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Onde nel diagramma di Argand • Le onde F sono caratterizzate da una ampiezza Onde nel diagramma di Argand • Le onde F sono caratterizzate da una ampiezza |F| e da una fase f F = |F| exp 2 pif = |F| (cosf+isenf)

Scattering della luce Le particelle cariche vengono accelerate dai campi elettrici. Una particella carica Scattering della luce Le particelle cariche vengono accelerate dai campi elettrici. Una particella carica è una sorgente di un campo elettrico L’accelerazione di una particella carica perturba il campo elettrico. L’accelerazione di elettroni genera dei fotoni! Quando un elettrone interagisce con un onda elettromagnetica oscilla alla stessa frequenza dell’onda. Genera una radiazione elettromagnetica con la stessa frequenza. Processo chiamato ``scattering''.

Interferenza di onde elettromagnetiche Il risultato della somma di due onde coerenti (stessa frequenza) Interferenza di onde elettromagnetiche Il risultato della somma di due onde coerenti (stessa frequenza) dipende dalla differenza di fase (Interferenza). In fase (interferenza costruttiva) In opposizione di fase (interferenza distruttiva) Parzialmente fuori fase

Somma di onde nel diagramma di Argand Somma di due onde in fase Interferenza Somma di onde nel diagramma di Argand Somma di due onde in fase Interferenza costruttiva Ampiezza totale |F|t = 2|F| Somma di due onde non in fase Interferenza parzialmente distruttiva Ampiezza totale |F|t < 2|F| Somma di due onde in opposizione di fase Interferenza distruttiva Ampiezza totale |F|t = 0

5° 3° Distanza delle sorgenti 5 lunghezze d’onda 3 lunghezze d’onda 4° 2° 3° 5° 3° Distanza delle sorgenti 5 lunghezze d’onda 3 lunghezze d’onda 4° 2° 3° 2° 1° 1°

Il reticolo cristallino N atomi in cella N reticoli compenetrati con ai vertici gli Il reticolo cristallino N atomi in cella N reticoli compenetrati con ai vertici gli atomi equivalenti per traslazione

Riflessione 1’ 2 P O Interferenza costruttiva cammino ottico = cammino ottico 1 = Riflessione 1’ 2 P O Interferenza costruttiva cammino ottico = cammino ottico 1 = 2 riflessione

Legge di Bragg O P Interferenza costruttiva 2 dsen = n d Legge di Bragg O P Interferenza costruttiva 2 dsen = n d

Reticolo Reale Famiglia di piani -1 -1 Famiglia di piani 1 1 Famiglia di Reticolo Reale Famiglia di piani -1 -1 Famiglia di piani 1 1 Famiglia di piani -1 1 Famiglia di piani 1 -1 Famiglia di piani 0 2 Famiglia di piani 0 -2 Famiglia di piani 0 1 Famiglia di piani 0 -1 Famiglia di piani -2 0 Famiglia di piani -1 0 Famiglia di piani 2 0 Famiglia di piani 1 0 Reticolo Reciproco Riflesso -1 -1 Riflesso 1 1 Riflesso -1 1 Riflesso 1 -1 Riflesso 0 2 Riflesso 0 -2 Riflesso 0 1 Riflesso 0 -1 Riflesso -2 0 Riflesso -1 0 Riflesso 1 0

Reticolo diretto e reciproco a*┴ b a*┴ c a*=1/a b*┴ a c*┴ a b*┴ Reticolo diretto e reciproco a*┴ b a*┴ c a*=1/a b*┴ a c*┴ a b*┴ c c*┴ b b*=1/b c*=1/c

La sfera di Ewald Il reticolo reciproco è un utile concetto perchè si può La sfera di Ewald Il reticolo reciproco è un utile concetto perchè si può mostrare che l’immagine di diffrazione è una proiezione bidimensionale del reticolo reciproco tridimensionale d 2 senq/ = 1/dhkl Ogni volta che un punto hkl del reticolo reciproco interseca la sfera di Ewald, si origina un raggio diffratto hkl.

