Други виды Хроматографии.ppt
- Количество слайдов: 85
Плоскостная хроматография n Плоскостная хроматография – объединяет методы, в которых регистрируются внутренние хроматограммы: - бумажная хроматография – в качестве носителя неподвижной фазы используют целлюлозное волокно бумаги; - тонкослойная хроматография (ТСХ) - в качестве носителя неподвижной фазы используют различные сорбенты, нанесенные на пластинку тонким слоем.
Плоскостная хроматография n Разделяемые компоненты на пластинке или полоске бумаги образуют отдельные зоны, положение которых характеризуется величинами: - Rf – относительной скоростью перемещения компонентов; - Rf = x 1/L, где x 1 – расстояние, пройденное веществом, L – расстояние, пройденное растворителем; - по определению Rf ≤ 1.
Плоскостная хроматография
Плоскостная хроматография
Основные уравнения в плоскостной хроматографии ■ Связь коэффицента распределения D с Rf: где kf – коэффициент перехода от жидкостной колоночной хроматографии (ЖКХ) к ТСХ: при kf =1 уравнение принимает вид
Основные уравнения в плоскостной хроматографии ■ Число теоретических тарелок N рассчитывают по формуле: в этом случае х = t. R, y = w.
Основные уравнения в плоскостной хроматографии
Основные уравнения в плоскостной хроматографии n Эффективность выбранного варианта ТСХ (адсорбционного, распределительного, ионообменного) и хроматографической системы можно оценить по фактору разделения (селективности) двух веществ (α) с разными коэффициентами распределения:
Нанесение и способы получения хроматограмм n Пробу (0, 5 – 5 мкл) наносят микропипеткой на стартовую линию (1– 2 см от края бумаги (пластинки) и продолжают хроматографирование до тех пор, пока растворитель не пройдет от линии старта ~ 10 см; n Используют восходящие (одномерные, двухмерные), нисходящие, круговые хроматограммы.
Способы получения хроматограмм
Способы получения хроматограмм
Способы получения хроматограмм
Способы получения хроматограмм
Наборы для ТСХ
Анализ хроматограмм n Использование способности разделяемых веществ окрашенные или люминесцирующие образовывать соединения. n Нанесение флуоресцентного индикатора (производные пирена, флуоресцеина, морина, родамина Б) – компоненты наблюдаются в виде темных пятен на общем светящимся фоне. n Нанесение сильного окислителя (HNO 3, KMn. O 4, H 2 SO 4) – темные пятна органических веществ. n Нанесение группового или селективного реагента: нингидрин реагент на NH 2 -группы; Fe. CI 3 – реагент на фенолы; анилинфталат - реагент на сахара и др.
Анализ хроматограмм n Использование радиоактивных изотопов. n Измерение Rf. n Использование различных методов химического анализа (в твердой фазе и после элюирования компонента).
Анализ хроматограмм
Реагенты для определения (проявления) некоторых органических соединений в ТСХ
Разделение катионов на микрокристаллической целлюлозе методом ТСХ
Величины Rf некоторых двухосновных карбоновых кислот и оксикислот
Разделение методом ТСХ аминокислот подвижная фаза: н – бутанол – пиридин - уксусная кислота - вода (60: 40: 12: 48)
Аминокислоты
ТСХ в контроле синтеза различных веществ
Применения ТСХ
Сверхкритическая флюидная хроматография (СФХ) n В СФХ подвижной фазой является так называемая флюидная фаза (N 2 O, NH 3, CH 3 F, CH 2 F 2, CHF 3, C 6 H 6, SF 6, CO 2, метанол, н-бутан, диэтиловый эфир, дихлордифторметан, изопропанол, диэтиловый эфир, фреоны и др. ). n СФХ сочетает основные достоинства как газовой (ГХ), так и жидкостной хроматографии (ЖХ). n Методом ГХ не определяются вещества, которые нелетучи, т. е. не могут быть переведены в газовую фазу без разложения. n Существует много веществ, которые не могут быть определены методом ЖХ из-за отсутствия подходящих способов детектирования.
Сверхкритическая флюидная хроматография n Доля этих нерешаемых задач достигает 25 % от общего числа задач химического анализа, требующих разделения веществ: природные вещества, лекарственные препараты, продукты питания, полимеры, нефти, пестициды. n Рынок лекарств растительного происхождения, которые практически полностью производятся и контролируются с помощью СКФ-технологий в 2005 г. по оценке компании Business Communication составил 37 млрд. $. n Сверхкритическим флюидом (СКФ) называют состояние вещества, в котором его температура и давление превышают критические параметры. n В критической точке две фазы, жидкая и газовая становятся неразличимы.
