ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ 1 Характеристика и классификация питательных

ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ 1

Характеристика и классификация питательных сред n n Для того чтобы определить микроорганизмы в исследуемом материале и изучить их свойства существует необходимость их выделения из исследуемого материала и дальнейшего культивирования ин витро От того, как осуществлен подбор состава среды, зависит возможность: выделения получения «чистых культур» изучения их морфологических и физиологических особенностей идентификации 2

Характеристика и классификация питательных сред (ПС) n обеспечение процессов роста и размножения микроорганизмов, которые должны Поэтому получать все вещества необходимые для биосинтеза клеточных компонентов и получения энергии имеет первостепенное значение 3

n n n История этого раздела микробиологической науки возникла одновременно с классическими исследованиями Пастера и Коха Кох, постулировав необходимость выделения чистой культуры микроба, определил необходимость создания условий для решения этой задачи Важнейшим из них явилась ПС, на которой можно было бы получить рост микроорганизма 4

Характеристика и классификация питательных сред n n Физиология микроорганизмов крайне многообразна Для обеспечения разнообразных типов метаболизма микроорганизмов питательные среды должны соответствовать следующим требованиям: 5

Общие требования к ПС Содержать все элементы, из которых строится клетка (макро и микроэлементы) Все элементы должны находиться в удобоусвояемой конкретным микроорганизмом форме При необходимости должны присутствовать факторы роста Иметь достаточную влажность (не менее 20% воды) Концентрация солей должна обеспечивать изотонию 6

Общие требования к ПС р. Н среды д. б. оптимальной для выращиваемого микроорганизма Окислительно восстановительный потенциал (ОВП) среды должен соответствовать потребностям микроорганизмов (для анаэробов – 0, 120 0, 060 В, для аэробов – более 0, 080 В) Питательная среда д. б. стерильной. 7

Характеристика и классификация питательных сред n n В результате длительного и широкого использования некоторые из ПС и схемы выделения и идентификации микроорганизмов на них можно назвать классическими Однако универсальных сред, пригодных для выделения любого микроорганизма не существует и не м. б. создано в принципе Ранее качественно количественный состав ПС подбирался эмпирически Сегодня, на основе знаний микробного метаболизма возможно постоянно улучшать качество ПС путем правильного подбора тех или иных компонентов 8

Чтобы ориентироваться в таком многообразии питательных сред их классифицируют с различных позиций Предназначение Состав Происхождение Консистенция Степень аэрации 9

Состав Натуральные Полусинтетические Синтетические 10

Натуральные ПС Преимущества Хороший рост микроорга низмов Недостатки Назначение Непостоянство состава Поддержание/н акопление биомассы Невозможно изучать св ва микрооргани Диагностика змов 11

Натуральные ПС n n n мясопептонный бульон мясопептонный агар картофельные среды…. 12

Натуральные ПС овощные или фруктовые соки, • животные ткани • яйцо Кровь, сыворотка крови • молоко • желчь Отвары и экстракты растительного и животного происхождения 13

Полусинтетические ПС (натуральные, неопределенного состава) Наряду с соединениями известной химической природы, входят вещества неопределенного состава мясопептонный бульон с глюкозой, среда Эндо, среда Сабуро Содержат соединения известного состава — угле воды, нитраты, фосфаты и другие и, в незначительных коли чествах, соединения неопределенного состава — гидролизат казеина, дрожжевой автолизат, кукурузный экстракт, вита мин, добавляемые в качестве факторов роста 14

Синтетические ПС Содержат только химически чистые соединения в точно указанных концентрациях, т. е. состав их полностью известен Наиболее удобны для исследования обмена веществ микроорганизмов Применяют, главным образом, для экспериментального изучения метаболизма микроорганизмов, реже для аналитических целей, диагностики и хранения культур 15

Предназначение общего на значения (универсальные) Специальные 16

Общего назначения ПС Для выращивания многих видов микроорганизмов и могут применяться в качестве основы для приготовления специальных ПС МПБ, МПА, бульон Хоттингера, агар Хоттингера, сусло жидкое, сусло агар и др. 17

Специальные назначения ПС Для избирательного культивирования определенных видов микроорганизмов, изучения их свойств и хранения 18

Специальные назначения ПС Обычные (МПА, МПБ) Консервирующие (Транспортные) Элективные Среды обогащения Дифференциально диагностические Среды для хранения культур 19

Среды обогащения n n n Среда Мюллера, среда Китта Тароцци, селенитовый бульон, тиогликолевая применяют для накопления определенной группы бактерий за счет создания условий, оптимальных для одних видов и неблагоприятных для других Наиболее часто в качестве подобных факторов применяют различные красители и химические вещества – соли желчных кислот, натрий тетратионат, калий теллурит, антибиотики, фуксин, генциановый фиолетовый, бриллиантовый зеленый и другие Как правило, среды обогащения по консистенции относятся к жидким 20