Legge di Bragg ed indici di Miller Interferenza costruttiva 2 dhklsen n(hkl) = n Legge di Bragg ed indici di Miller Interferenza costruttiva 2 dhklsen n(hkl) = n Piani reticolari in senso stretto n=ordine del riflesso 2 dn(hkl)sen n(hkl) = 2 dhklsen hkl = Indici di Miller qualsiasi intero 2 d 102 sen 2°(102) = 2 204 d 102 2 d 204 sen 204 = 204 d 204

origine e fase nel diagramma di Argan L’origine viene scelta per convezione su un origine e fase nel diagramma di Argan L’origine viene scelta per convezione su un elemento di simmetria

Riflessi con fase ristretta strutture centrosimmetriche: fasi = 0 o 180° riflessi di famiglie Riflessi con fase ristretta strutture centrosimmetriche: fasi = 0 o 180° riflessi di famiglie di piani paralleli ad assi di simmetria hanno fasi ristrette: ad esempio i riflessi h 0 l del sistema monoclino

Assenze sistematiche Riflessi di piani posti ortogonalmente rispetto ad una traslazione di ½ di Assenze sistematiche Riflessi di piani posti ortogonalmente rispetto ad una traslazione di ½ di ordine dispari hanno intensità nulla: es. 0 k 0 con k=2 n+1 in P 21 Riflessi di piani posti ortogonalmente rispetto ad una traslazione di ½ di ordine pari hanno intensità molto elevata: es. 0 k 0 con k=2 n in P 21

Simmetria nella diffrazione -hk-l hkl nel sistema monoclino i riflessi hkl hanno lo stesso Simmetria nella diffrazione -hk-l hkl nel sistema monoclino i riflessi hkl hanno lo stesso fattore di struttura dei riflessi –hk-l nel sistema ortorombico Fhkl=Fh-k-l=F-h-kl nel sistema tetragonale si aggiunge lo scambio degli indici Fhkl=Fkhl Simmetria delle diffrazione in una delle 32 classi cristalline

Legge di Friedel Se le specie atomiche di cui è formato il cristallo non Legge di Friedel Se le specie atomiche di cui è formato il cristallo non introducono una variazione di fase relativa dovuta allo scattering (fattore di scattering senza componente immaginaria o cristalli formati da una sola specie chimica) hkl -h-k-l |Fhkl|=|F-h-k-l| fhkl=-f-h-k-l Ihkl=I-h-k-l Trascurando le piccole differenze di fase dovute allo scattering anomalo nelle intensità di diffrazione è sempre presente il centro di simmetria Simmetria di diffrazione nelle 11 classi Laue

Registrazione dello spettro di diffrazione cristallo fascio raggi X sorgente di raggi X diffrazione Registrazione dello spettro di diffrazione cristallo fascio raggi X sorgente di raggi X diffrazione rivelatore goniometro La direzione dei raggi-X diffratti è relazionata attraverso la legge di Bragg ai parametri della cella elementare del cristallo le intensità sono caratteristiche del tipo di atomi e della posizione relativa di essi nella cella elementare.

Raccolta Dati 2 Raccolta Dati 2

Indicizzazione = assegnare l’indice HKL a tutte le riflessioni = determinare il reticolo reale Indicizzazione = assegnare l’indice HKL a tutte le riflessioni = determinare il reticolo reale (cella elementare) mediante il reticolo reciproco 1. 13 0. 95

Mosaicità In linea di principio i punti di un reticolo reciproco ottenuti da un Mosaicità In linea di principio i punti di un reticolo reciproco ottenuti da un cristallo di dimensioni infinite sono dei punti matematici, in pratica questo non è vero sia perché il cristallo è finito sia perché. • Il monocristallo può essere visto come composto di molti domini parzialmente disalineati. • I vari domini (che diffrangono per gli stessi angoli di Bragg) vengono messi in diffrazione in tempi ed angoli di rotazione del cristallo diversi. • L’intensità del singolo riflesso è generalmente distribuita secondo una gaussiana.