Сверхкритическая флюидная хроматография
Сверхкритическая флюидная хроматография
Сверхкритическая флюидная хроматография
Преимущества СКФ n Многие физические свойства СКФ (плотность, вязкость, скорость диффузии) являются промежуточными между свойствами жидкости и газа. n Основными преимуществами СКФ как растворителей являются: - сочетание свойств газов при высоких давлениях (низкая вязкость, высокий коэффициент диффузии) и жидкостей (высокая растворяющая способность); - быстрый массоперенос, осуществляемый благодаря низкой вязкости и высокому коэффициенту диффузии
Преимущества СКФ (продолжение) n Преимущества СКФ (продолжение): - сочетание пренебрежимо малого межфазного натяжения с низкой вязкостью и высоким коэффициентом диффузии, позволяющее СКФ проникать в пористые среды более легко по сравнению с жидкостями.
Преимущества СКФ (продолжение) n Преимущества СКФ (продолжение): - высокая чувствительность растворяющей способности СКФ к изменению давления или температуры; - простота разделения СКФ и растворенных в них веществ при сбросе давления. n Наиболее популярным СКФ (около 80 % всех исследований в области сверхкритических флюидных технологий) является СО 2 (удобные критические параметры: T = 31, 2 0 C, P = 72, 8 атм. ).
Сверхкритическая флюидная хроматография
Характеристики подвижных фаз
Критические температуры и давления некоторых флюидов
Сверхкритическая флюидная хроматография
Сверхкритическая флюидная хроматография
СКФ хроматографические системы
Сверхкритическая флюидная хроматография n Неподвижные фазы: полимерные пленки или полимеры, нанесенные на поверхность капиллярных колонок или твердый адсорбент. n Из-за сильной растворяющей способности СКФ капиллярные колонки изготавливают из кварца. n Неподвижную фазу наносят на внутреннюю силанизированную поверхность в виде тонкой жидкой пленки или химически связывают с ней. n Длина колонок составляет 10 - 20 м; внутренний диаметр – 0, 05 - 10 мм; толщина слоя неподвижной фазы 0, 05 - 1 мкм.
Сверхкритическая флюидная хроматография n Подвижная фаза: диоксид углерода (удобен в работе, дешев, нетоксичен, не обладает запахом, светопоглощение до 190 нм); иногда добавляют модификатор (метанол, диоксан, ацетонитрил и др. ).
Сверхкритическая флюидная хроматография n Детекторы: ПИД, масс-спектрометрический, фотометрические в УФ- и ИК-области, флуоресцентные, ПФД, катарометры, детекторы электронного захвата.
Сверхкритическая флюидная хроматография
Сверхкритическая флюидная хроматография
Сверхкритическая флюидная хроматография
Сверхкритическая флюидная хроматография (СФХ)
Классический электрофорез n В основе методов электрофореза лежит явление миграции ионов, т. е. их движение в электрическом поле. n Классический электрофорез (с носителем и без него) используют в исследованиях по биохимии и молекулярной биологии для разделения, выделения и определения белков, полинуклеотидов и других биополимеров; электрофорез без носителя предложен А. Тизелиусом (Нобелевская премия, 1948 г. ).
Классический электрофорез n Тизелиус Арне - (1902 - 1971), шведский биохимик, один из создателей методов электрофоретического и адсорбционно - хроматографического анализа для исследования биополимеров (в том числе белков сыворотки крови).
Классический электрофорез
Классический электрофорез в медицине n Электрофореграмма белков сыворотки крови с фотометрическим определением:
Классический электрофорез в анализе нуклеотидов
Капиллярный электрофорез (КЭ) n Разделение происходит в термостатированном (10 -50 0 С) гибком кварцевом капилляре с внешним полиамидным покрытием под действием электрического поля.
Капиллярный электрофорез n По сравнению с ВЭЖХ большая эффективность (N до 1, 5 • 105), малый расход реактивов, экспрессность и простота аппаратурного оформления. n Эффективность разделения КЭ в 10 -100 раз превосходит эффективность разделений в ВЭЖХ. n В КЭ присутствует лишь молекулярная диффузия (параметр В), а вихревая диффузия (А) и массоперенос (С) отсутствуют. H = A + B/v + Cv
Капиллярный электрофорез n Капиллярный электрофорез основан на явлениях электрофореза и электроосмоса: - электрофоретическая подвижность иона – скорость перемещения заряженной частицы, отнесенная к единице напряжения электрического поля; - электроосмотический поток (ЭОП) возникает из-за образования двойного электрического слоя между раствором и внутренней стенкой капилляра, которая отрицательно заряжена за счет присутствия диссоциированных силанольных групп.
Капиллярный электрофорез n Этот отрицательно заряженный слой притягивает положительные ионы из раствора; образуется положительно заряженное кольцо жидкости, которое движется в направлении к катоду.