Элективные среды n n n Предназначены для: выделения микроорганизмов получения накопительных культур Они обеспечивают преимущественное развитие одного вида или группы микроорганизмов В основе избирательности среды лежит положительная и отрицательная селекция 21

Элективные среды n n n Эффект достигается путем создания оптимальных для микроорганизмов условий: р. Н концентрация солей состав питательных веществ Или путем добавления в среду веществ, угнетающих другие микроорганизмы (желчь, азид натрия, теллурит калия, антибиотики и др. ) Сопутствующие микроорганизмы или совсем не растут на таких средах, или развитие их в значительной степени задерживается 22

Дифференциальнодиагностические среды Для изучения биохимических свойств и дифференциации микроорганизмов по характеру их ферментативной активности Дифференцирующие свойства создаются внесением субстрата, к которому определяется отношение микроорганизма, например, сахаров, аминокислот и др. 23

Дифференциально-диагностические среды делят на 4 группы 1 2 • Содержат белки, дающие характерные изменения под действием бактериальных ферментов • Применяют для определения гемолитических или протеолитических свойств (кровяной агар, свернувшаяся лошадиная сыворотка) • Содержат индикаторы, углеводы или многоатомные спирты • Ферментативное расщепление приводит к сдвигу р. Н и изменению окраски среды (среды Гисса, Эндо, Левина, Мак. Конки и др. 24

Дифференциально-диагностические среды делят на 4 группы 3 • Для определения редуцирующей способности; содержат краски, которые обесцвечиваются при восстановлении, а также среды с нитратами для определения денитрифицирующей активности бактерий 4 • Среды, включающие вещества, ассимилируемые только определенной группой бактерий. Например, агар Симмонса 25

Др. Алан Рамбах – один из первых создателей хромогенных сред (1979) 26

Хромогенные готовые ПС n n n Основаны на выявлении специфических или уникальных ферментов микроорганизмов Различают жидкие, плотные и сухие Для обнаружения специфического фермента в состав среды включены хромогенные субстраты – вещества, при расщеплении которых образуются окрашенные продукты В результате хромогенная среда контрастно изменяет свой цвет при обнаружении искомого микроорганизма Большинство хромогенных сред также содержат селективные добавки, подавляющие рост нежелательных бактерий 27

Хромогенные среды Качество • Отсутствие роста не целевых микроорганизмов • Сокращение ложноположительных результатов Экономичность • Отсутствие последующих пересевов • Результат идентификация за 18— 24 часа • Идентификация от 2 х до 5 ти видов микроорганизмов одновременно Удобство в работе • Прямое внесения образца • Колонии отличаються яркой окраской • Простота учета результатов 28

Позволяет одноэтапно и одновременно выделять и идентифицировать бактерии: n n n E. сoli Proteus mirabilis Staph. aureus Enterococcus faecalis Klebsiella pneumonia Pseudomonas aeruginosa 29

n n Хромогенная среда Coli/Coliform Для выделения и подсчета E. coli и колиформных бактерий n n n Хромогенная среда Salmonella Для выделения и дифференциации Salmonella spp. (в т. ч. S. typhi) 30

n n Хромогенная среда Candida Для выделения и дифференциации C. albicans, C. tropicalis, C. krusei. n n Хромогенная среда Strepto В Простая ПС для выделения стрептококков группы В (Streptococcus agalactiae) 31

n n Хромогенная среда O. A. Listeria (Ottaviani Agosti) Для выделения и дифференцировани я Listeria monocytogenes (ISO 11290) n n n Хромогенная среда Т. В. Х. Для идентификации и подсчета ß D глюкуронидаз положительных E. coli в пищевых продуктах (ИСО 16649 2) 32

Транспортные ПС n n Предназначены для сохранения жизнеспособности микроорганизмов в период от момента взятия биоматериала до посева Основная цель — сохранить жизнеспособность возбудителя и предотвратить размножение сопутствующей микрофлоры в период транспортировки образцов (среды Стюарта, Амиеса) 33

Консервирующие ПС n Необходимы для поддержания жизнеспособности микроорганизмов в течение продолжительного периода для их защиты от неблагоприятных воздействий, которые могут иметь место при долгосрочном хранении (яичная среда Дорсета) 34