Danno da Radiazione • I cristallo della proteina vengono danneggiati dall'esposizione al fascio di Danno da Radiazione • I cristallo della proteina vengono danneggiati dall'esposizione al fascio di raggi X. • I danni da radiazione causano una riduzione della vita dei cristalli • Si osserva questo sia come riduzione dell’angolo massimo di diffrazione sia dal pegioramento del profilo dei singoli riflessi. • Si possono rompere i ponti disolfuro e si possono perdere i gruppi carbossilici di acido aspartico o glutammico esposti • I danni dipendono dalla dose dei raggi X assorbita e dall'energia dei fotoni ricevuti. • I raggi X promuovono la radiolisi delle molecole di acqua che può portare a danni nella proteina chimicamente generati dai radicali. • Lo sviluppo dei radicali può essere ridotto congelando i cristalli della proteina a bassa temperatura (100 K)

Criocongelamento - Per evitare il decadimento si sottopone il cristallo a temperature molto basse Criocongelamento - Per evitare il decadimento si sottopone il cristallo a temperature molto basse per esempio usando un flusso di N 2 liquido (tipicamente a 100 K). - Prima del congelamento è necessario aggiungere al liquido madre un crioprotettore ossia una sostanza che alle basse temperature forma un vetro amorfo, impedendo la formazione di cristalli di ghiaccio che danneggerebbero il cristallo. Uno screening è effettuato utilizzando diversi crioprotettori a diverse concentrazioni per trovare le migliori condizioni. goccia Il cristallo viene “pescato” in un loop di nylon di dimensione opportuna e velocemente immerso nel criostream

RACCOLTA DEI DATI DI DIFFRAZIONE: SISTEMA CRIOGENICO • Raccolta dei dati di diffrazione a RACCOLTA DEI DATI DI DIFFRAZIONE: SISTEMA CRIOGENICO • Raccolta dei dati di diffrazione a bassa temperatura grazie all’utilizzo di un sistema criogenico (flusso continuo di azoto a 100 -150 K) • Prelievo dei cristalli dalle soluzioni di cristallizzazione per mezzo di anelli (loop) di nylon Questo metodo permette di: • prevenire il deterioramento del cristallo dovuto alla radiazione • evitare la perdita di solvente dal cristallo • ridurre i moti termici degli atomi Estremamente importante la scelta del crioprotettore per evitare la formazione di ghiaccio

Montaggio dei cristalli Montaggio in capillare di vetro Montaggio mediante loop Testina goniometrica Montaggio dei cristalli Montaggio in capillare di vetro Montaggio mediante loop Testina goniometrica

Metodi di Raccolta Dati • I diversi metodi dipendono da – Monocromaticità o no Metodi di Raccolta Dati • I diversi metodi dipendono da – Monocromaticità o no della luce – La geometria di raccolta dati – Il tipo di detector, mono o bidimensionale • Policromatica – Metodo Laue • Monocromatica – Metodo del Cristallo Rotante

Metodo del Cristallo Rotante • Il cristallo viene ruotato intorno ad un asse generico Metodo del Cristallo Rotante • Il cristallo viene ruotato intorno ad un asse generico in modo da portare in diffrazione un certo numero di riflessi • E’ il metodo standard della raccolta di dati per le macromolecole • Il setup più semplice consiste in un fascio di raggi X monocromatico un goniometro con un singolo asse di rotazione ortogonale al fascio incidente e un rivelatore piano bidimensionale. Il rivelatore è normalmente posto in modo parallelo all'asse di rotazione e ortogonale al fascio incidente.

Geometria • Il cristallo viene ruotato intorno all'asse del goniometro di determinato angolo • Geometria • Il cristallo viene ruotato intorno all'asse del goniometro di determinato angolo • . I raggi X diffratti sono raccolti dal rivelatore dietro il cristallo • La rotazione è ripetuta per intervalli di angoli contigui fino che tutto la parte indipendente del reticolo reciproco viene esplorata

Simulazione dell’esperimento di diffrazione Rivelatore Sorgente dei raggi X Simulazione dell’esperimento di diffrazione Rivelatore Sorgente dei raggi X

