Полимеразные цепные реакции История открытия Кари Маллис

Полимеразные цепные реакции

История открытия Кари Маллис Лауреат Нобелевской премии 1993 года

□ Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – искусственный процесс многократного копирования (амплификации) специфической последовательности ДНК, осуществляемый in vitro. □ Копирование ДНК при ПЦР осуществляется специальным ферментом – ДНК – полимеразой, как и в клетках живых организмов. □ Ещё одно сходство с живыми клетками – это то, что синтез ДНК – цепи не может начаться «с нуля» , для этого необходима «затравочная» цепь РНК или ДНК, к которой она может начать присоединять нуклеотиды.

□ Основной принцип ПЦР – реакция полимеризации инициируется специфическими праймерами (короткими фрагментами «затравочной» ДНК) в каждом из множества повторяющихся циклов. □ Специфичность ПЦР определяется способностью праймера «узнавать» строго определенный участок ДНК и связываться с ним по принципу молекулярной комплементарности.

□ Для того, чтобы выявить и размножить в имеющейся пробе именно ту последовательность ДНК, которая необходима, нужно знать нуклеотидные последовательности ее концов, для того, чтобы создать к ним комплементарные короткие (18 -30 нуклеотидов) фрагменты - праймеры. Известные концы Последовательности отмечены синим, а черным – тот фрагмент ДНК, который нужен.

Структура ДНК

Этап первый: денатурация □ Это «плавление» ДНК, когда двухцепочечная молекула ДНК под действием высокой температуры переходит в одноцепочечное состояние.

Этап второй: Отжиг □ Это «связывание» праймеров с матричной ДНК.

Этап третий: Элонгация □ Это удлинение цепи.

□ Полимеразная цепная реакция (схема). 1 — ДНК биопробы. Цикл ПЦР: а — термоденатурация (94– 96 °C); б — отжиг праймеров (40 – 60 °C); в — элонгация цепи (72 °C). Если n — число циклов реакции, то число получаемых в результате копий заданного гена равно 2 n.

Разновидности ПЦР □ 1. «Вложенная» ПЦР (Nested PCR) - есть вторая пара праймеров, которая амплифицирует часть полученной дочерней последовательности. □ 2. «Инвертированная» ПЦР (Inverse PCR) - перед проведением ПЦР с помощью серии ферментативных реакций как бы приклеивают известные фрагменты на концы неизвестного, чтобы можно было его амплифицировать. □ 3. ПЦР с обратной транскрипцией (Reverse Transcription PCR, RT-PCR) - берется РНК (молекула, которая является промежуточным этапом между ДНК и белками в живой клетке), а из нее с помощью фермента обратной транскриптазы получают ДНК, с которой уже проводят ПЦР. Это удобно, например, для того, чтобы выявить, какие именно гены в данной клетке экспрессируются.

□ 4. Ассиметричная ПЦР (Assymetric PCR) - если нужны продукты амплификации преимущественно одной из двух цепей ДНК. Добавляют неравное количество праймеров. □ 5. Количественная ПЦР в реальном времени (Quantitative real -time PCR) - используются флуоресцентно меченые реагенты, и специальный прибор рассматривает пробирку, в которой идет реакция, и сообщает: "готово столько-то продукта! а теперь уже вдвое больше!" □ 6. ПЦР длинных фрагментов (Long-range PCR) - чтобы амплифицировать длинный (больше 10 тысяч пар оснований) фрагмент, используют ПЦР с двумя полимеразами: одна из них, Taq-полимераза, может синтезировать длинную цепь, а вторая, ДНК-полимераза с 3'5'-экзонуклеазной активностью, может исправить ошибки, допущенные первой. □ 7. Multiplex PCR - добавляют несколько пар праймеров и одновременно амплифицируют несколько фрагментов.

Усовершенствование технологии ПЦР □ Усовершенствование температурных условий (термоциклеры и элементы Пельтье). □ Развитие и усовершенствование методов анализа продуктов реакции (методы гель – электрофореза, гибридизации, использование флуоресцентных маркеров).

Устройство термоциклера

Преимущества метода ПЦР □ Скорость и высокая производительность (то есть возможность параллельного анализа большого количества образцов). □ Высокая специфичность, определяемая уникальностью генетического материала. □ Высокая чувствительность.

Недостатки метода. □ Экстремальная чувствительность. □ Узкая направленность в отличии от культурального метода. □ Опасность получения ложноположительного и ложноотрицательного результатов. □ Дорогостоящий метод.

□ В отличие от иммунологических методов, где о наличии микроорганизма судят исключительно по наличию в крови пациента антител к конкретным возбудителям, эта диагностика выявляет непосредственно самого возбудителя или его части даже в предельно малых концентрациях, что делает метод наиболее точным и чувствительным.

□ ПЦР диагностика назначается пациентам, у которых сложно идентифицировать возбудителя, но, чаще всего, эту методику используют для выявления мочеполовых инфекций, которые тяжело выявить и идентифицировать стандартными иммунологическими методиками и посевами. □ Так же широко полимеразные цепные реакции используется для определения вирусных инфекций (папилломы, гепатитов), широко используется методика для ранней диагностики ВИЧ инфекции (особенно у детей, рожденных от ВИЧ позитивных родителей).