Питательные среды Приготовление Контроль качества Внутренний контроль

Питательные среды Приготовление. Контроль качества

Внутренний контроль качества непрерывная программа контроля работы лаборатории, основанная на анализе контроля качества с корректировкой исполнения, если это необходимо ISO 9000: 2000

Нормативные документы Методы контроля бактериологических питательных сред. МУК 4. 2. 2316 -08 от 18. 01. 2008 Организация внутреннего контроля качества санитарно-микробиологических исследований воды. МУ 2. 1. 4. 1057 -01 от 1. 10. 2001 Контроль диагностических питательных сред по биологическим показателям для возбудителей чумы, холеры, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза, легионеллеза. МУ 3. 3. 2. 2124 -06 от 17. 08. 2006

Нормативные документы ГОСТ Р ИСО 11133 -1 -2008 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Руководящие указания по приготовлению и производству культуральных сред. Часть 1. Общие руководящие указания по обеспечению качества приготовления культурных сред в лаборатории ГОСТ Р ИСО 11133 -2 -2008 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Руководящие указания по приготовлению и производству культуральных сред. Часть 2. Практические руководящие указания по эксплуатационным испытаниям культуральных сред ГОСТ Р ЕН 12322 -2010 Изделия медицинские для диагностики in vitro. Питательные среды для микробиологии. Критерии функциональных характеристик питательных сред

Классификация питательных сред по способу приготовления • Среда готовая к применению. • Культуральная среда, приготовленная из коммерческих сухих (обезвоженных) компонентов • Среды, приготовленные из индивидуальных ингредиентов ГОСТ Р ИСО 11133 -1 -2008

Среда готовая к применению • Большой объем нивелирует погрешности дозирования • Контроль качества исходных компонентов • Контроль качества готовой среды по всем параметрам • Условия транспортировки и хранения могут повлиять на качество среды !!!

Культуральная среда, приготовленная из коммерческих сухих (обезвоженных) компонентов • Регидратация среды производится в лаборатории Неустойчивые компоненты добавляют непосредственно перед применением Среда полностью готова к применению

Культуральная среда, приготовленная из коммерческих сухих (обезвоженных) компонентов • Большой объем нивелирует погрешности дозирования • Контроль качества исходных компонентов • Контроль качества готовой среды по всем параметрам • • Условия транспортировки и хранения Ошибки дозирования и приготовления Качество воды …

Среды, приготовленные из индивидуальных ингредиентов • Возможность приготовления среды по нестандартной прописи • Отсутствие контроля качества исходных компонентов • Высокая трудоемкость • Невозможно провести все необходимые контроли в лаборатории • …

Управление качеством • • • Транспортировка и хранение сухих сред Приготовление сред в лаборатории Контроль качества готовых сред Хранение готовых сред Утилизация сред

Документы • Покупка среды у производителя или авторизованного дилера гарантирует соблюдение правил хранения и транспортировки среды до потребителя • Документация, представляемая производителем: – – – – Наименование среды, компонентов; Код партии; Значение р. Н среды; Условия сранения и срок годности; Оценка эффективности и тест-штаммы; Свидетельство о контроле качества; Данные об опасности (при необходимости). • Документация в лаборатории (контрольная карта) – Наименование среды и код партии; – Дата получения и срок годности – Состояние упаковки. МУ 2. 1. 4. 1057 -01, ГОСТ Р ИСО 11133 -1 -2008

Хранение сред и компонентов • Организация потока при использовании ( «первым получено – первым израсходовано» ) • Сроки и условия хранения регламентируются изготовителем • Учет и контроль: – Дата первого вскрытия – Визуальный учет содержимого вскрытых контейнеров ГОСТ Р ИСО 11133 -1 -2008

Приготовление среды в лаборатории • Приготовление навески сухой среды • Растворение • Стерилизация • Коррекция р. Н • Добавление селективных и ростовых добавок

Взвешивание Целесообразно использовать электронные весы до 100 – 200 г с обнулением тары. Достаточна точность 0, 01 г.