Капиллярный электрофорез n При подаче высокого напряжения положительно заряженные частицы мигрируют в направлении катода, а отрицательные – в направлении анода. n Нейтральные молекулы (N) будут также будут мигрировать в направлении катода со скоростью электроосмотическго потока.
Капиллярный электрофорез ■ Таким образом, ЭОП не влияет на движение положительно заряженных ионов к катоду и замедляет движение анионов.
Распределение зарядов и электроосмотический поток в кварцевом капилляре
Капиллярный электрофорез n Разделение происходит в капилляре диаметром 25 - 75 мкм и длиной 25 - 100 см, заполненным электролитом. ■ Платиновые электроды присоединены к источнику тока до 250 мк. А при напряжении от 1000 до 30 000 В. ■ Малые объемы ≈1 нл обеспечивают низкие пределы обнаружения. ■ С лазерными детекторами LOD до 10 -21 моль.
Капиллярный электрофорез
Капиллярный электрофорез
Капиллярный электрофорез
Селективность КЭ
Капиллярный электрофорез ■ Сэр Джордж Габрие ль Стокс (1819 – 1903) — английский математик, механик и физиктеоретик ирландского происхождения.
Характеристики разделения методом КЭ ■ Общая подвижность растворенного вещества µ равна сумме электрофоретической подвижности (µэф) и скорости электроосмотического потока (µос) : µ = µэф + µос ■ Электрофоретическая подвижность определяется как: µэф = z/6 πηr, где z – число ионных зарядов растворенного вещества; η – вязкость раствора; r - ионный радиус.
Характеристики разделения методом КЭ ■ Число теоретических тарелок можно оценить из уравнения: N = µ × V/2 D где V – напряжение, приложенное к ячейке; D – коэффициент диффузии растворителя.
Характеристики разделения методом КЭ ■ Большие молекулы белков и нуклеотидов имеют очень маленькие D, что позволяет получать значения N порядка нескольких миллионов. ■ Для эффективного разделения веществ методом КЭ особенно важен выбор оптимальных условий и учет всех взаимосвязанных факторов: р. Н, концентрация буферного раствора, природа лиганда, Т, напряжение и др. ■ Современные приборы обеспечивают воспроизводимость параметров 0, 2 – 3 %; диапазон линейности аналитического сигнала от концентрации составляет обычно три порядка и выше.
Белки и нуклеотиды
Белки и нуклеотиды
Селективность, эффективность и воспроизводимость КЭ n Смесь фрагментов ДНК можно проанализировать за 10 мин, используя капилляр длиной 35 см и внутренним диаметром 50 мкм в среде боратного буфера при напряжении на электродах 8 к. В с фотометрическим детектированием при 260 нм; классическим электрофорезом на полиамидном геле такой же анализ занимает около трех часов.
Капиллярный электрофорез белков
Капиллярный электрофорез сывороточных белков
Разделение 18 аминокислот при их концентрации 27 аттомоль КЭ n 1 -аргинин, 2 -лизин, 3 -лейцин, 4 -изолейцин, 5 -триптофан, 6 - метионин, 7 -фенилаланин, валин, гистидин, пролин, 8 треонин, 9 -серин, 10 -цистеин, 11 -аланин, 12 -глицин, 13 тирозин, 14 -глутаминовая кислота, 15 -аспаргиновая кислота.
Электрофорез в геле
Электрофорез в геле n Электрофорез белков в полиакриламидном геле — метод разделения смесей белков в соответствии с их электрофоретической подвижностью (функцией длины полипептидной цепочки или молекулярной массы, а также укладки белковой молекулы и других факторов).
Аффинная хроматография n Аффинная хроматография — разновидность лигандной. В основе последней лежит реакция взаимодействия разделяемых примесей с лигандом, связанным с инертным носителем. n В случае аффинной хроматографии в роли примесей выступают биологически активные вещества (белки, ферменты), вступающие с лигандом (тоже, как правило, органическим) в специфическое биохимическое взаимодействие. Например: антитело-антиген, гормонрецептор и т. д. n Антиген (белки, полисахариды) — это любая молекула, которая специфично связывается с антителом.
Антиген - антитело n Антитела - белки сыворотки крови и других биологических жидкостей, которые синтезируются в ответ на введение антигена и обладают способностью специфически взаимодействовать с антигеном, вызвавшим их образование.
Аффинная хроматография n Гормо ны — биологически активные вещества органической природы, вырабатывающиеся в специализированных клетках желёз внутренней секреции. n Реце птор — сложное образование, состоящее из терминалей, которые в комплексе обеспечивают превращение влияния факторов внешней или внутренней среды (раздражитель) в нервный импульс.
Аффинная хроматография
Аффинная хроматография
Аффинная хроматография
Аффинная хроматография
Аффинная хроматография протеинов
Аффинная хроматография DNA
Аффинная хроматография крови
Благодарю за внимание! ■ Знания -сила
Други виды Хроматографии.ppt