Metodo di rotazione Per una particolare orientazione del cristallo solo alcuni riflessi saranno in Metodo di rotazione Per una particolare orientazione del cristallo solo alcuni riflessi saranno in posizione di diffrazione. Per misurare più riflessi il cristallo è ruotato (e con esso il suo reticolo reciproco) intorno ad un singolo asse per un angolo di oscillazione D durante il quale si registra l’immagine di diffrazione sul rivelatore. La rotazione è ripetuta per D contigui finche’, data l’orientazione del cristallo, almeno l’unità asimmetrica del reticolo reciproco è completamente raccolta. “lune” Riflessi dallo stesso piano del reticolo reciproco formano una “luna”

Raccolta dati per le proteine: problematiche Intensità diffratte sono deboli grandi celle elementari deboli Raccolta dati per le proteine: problematiche Intensità diffratte sono deboli grandi celle elementari deboli diffusori (atomi C, N, O) alta % solvente- mosaicitá Cristallo = mosaico di cristalliti Gran numero di riflessi da registrare grandi celle elementari Danneggiamento da esposizione alla radiazione: la radiazione ionizzante promuove la formazione di radicali liberi che danneggiano chimicamente la proteina. riduzione della vita media di un cristallo: dimunuzione delle intensità misurate (riduzione della massima risoluzione) e peggioramento della forma del riflesso.

Obiettivi di una raccolta dati Massimizzare il numero di riflessi ad alto angolo (massima Obiettivi di una raccolta dati Massimizzare il numero di riflessi ad alto angolo (massima risoluzione) Alta completezza dei dati % dei riflessi misurati rispetto a quelli teorici contenuti nell’unità asimmetrica del reticolo reciproco. Tale unità asimmetrica è definita dalla simmetria del gruppo spaziale del cristallo + centro di inversione (legge di Friedel) – riflessi unici. Il numero di riflessi dipenderà anche dalla risoluzione effettiva (d) cui diffrange il cristallo (N 1/d 3). Alta ridondanza Il riflesso hkl o i riflessi ad esso relazionati per simmetria (stessa intensità) sono misurati più volte per migliorare l’accuratezza della misura Alto rapporto segnale/fondo : Ihkl/s(Ihkl)

Fasi della raccolta dati 1. Messa a punto dei parametri della raccolta dati 2. Fasi della raccolta dati 1. Messa a punto dei parametri della raccolta dati 2. Indicizzazione 3. Integrazione dei riflessi 4. Scalaggio e analisi della qualità dei dati

Parametri della raccolta dati ü Lunghezza d’onda ü Distanza cristallo-detector ü Angolo di oscillazione Parametri della raccolta dati ü Lunghezza d’onda ü Distanza cristallo-detector ü Angolo di oscillazione D ü Tempo di esposizione ü Intervallo di rotazione totale

Distanza cristallo-detector ( D ) Quanto più vicino è il detector, tanto maggiore è Distanza cristallo-detector ( D ) Quanto più vicino è il detector, tanto maggiore è l’angolo di Bragg intercettato dal detector stesso Bisogna valutare la massima risoluzione effettiva cui diffrange il cristallo Altri fattori da considerare: Possibile sovrapposizione degli spot Aumentando D, aumenta la distanza tra gli spot (importante per celle elementari con assi lunghi) Assorbimento dei raggi X da parte dell’aria (sopratutto nel caso di raccolte “in-house”) Aumentando D, aumenta l’assorbimento e dunque diminuisce l’intensità Rapporto segnale/fondo Aumentando D, aumenta rapporto segnale/fondo perchè diminuisce lo scattering del background misurato (scattering random da parte dell’aria, del materiale che costituisce il “montaggio”, scattering anelastico del cristallo)

