется с Janus киназой, индуцирует экспрессию с- myc под действием IL-2 RIN 1 взаимодействует со STAM 2; Профиль тирозинового фосфорилирования HRS-STAM комплекса при действии EGF, PDGF, HGF различается STAM действует и на биосинтетическом пути, ассоциируется с COPII — везикулами Sar 1 p- зависимым образом, регулирует морфологию аппарата Гольджи: При оверэкспрессии STAM Гольджи фрагментируется, а при нокауте – коллапсирует в области ЦОМТ TOM 1 L 1 – взаимодействует с HRS (ESCRT 0) и Tsg 101 ( ESCRTI), Имеет несколько остатков тирозина, фосфорилируемых киназами Src- семейства, что определяет его взаимодействие с GRB 2 и р85 — PI 3 — киназой
Alix /AIP 1 – a poptosis- l inked gene 2 — i nteracting protein X На поздних стадиях : по всей видимости, регулирует процесс формирования внутренних везикул МВТ и их обратное слияние с внешней мембраной через взаимодействие с компонентами ESCRT- комплексов. На ранней стадии : модулирует эфективность убиквитинирования рецептора и скорость его интернализации А lix и ALG 2 рекрутируют про-каспазу8 на мембрану эндосом, содержащих TNFalpha. R
nucleus. APPL ERK (KSR) ПМ РЭ ПЭ (МВТ) лиз. ERK (p 14/MP 1)STAM TOM 1 L 1 P 21/CIP 1 Alix сигнальный контекст Src, PIP 3 — кин аза з
локализация рецепторов Регуляция экспрессии генов. Нейротрофины: NGF, BDNF , NT-3, NT-4 /5 Рецепторы — тирозинкиназы Trk. A, B, C и p 75 NTR ( нет ферментативной активности, структурно принадлежит семейству рецепторов TNF ), связывает все нейротрофины, модулирует аффинность Trk , уменьшает его убиквитинирование и интернализацию P 75 -NGF-Trk А – выживание P 75 — Nogo-Nogo. R – ингибирование регенерации аксонов NGF-Trk. A- эндосомы содержат: На ранней стадии — APPL 1/2 Компоненты ERK ½- киназного каскада; их сигнал с эндосом стимулирует рост нейритов PI-3 k Rab 5, Rab 7 Rap 1 – малую ГТФазу , участв. в выживании и дифференцировке, локализуется также на мембранах аппарата Гольджи; PLCgamma
Эндоцитоз сигналинг