Некоторые исследователи выделяют: Восстановительные среды (активируют восстановление стрессовых и поврежденных микроорганизмов и их способность к нормальному росту без обязательной стимуляции размножения; например, буферизованная пептонная среда) Суспендиальная среда-для отделения микроорганизмов от испытуемого продукта в жидкую фазу Изолирующая среда (плотная или полужидкая среда) для поддержания роста микроорганизмов (МПА) 35

Некоторые исследователи выделяют: идентификационная среда, предназначенная для выработки идентификационной реакции, которая не требует дальнейших испытаний на соответствие (желчно эскулиновый агар) подтверждающая среда, предназначенная для того, чтобы частично или полностью провести идентификацию микроорганизмов после предварительной изоляции и/или обогащения (агар Клиглера) среды множественного использования, которые могут относиться к нескольким категориям (кровяной агар является восстановительной, изолирующей и дифференциально диагностической средой для определения гемолиза) 36

Консистенция Плотные Жидкие Полужидкие Сыпучие Сухие 37

Плотные среды (1, 5 -2% агара) n n n Широко используют для выделения чистых культур микроорганизмов Изучения морфологии колоний Для диагностических целей Хранения культур Количественного учета микроорганизмов 38

Полужидкие среды (0, 2 -0, 7% агара) Для хранения культур Для накопления биомассы (анаэробы) 39

Приготовление питательных сред n n n Для приготовления среды используют чистую, неповрежденную стеклянную посуду и дистиллированную или деионизированную воду Навеску помещают в подготовленную посуду, объём которой в 2 3 раза превышает окончательный объём готовой среды Понемногу добавляя воду, проводят постепенное растворение среды под визуальным контролем 40

Приготовление питательных сред n n n В некоторых случаях для полного растворения используют нагревание, избегая при этом продолжительного и чрезмерного нагрева и подгорания среды Обычно сухие среды, восстановленные с использованием дистиллированной или деионизированной воды, при 25°С имеют те значения р. Н, которые указаны на этикетке Тем не менее, рекомендуется проверять и при необходимости корректировать значение р. Н 41

Типичные ошибки: Отклонение р. Н Перегревание неполное перемешивание слишком длительная стерилизация использование щелочного стекла неочищенной воды повторное плавление гидролиз ингредиентов 42

Типичные ошибки: Неполное растворение Отклонение от инструкции по нагреванию агаровой среды Неполное перемешивание Слишком маленькая ёмкость для приготовления среды 43

Типичные ошибки: Потемнение Перегревание среды Чрезмерное количество сухой среды Плохое перемешивание 44

Типичные ошибки: Слишком мягкий гель Агар не растворился неполное перемешивание отклонение от инструкции восстановлению сухой среды по кислотный гидролиз агара избыточное разведение агара инокулюмом 45

Типичные ошибки: Потеря ростовых и дифференцирующих свойств Повторное плавление чрезмерное нагревание неполное перемешивание избыточное разведение среды инокулюмом неадекватный растворитель инокулюма и др 46

Типичные ошибки: Ненормальный цвет среды Непригодность сухой среды плохо вымытая посуда неочищенная вода 47

Типичные ошибки: Токсичность среды для микробов Плохо вымытая посуда неочищенная вода подгорание среды 48

Типичные ошибки: Контаминация среды микробами Неправильная/недостаточная стерилизация Неправильная техника введения добавок и розлива среды 49

Приготовление питательных сред Приготовленные среды разливают в чистую и сухую посуду n Закрывают ватно марлевыми пробками и стерилизуют согласно инструкции n Обычно стерилизацию проводят в автоклаве, 15 минут при 121° С n 50

Приготовление питательных сред n n Перед введением термолабильных добавок в простерилизованную среду ее необходимо остудить Добавки асептически вводят в жидкую среду, охлаждённую до комнатной температуры, или в питательный агар, охлажденный до 50 55°С согласно инструкции 51

Приготовление питательных сред n n Готовую ПС герметично укупоривают или тщательно перемешивают, не допуская образования пузырьков воздуха В асептических условиях разливают в пробирки, планшеты или чашки Петри Во избежание появления обильного конденсата на крышках чашек стерильные агаровые среды перед розливом должны иметь Т+ 45 50°С Перед посевом поверхность агаровых сред д. б. подсушена в асептических условиях при +30 40°С в термостате 52

Контроль качества питательных сред n С использование ПС осуществляются основные микробиологические исследования: - выделение - хранение культивирование микроорганизмов изучение их морфологических, культуральных и физиолого-биохимических свойств дифференциальная диагностика 53

Министерство здравоохранения Республики Беларусь ХРАНЕНИЕ, ПРИГОТОВЛЕНИЕ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ САНИТАРНОЙ МИКРОБИОЛОГИИ Инструкция по применению 54