Tempo di esposizione In teoria, quanto maggiore è il tempo di esposizione tanto maggiore Tempo di esposizione In teoria, quanto maggiore è il tempo di esposizione tanto maggiore è l’intensità diffratta e maggiore è il rapporto Ihkl/s(Ihkl) misura più accurata [ In un esperimento di diffrazione si “conta” il numero dei fotoni che incidono sui pixel del rivelatore in un dato ammontare di tempo. Questo è un processo regolato da leggi probabilistiche: distribuzione di Poisson, detta anche “statistica dei conteggi”. La deviazione standard di una variabile che presenta una distribuzione di Poisson è data dalla radice quadrata del numero di conteggi misurato. Dunque se l’intensità raddoppia (2 Ihkl) per effetto del più lungo tempo di esposizione, la sua deviazione standard s(Ihkl) diventerà √ 2 Ihkl e il rapporto I/s aumenterà di √ 2. ] In pratica ci sono altri fattori da considerare nella scelta del tempo di esposizione: 1. danneggiamento da radiazione, nel caso di raccolte dati a temperatura ambiente o anche nel caso di basse temperature ma usando linee di sincrotrone molto intense 2. “overloads”, ossia riflessi che vanno in saturazione (i rivelatori hanno un range dinamico, ossia esiste un numero di conteggi (fotoni) che satura i pixel detector) 3. limitazioni di tempo a disposizione per la raccolta dati Tipici tempi di esposizione per immagine (con D =1⁰) variano da 15 -30 min con un detector “image plate” su sorgenti convenzionali, a pochi secondi con un detector CCD su sorgenti di sincrotrone

Intervallo angolare di rotazione totale Il minimo intervallo di gradi di rotazione da ricoprire Intervallo angolare di rotazione totale Il minimo intervallo di gradi di rotazione da ricoprire è dettato dalla simmetria del gruppo spaziale del cristallo e dall’orientazione del cristallo rispetto al fascio dei raggi X. Nel caso in cui non si misura segnale anomalo (la legge di Friedel e’ valida), il minimo intervallo necessario non può essere maggiore di 180⁰. Se il cristallo non presenta un sensibile decadimento per esposizione ai raggi X, la acquisizione di misure ridondanti migliora la qualità del set di dati

Riduzione dati Indicizzazione dei riflessi: ogni spot è associato ad un punto del reticolo Riduzione dati Indicizzazione dei riflessi: ogni spot è associato ad un punto del reticolo reciproco hkl. Si determina così l’orientazione del cristallo rispetto ad una terna di assi di riferimento e le dimensioni della cella elementare 205 105 206 118 207 208 139 307 308 309 316 425 415 524 525 -213 -214 -224

Volume di Matthews e stima del numero di molecole presenti nella cella Vcella= volume Volume di Matthews e stima del numero di molecole presenti nella cella Vcella= volume della cella in Å Z = numero di molecole in cella Mr= peso molecolare della proteina mediana 2. 52 Å3/Dalton 50% solvente

Integrazione Si integrano le intensità dei riflessi Intensità dei pixel che costituiscono il riflesso Integrazione Si integrano le intensità dei riflessi Intensità dei pixel che costituiscono il riflesso

Intensità di diffrazione: H K L I Sig(I) Integrazione Intensità di diffrazione: H K L I Sig(I) Integrazione

Scalatura e Merging • Tutti i punti integrati dalle differenti immagini sono messi su Scalatura e Merging • Tutti i punti integrati dalle differenti immagini sono messi su una scala comune. • Le riflessioni parziali (la cui intensità viene raccolta in più immagini) sono sommate insieme. • Le riflessione riferite per simmetria vengono mediate Si ottiene un dataset finale che sarà utilizzato per i successivi step della determinazione della struttura tridimensionale della macromolecola.

QUALITA’ DEI DATI Numero dei riflessi unici (riflessi indipendenti) Numero totali dei dati raccolti QUALITA’ DEI DATI Numero dei riflessi unici (riflessi indipendenti) Numero totali dei dati raccolti La consistenza interna (R_merge) La completezza (funzione dei dati teorici) Il numero (o frazione) delle misure rigettate dalla statistica L’Intensità media / deviazioni standard RISOLUZIONE dmim = /2 sen max Rmerge = ∑hkl ∑i | Ii(hkl) - | / ∑hkl | | In generale, quanto minore è l’Rmerge tanto migliore è il set di dati, ma bisogna ricordare che questo indice è influenzato dalla ridondanza dei dati (aumenta all’aumentare della ridondanza).