Безопасность • То, что хорошо для микробов не всегда хорошо для нас – Азид натрия – очень токсичен – Селенит натрия – токсичен – Хлорид лития – опасен для здоровья – Теллурит натрия – очень токсичен – Циклогексимид – очень токсичен – Налидиксовая кислота – опасна для здоровья – …

Вода • Дистиллированная вода • Контроль качества - кондуктометрия (удельное сопротивление (300 к. Ом/см) или электропроводность (3 мк. С/см) • Деионизированная вода • Эффект обрастания ионообменных колонок – регулярная промывка (замена)

Растворение • Среды без агара (желатина) • Растворение в холодной воде • Среды с агаром (желатином) • Небольшой объем – нагревание на водяной бане при постоянном перемешивании • Большой объем – «готовим кисель» – Навеска вносится в 1/10 объема воды для набухания – Переносится в закипевшую воду тонкой струйкой при перемешивании

Стерилизация • Наиболее частый метод – автоклавирование – Не рекомендуется автоклавировать большие объемы (не 1 л, а 4 по 250 мл) – Не стерилизовать емкости значительно различающиеся по объему (пробирки отдельно от колб) – Режим стерилизации – как рекомендовано производителем – Быстро охладить • Не все среды нуждаются в стерилизации

Плавление агара (основы) • Водяная баня • Охладить до t=47± 2 0 C • Хранить в расправленном виде до 4 часов ГОСТ Р ИСО 11133 -1 -2008

Внесение добавок • Растворить добавку • Охладить среду • Согреть добавку (до комнатной температуры • Постоянное помешивание среды (без пенообразования) • Растворенные добавки не хранить • Повторное плавление среды после внесения добавки запрещено ГОСТ Р ИСО 11133 -1 -2008

Хранение сред. Факторы, влияющие на качество Воздействие света – фотохимические реакции Уменьшение объема Поверхностное подсыхание Разрушение компонентов среды Витамины, Аминокислоты, Антибиотики, …

Хранение сред. Сроки Как указано изготовителем или Как указано в нормативном документе (инструкции) или Не более недели Упаковка в полиэтиленовые пакеты или контейнеры Удаление конденсата Повторное подсушивание не допускается ГОСТ Р ИСО 11133 -1 -2008

Контроль готовой среды Физические (физико-химические) показатели р. Н среды Количество среды или толщина слоя Цвет Прозрачность (наличие примесей, пузырьков воздуха …) Стабильность, консистенция и влажность геля Контроль стерильности Микробиологические характеристики

Контроль и коррекция р. Н устанавливается при t = 25 0 С р. Н-метр или индикаторные полоски 1 N или 0, 1 N р-ры Na. OH и HCl Расчет на 50 мл среды

Измерение р. Н Жидкие среды Прямое определение при помощи р. Н-метра (с термокомпенсатором) Прямое определение индикаторными полосками с предварительным охлаждением раствора Агаровые среды Прямое определение при помощи р. Н-метра Экстрагирование из геля (2 г геля + 100 мл дистиллированной воды)

Контроль стерильности Выборка Малая партия 1 чашка (пробирка) в начале розлива 1 чашка (пробирка) – в середине 1 чашка (пробирка) – в конце Большая партия 1% чашек (пробирок) в начале розлива 1% чашек (пробирок) – в середине 1% чашек (пробирок) – в конце Инкубация не менее 18 час при 37 0 С или в условиях, предусмотренных для данной среды ГОСТ Р ИСО 11133 -2 -2008

Микробиологические показатели Абсолютные Чувствительность; Дифференцирующие свойства; Скорость роста; Относительные Извлекаемость (производительность) – для целевых микроорганизмов Селективность (ингибирование) - для нецелевых микроорганизмов.

Способы определения Качественные методы Полуколичественные методы Количественные методы

Тест-штаммы Тест-микроорганизмы – микроорганизмы, использующиеся для контроля качества и эффективности питательных сред (ГОСТ Р ИСО 11133 -1 -2008) Контрольный (эталонный) штамм – микроорганизм, для которого определен род и вид. Микроорганизм внесен в каталог и описаны его характеристики. Желательно знать его происхождение (ГОСТ Р ИСО 11133 -1 -2008 ссылка на ЕН 12322)* Контрольные (эталонные) культуры – культуры полученные в результате одного пересева контрольного штамма, имеющегося в лаборатории или полученного от поставщика (ГОСТ Р ИСО 11133 -1 -2008 ссылка на ЕН 12322)* Рабочая культура – первичная субкультура, полученная из контрольной культуры (ГОСТ Р ИСО 11133 -1 -2008) *В ГОСТ Р ЕН 12322 -2010 данные определения изложены иначе!