ОРГАНИЗАЦИЯ ВНУТРЕННЕГО КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД n n Контроль качества ПС осуществляют сотрудники микробиологической (бактериологической) лаборатории, уполномоченные на это ее руководителем, в соответствии с требованиями настоящей Инструкции и порядком контроля качества ПС, действующим в данной организации. Контроль качества ПС включает следующие этапы: - входной контроль закупленной ПС - контроль условий хранения и сроков годности ПС n n - контроль ПС в процессе приготовления; - контроль ПС в процессе применения. Контроль показателей качества ПС и периодичность контроля ПС должны осуществляться на этапах их приобретения (закупки), хранения, приготовления согласно приложению 1 к настоящей Инструкции. Результаты контроля качества ПС на всех этапах должны быть документально оформлены. 55

ОРГАНИЗАЦИЯ ВНУТРЕННЕГО КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД Контроль качества ПС включает следующие этапы: контроль входной условий ПС в контроль хранения и процессе сроков закуплен приготовл годности ной ПС ения ПС контроль ПС в процессе примене ния 56

ОРГАНИЗАЦИЯ ВНУТРЕННЕГО КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД Комплект сопроводительных документов должен содержать: удостоверение о государственной гигиенической регистрации МЗ РБ паспорт ПС или иной документ, заменяю щий его копию протокола испытаний, подтверждаю щий необходимые биологические свойства ПС 57

В паспорте ПС д. б. приведена следующая информация: наименование и назначение ПС; наименование/адрес изготовителя поставщика номер серии; дата изготовления номер протокола контрольных испытаний; - срок годности; - состав ПС; - условия хранения - инструкция по приготовлению для сухих ПС; - описание внешнего вида и консистенции готовой или сухой и готовой ПС - условия и продолжительность хранения готовой среды 58

КОНТРОЛЬ УСЛОВИЙ И СРОКОВ ГОДНОСТИ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД n Сухие ПС и ингредиенты для приготовления ПС если условия их хранения не указаны в сопроводительных документах или маркировке n n необходимо хранить в сухом, защищенном от света месте с температурой воздуха от +2ºС до +25ºС в упаковке организации поставщика, исключая отрицательное воздействие условий окружающей среды 59

Контроль качества ПС Получаемые результаты и правильность выводов, сделанных на их основе, в первую очередь зависят от качества сред, стабильности их свойств Вместе с тем, различные серии сред, приготовленных даже по одному и тому же рецепту, могут различаться по питательной ценности или другим свойствам 60

Приготовление питательных сред n Максимальный срок хранения приготовленных ПС зависит от: типа питательной среды лабораторной посуды, в которую они разлиты 61

Примерные сроки хранения сред, (если они не относятся к средам для применения ex tempore) в посуде: 3 нед 2 3 мес. 1 нед. • пробирки с ватно марлевыми пробками • пробирки с плотно прилегающими пробками (резиновые, силиконовые, пластиковые) • бутылки с завинчивающимися крышками • чашки Петри в заклеенных пластиковых пакетах • чашки с питательными средами для определения чувствительности к АБ 62

Приложение 3 к Инструкции «Хранение, приготовление и контроль качества питательных сред для санитарной микробиологии» Сроки годности готовых питательных сред и стерильной посуды № п/п 1 Наименование Твердые среды 2 Полужидкие среды 3 Жидкие среды 4 5 Изделия простерилизованные в герметичной упаковке в пергаменте, бумаге мешочной пропитанной, бумаге мешочной влагопрочной, бумаге упаковочной высокопрочной (крафт), бумаге крепированной, стерилизационной коробке с фильтром В любой негерметичной упаковке, стерилизационной коробке без фильтра Сроки годности до 5 суток до 10 суток до 30 суток 20 суток Температура хранения +6± 2°С +18 -23 °С 3 суток 63

ПС, приготовленные в лаборатории, контролируются перед использованием по следующим физикохимическим и биологическим показателям (1 -2) внешний вид количество аминного азота (при необходимости) величина р. Н количество хлоридов (при необходимости) стерильность чувствительность минимальное время появления роста (в часах) 64

ПС, приготовленные в лаборатории, контролируются перед использованием по следующим физикохимическим и биологическим показателям (2 -2) стабильность основных биологических свойств микроорганизмов дифференцирущие свойства показатель ингибиции эффективность (при необходимости) показатель прорастания 65

Каждая приготовленная контролироваться лабораторией ПС должна испытательной внешний вид готовой ПС p. H готовой ПС стерильность (отсутствие контаминации) готовой ПС биологические свойства готовой ПС 66

Вопросы? 67