Lo Scattering di un atomo f( ) Z so 2 tp r o q Lo Scattering di un atomo f( ) Z so 2 tp r o q s 1 2 0 S Consideriamo una onda scatterata al punto p da un piccolo volume dv con densità elettronica r(r). L’onda avrà ampiezza r(r)dv (elettroni presenti nel volume infinitesimo dv) e fase relativa all’origine O che dipenderà dalla differenza di cammino ottico t-q = rso-rs. L’onda scatterata è quindi r(r)exp(2 pir. S)dv dove S=so-s=2 senq/ Il totale dell’onda scatterata da un atomo è l’integrale su tutto il volume dell’atomo: f(S) = ∫vol. atomo r(r)exp(2 pir. S)dv Per S = 0, f(0) = Z il numero di elettroni dell’atomo.

Lo Scattering dell’unità cristallograficamente indipendente (risultato dell’interferenza dei N reticoli compenetrati definiti da N Lo Scattering dell’unità cristallograficamente indipendente (risultato dell’interferenza dei N reticoli compenetrati definiti da N atomi non relazionati da simmetria) O r 1 1 r 2 r 3 3 2 Lo Scattering dell’atomo 1 è f 1 = f 1 exp(2 pir 1. S) dove f 1 è fattore atomico di scattering per l’atomo 1 Il totale dell’onda scatterata è F(S) = f 1 + f 2 + f 3 + … f. N F(S) = ∑ fj exp(2 pirj. S) dove la sommatoria è j =1 to N

Rappresentazione del Fattore di struttura Cella unitaria 1 F(h, k, l) = V 1 Rappresentazione del Fattore di struttura Cella unitaria 1 F(h, k, l) = V 1 1 ò ò ò r (x, y, z). exp[2 pi(hx + ky + lz)]. dxdydz |F| intensità F colore x =0 y =0 z = 0 Un riflesso Densità elettronica TRASFORMATA DI FOURIER F(h, k, l) = ∑j fj exp 2 pi (hxj + kyj + lzj) = |F(hkl)|expia(hkl) = A(hkl) +i. B(hkl) |F(hkl)| è l’ampiezza e a(hkl) è la fase Ogni fattore di struttura è la somma vettoriale della dispersione di ogni atomo 2 pi(hxj+kyj+lzj) fj e F(hkl) http: //www. ysbl. york. ac. uk/~cowtan/fourier. html Diagramma di Argand

Densità elettronica ANTITRASFORMATA DI FOURIER DEI FATTORI DI STRUTTURA SINTESI DI FOURIER : F Densità elettronica ANTITRASFORMATA DI FOURIER DEI FATTORI DI STRUTTURA SINTESI DI FOURIER : F ( r ) = (1 / V) ∑r*| F(r*) | cos [ 2 p i r • r * - a hkl ] SPAZIO DIRETTO SPAZIO RECIPROCO Trasformata di Fourier DENSITA’ ELETTRONICA FATTORI DI STRUTTURA

Problema della fase |F|(gatto) Immagine di diffrazione Trasformata di Fourier f(gatto) ? |F|(gatto), f(gatto) Problema della fase |F|(gatto) Immagine di diffrazione Trasformata di Fourier f(gatto) ? |F|(gatto), f(gatto)

Importanza relativa della fase ed ampiezza Trasformata di Fourier |F|(gatto), f(gatto) Trasformata di Fourier Importanza relativa della fase ed ampiezza Trasformata di Fourier |F|(gatto), f(gatto) Trasformata di Fourier |F|(papera), f(papera) Trasformata di Fourier |F|(gatto), f(papera) Trasformata di Fourier |F|(papera), f(gatto)

Determinazione della Fase Quattro metodi principali possono essere sfruttati per determinare la fase delle Determinazione della Fase Quattro metodi principali possono essere sfruttati per determinare la fase delle riflessioni diffratte: • I metodi diretti Si basa sui rapporti fra le fasi di triplette di riflessi forti: ad insiemi di riflessioni sono assegnati set di fasi a caso ma consistenti con le relazioni delle triplette. Usato universalmente per la cristallografia di piccole molecole. Applicabile per piccole proteine e dati a risoluzione atomica • La sostituzione molecolare (Molecular Replacement) Quando la molecola cristallizzata assomiglia ad una struttura già conosciuta, si possono valutare le fasi dopo aver correttamente posizionato nella cella la struttura nota. Applicabile solo se si conosce il folding della proteina • La sostituzione isomorfa (Isomorphous Replacement) La perturbazione della diffrazione ottenuta introducendo degli atomi extra alla struttura può fornire informazioni sulle fasi. Per applicare questo metodo si devono preparare diversi cristalli isomorfi contenenti degli atomi pesanti • La dispersione anomala Nei cristalli non-centrosimmetrici, quando una specie presente nella cella ha uno spigolo di assorbimento vicino all’energia della radiazione incidente, si perde la legge di Friedel. Le differenze nell'intensità fra le coppie di Bijvoet (hkl; -h-k-l) possono essere sfruttate per dedurre le informazioni di fase. Applicabile usando opportune lunghezze d’onda della radiazione incidente in presenza di un diffusore anomalo