Тест-штаммы (по ГОСТ Р ЕН 12322 -2010) Контрольный штамм (control strain) Микроорганизм, применяемый для оценки микробиологических характеристик питательных сред Референтный штамм (эталонный штамм)(reference strain) Микроорганизм, определенный, как минимум, до уровня рода и вида включенный в каталог и паспортизированный Референтный образец (reference stock) Партия емкостей, полученная путем одного посева референтного штамма Образцовая культура (stock culture) Субкультура референтного образца Рабочая культура (working culture) Субкультура образцовой культуры

Тест-штаммы Набор контрольных штаммов должен включать в референтные штаммы. Набор штаммов для оценки питательных сред описан Международным комитетом по микробиологии и гигиене пищевых продуктов (WPCM) Culturemedia for Food. Microbiology. Progress in Industrial Microbiology, vol. 34 (1995)/Eds. Corry J. E. L. , Curtis, G. D. W. and Baird, R. M. Elsevier, Amsterdam Селективные среды • Целевой штамм с типичными свойствами • Целевой штамм с атипичными свойствами • Нецелевой (ингибируемый) штамм Дифференциальные среды • Положительный штамм • Слабо положительный штамм • Отрицательный штамм

Контрольные штаммы. Хранение и поддержание Контрольные штаммы из коммерческих источников хранятся и используются в соответствии с инструкцией производителя Контрольные штаммы, полученные в лаборатории должны храниться так, чтобы исключить возможность их контаминации, мутаций и изменения типичных характеристик. Наборы должны поддерживаться в нескольких образцах или храниться при – 700 С, или лиофильно высушиваться

Тест-штаммы от OXOID Quanti-Loop Quanti-Cult

Oxoid. “Quanti cult” Лиофильно высушенный эталонный штамм 3 1 Пассаж 2. Пробирки, приготовленные из «стартовых» культур Пассаж 1. Выращенная культура собирается и хранится при -70 0 С 2 Пассаж 3. Регидратировать культуру и использовать для контроля 4

Приготовление рабочей культуры • Рабочие культуры готовят из штаммов, входящих в контрольные наборы 1 пробирка контрольного штамма = 1 рабочая культура • Контрольный штамм суспендировать в неселективной среде • Инкубировать до стационарной фазы роста • Рабочие культуры нельзя субкультивировать, но можно использовать многократно в течение недели

Рекомендованные контроли Способ приготовления среды Перечень штаммов Способ контроля Коммерческие готовые среды Контроль среды не нужен Необходим контроль условий с сроков хранения и транспортировки Коммерческие сухие среды Один тест штамм для неселективных сред Полный набор (целевой, целевой атипичный и нецелевой штамм) Качественный или полуколичественный метод Среды лабораторного приготовления Один тест штамм для неселективных сред Полный набор (целевой, целевой атипичный и нецелевой штамм) Количественный метод ГОСТ Р ИСО 11133 -1 -2008

Приготовление рабочих разведений Оптический стандарт мутности (ОСО -42 -28 -85) = Тест-штамм 2 -го пассажа 0, 5 мл Стерильный физ. р-р по 4, 5 мл Разведения 10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5 10 -6 10 -7 10 -8

Стандарты «мутности» • • • Материал - стекло PYREX Срок годности – не более 1 года 10 ЕД ≈ 109 КОЕ/мл nd Mc. Farla ОС О • • • Материал – Сульфат бария Срок годности – не более 6 мес 0, 5 ЕД ≈ 108 КОЕ/мл

Стандарт Mc. Farland Концентрация бактерий, КОЕмл № стандарта мутности Ba. Cl 2 2 H 2 O, 1, 175% H 2 SO 4 1% 0. 5 ml 99. 5 ml 1 x 108 1 0. 1 ml 9. 9 ml 3 x 108 2 0. 2 ml 9. 8 ml 6 x 108 3 0. 3 ml 9. 7 ml 9 x 108 4 0. 4 ml 9. 6 ml 12 x 108 5 0. 5 ml 9. 5 ml 15 x 108 6 0. 6 ml 9. 4 ml 18 x 108 7 0. 7 ml 9. 3 ml 21 x 108 8 0. 8 ml 9. 2 ml 24 x 108 9 0. 9 ml 9. 1 ml 27 x 108 10 1. 0 ml 9. 0 ml 30 x 108

Лабораторные денситометры и нефелометры • Пользовательская калибровка (использование разных пробирок) • Воспроизводимость • Точность • Объективность

Рабочие культуры. Инокулят Производительность Селективность Чашечные среды количественный метод полуколичественный, качественный метод Пробирочные среды 102 КОЕ 104 – 106 КОЕ 103 – 104 КОЕ 101 – 102 КОЕ

Производительность. Количественный метод PR=NS/NO , где PR – коэффициент производительности, NS и NO – количество колоний, выросших на испытуемой и эталонной средах. Для неселективных сред этот коэффициент должен быть не менее 0, 7, а для селективных – 0, 1 в отношении целевых микроорганизмов. ГОСТ Р ИСО 11133 -2 -2008

Селективность. Количественны метод SF=Do-Ds SF – коэффициент селективности; Do и Ds – количество колоний (log) на эталонной и селективной среде Для нецелевых организмов > 2 ГОСТ Р ИСО 11133 -2 -2008

Методы посева • Количественные – Посев шпателем – Капельный посев – Глубинный посев • Полуколичественные – Штриховой посев • Качественные – Штриховой посев