La funzione Patterson P(uvw) = 1/V ∑h∑k∑l I(hkl) exp(-2 pi(hu + kv + lw) La funzione Patterson P(uvw) = 1/V ∑h∑k∑l I(hkl) exp(-2 pi(hu + kv + lw) “Struttura” Y B A C • La funzione Patterson è la trasformata di Fourier dell’intensità di diffrazione N atomi X “Patterson” • La Patterson può essere calcolata direttamente dalle intensità misurate senza conoscere la fase • I massimi della funzione Patterson rappresentano la mappa dei vettori interatomici della struttura V AB U AC BC N(N-1) vettori interatomici

Interpretazione della Patterson Gruppo spaziale P 212121 1 atomo indipendente 4 atomi in cella Interpretazione della Patterson Gruppo spaziale P 212121 1 atomo indipendente 4 atomi in cella Posizioni Equivalenti x, y, z -x+1/2, -y, z+1/2 -x, y+1/2, -z+1/2 x+1/2, -y+1/2, -z

Patterson Teorica x, y, z -x+1/2, -y, z+1/2 -x, y+1/2, -z+1/2 x+1/2, -y+1/2, -z Patterson Teorica x, y, z -x+1/2, -y, z+1/2 -x, y+1/2, -z+1/2 x+1/2, -y+1/2, -z 0, 0, 0 -2 x+1/2, -2 y, 1/2 -2 x, 1/2, -2 z+1/2 1/2, -2 y+1/2, -2 z 0, 0, 0 -1/2, 2 y+1/2, -2 z 2 x, 1/2, -2 z-1/2 2 x-1/2, 2 y, -1/2 -x, y+1/2, -z+1/2 2 x, -1/2, 2 z-1/2 1/2, -2 y-1/2, 2 z 0, 0, 0 2 x+1/2, -2 y, -1/2 x+1/2, -y+1/2, -z -1/2, 2 y-1/2, 2 z -2 x, -1/2, 2 z+1/2 -2 x-1/2, 2 y, 1/2 0, 0, 0

Molecular Replacement (MR) Se prevediamo (o sospettiamo) che la nostra struttura in esame sia Molecular Replacement (MR) Se prevediamo (o sospettiamo) che la nostra struttura in esame sia simile ad una struttura conosciuta (identità di sequenza più del 30%), allora possiamo usare questa struttura molecolare 3 D come modello di partenza per ottenere la struttura cristallina sconosciuta. Questo processo viene generalmente svolto in due passaggi 1) La funzione rotazione confronta due Patterson: -sperimentale dai dati di diffrazione -calcolata dal modello di prova orientato in modi diversi in una cella arbitraria L’orientazione che dà il migliore accordo tra la Patterson calcolata e quella osservata identifica la rotazione da dare alle coordinate “modello di prova” “modello orientato” Funzione Rotazione A “Soluzione del Molecular Replacement” Funzione Traslazione B B C 2) La funzione traslazione confronta due Patterson: -sperimentale dai dati di diffrazione -calcolata dal modello già orientato e traslato in modi diversi nella cella della struttura in esame La traslazione che dà il migliore accordo tra la Patterson calcolata e quella osservata identifica la posizione della molecola nella cella B A C