Посев шпателем • Неконтролируемая сорбция бактерий на шпателе (стекло, пластик, металл, фторопласт) • Плохая воспроизводимость • Статистическая обработка не возможна

Капельный метод (Метод Miles & Misra) 20 мкл х 5 = 100 мкл = 0, 1 мл Возможность расчета ошибки Пуассона Хорошая воспроизводимость Технологичность …

Штриховой посев • Рост по штриху – 1 балл • Рост до половины штриха – 0, 5 балла • Слабый рост – 0 баллов • Gl – сумма баллов • Для неселективных сред Gl 6 для целевого штамма ГОСТ Р ИСО 11133 -2 -2008

Штриховой посев (качественный) • • • Петля 1 мкл Посев нескольких штаммов Отсутствие роста – 0 баллов Слабый рост – 1 балл Обильный рост – 2 балла

Великий и могучий русский язык ГОСТ Р ИСО 11133 -2 -2008 Разработаны количественные, полуколичественные и качественные методы испытаний твердых и жидких культуральных питательных сред. В большинстве случаев в лаборатории достаточно использовать полуколичественные и качественные методы В особых случаях, например при оценке новой среды или среды нового производителя, в лаборатории необходимо использовать количественные методы испытаний Наш перевод ГОСТ Р ИСО 11133 -2 -2008

Жидкие среды. Количественный метод • Параллельный посев в испытуемый и эталонный бульон • Объем бульона – 10 см 3 • Инокулят – Целевой штамм – 100 КОЕ – Нецелевой штамм - >1000 КОЕ – Смесь (Целевой штамм + Нецелевой штамм) • Инкубация • Количественный высев на чашки (желательно использование дифференциальной, но не селективной среды) ГОСТ Р ИСО 11133 -2 -2008

Жидкие среды. Количественный метод. Цели и трактовка результатов 1. Сравнение испытуемой среды и эталона • • • Расчет PR (разница не более одного порядка для целевого штамма) Расчет SF (разница более двух порядков для нецелевого штамма) В смешанных культурах целевой штамм должен доминировать) 2. Количественная характеристика среды • • Целевые микроорганизмы – 106 -108 КОЕ/мл Нецелевые микроорганизмы ≤ 104 КОЕ/мл (для селективного бульона) 3. Оценка разбавителей и транспортных сред • Отсутствие подавления или размножения ( 50% от внесенного количества как для целевого, так и для нецелевого микроорганизма) ГОСТ Р ИСО 11133 -2 -2008

Жидкие среды. Полуколичественный метод • Параллельный посев в испытуемый и эталонный бульон • Объем бульона – 10 см 3 • Инокулят – Нецелевой штамм - >1000 КОЕ – Смесь (Целевой штамм 10 -100 КОЕ + Нецелевой штамм >1000 КОЕ) • Инкубация • Штриховой высев петлей (10 мкл) – Смесь на селективный агар – Нецелевой штамм на неселективный агар ГОСТ Р ИСО 11133 -2 -2008

Жидкие среды. Полуколичественный метод. Оценка результатов • Удовлетворительная производительность – 10 колоний целевого штамма на селективной среде • Удовлетворительная селективность – ≤ 10 колоний нецелевого штамма на неселективной среде ГОСТ Р ИСО 11133 -2 -2008

Жидкие среды. Качественный метод 1. Рабочую культуру (без приготовления разведений) вносят в среду петлей на 1 мкл 2. Инкубация 3. Оценка роста по помутнению среды (0 – 2 балла) 4. Метод не применим для исходно мутных сред (тетратионатный бульон и т. п. ) ГОСТ Р ИСО 11133 -2 -2008

Ошибки

Слипание сухой среды • Слишком высокая влажность при хранении • Нарушение герметичности банки (пакета) • Слишком старая среда

Сдвиг р. Н • Вода не была нейтральной • Негерметично закрыта банка (пакет) • Среда перегрета в процессе приготовления • Слишком старая среда

Появление помутнения • • Вода плохо деминерализована Грязная посуда Неправильно установлено значение р. Н Компоненты содержали осаждающие компоненты (при самостоятельном приготовлении среды из отдельных компонентов) • Испарение влаги при хранении готовой среды

Среда слишком быстро затвердевает • Взято слишком много сухой среды • Неподходящий агар-агар

Слишком слабый гель • Взято слишком мало сухой среды • Неподходящий агар-агар • Перегрев среды приготовлении (сосбенно критично для сред с р. Н < 6, 0)

Изменение цвета • Неправильно установлено значение р. Н • Перегрев среды приготовлении или стерилизации (карамелизация сахаров) • Грязная посуда