Isomorphous Replacement (SIR, MIR) F(hkl) = ∑j fj exp 2 pi (hxj + kyj Isomorphous Replacement (SIR, MIR) F(hkl) = ∑j fj exp 2 pi (hxj + kyj + lzj) 1) Misura dei |FP(hkl)| della proteina nativa 2) Aggiunta di atomi pesanti nella struttura della proteina e misura dei |FPH(hkl)| 3) FPH(hkl) = FP(hkl) + FH(hkl) Dalla Patterson differenza si ricava la posizione degli atomi pesanti e si calcola i FH(hkl) modulo e fase 4) Dalla relazione FPH(hkl) - FH(hkl) = FP(hkl) si ricava la fase a. P(hkl). FH(hkl) FPH(hkl) a. P(hkl) Ma ci sono due soluzioni!! -FH(hkl) 5) L’ambiguità della fase può essere risolta: a) Usando entrambe le fasi (SIR) per costruire una mappa che verrà “pulita” mediante tecniche di Density Modification b) Preparazione di un secondo derivato isomorfo (MIR) c) Utilizzando la diffusione anomala (SIRAS)

Preparazione dei derivati con atomi pesanti 1) Immersione dei cristalli di proteina (Soaking) in Preparazione dei derivati con atomi pesanti 1) Immersione dei cristalli di proteina (Soaking) in una soluzione che contiene ioni o molecole di atomi pesanti (es. , lo ione mercurio si lega ai gruppi tiolici esposti) oppure Co-cristallizzazione della proteina con ioni o molecole pesanti. 2) Produzione della proteina ricombinante in E. coli con le metionine ripiazzate da seleniometionine. Banca Dati degli atomi pesanti HAD http: //www. bmm. icnet. uk/had

Come possono pochi atomi pesanti modificare in modo significativo i fattori di struttura di Come possono pochi atomi pesanti modificare in modo significativo i fattori di struttura di una proteina? Proteina di 115 a. a ~ 115*110=12600 Dalton ~ 12600/14=900 atomi non-H Se consideriamo gli atomi distribuiti casualmente |FP|~ √(N) fj = √ 900 fj =30 fj fj dipende dal numero atomico Gli atomi non-H della proteina sono prevalentemente C, N, O con z = 6, 7, 8 Gli atomi pesanti possono avere molti più elettroni (Pt z = 78; Hg z=80; Pb z = 82; U z = 92; Se z = 34; Br z = 35). L’introduzione di un singolo atomo pesante ha un effetto significativo ad esempio |FH|/|FPH| ~ 30% con 1 atomo di Hg in una proteina di 12. 6 k. Dalton

Diffusione Anomala Imaginaria Per la dispersione distante dallo spigolo di assorbimento, il fattore atomico Diffusione Anomala Imaginaria Per la dispersione distante dallo spigolo di assorbimento, il fattore atomico di scattering può essere rappresentato come un numero reale: Se i raggi X hanno un'energia che è vicino ad una transizione elettronica dell’atomo, la parte reale della dispersione si modifica con f’ e la fase con f” fj = f 0 + f’ + if” • • f 0 Reale Imaginaria f” f’ f 0 Se fj è reale, vale sempre legge di Friedel |F(hkl)| = |F(-h-k-l)| |F(hkl)|2 = I(hkl) = I(-h-k-l) Se fj ha una componente immaginaria, allora in generale |F(hkl)| ≠ |F(-h-k-l)| Reale

Dalle coppie di Friedel alle coppie di Bijvoet i. B f” kl) FH (h Dalle coppie di Friedel alle coppie di Bijvoet i. B f” kl) FH (h H FP f’ l) (hk FP FP ( -h- k-l ) FP ( H -hk-l) FH A

Risoluzione del problema della fase mediante la diffusione anomala FH(hkl) FP(hkl) -FH(hkl) FPH(-h-k-l) -FH(-h-k-l) Risoluzione del problema della fase mediante la diffusione anomala FH(hkl) FP(hkl) -FH(hkl) FPH(-h-k-l) -FH(-h-k-l) FP(-h-k-l) FH(-h-k-l)

Scelta della lunghezza d’onda 4 21 3 • Generalmente, dopo la racconta dello spettro Scelta della lunghezza d’onda 4 21 3 • Generalmente, dopo la racconta dello spettro di fluorescenza le lunghezze d'onda utilizzate per la raccolta dati per esperimenti MAD vengono scelte in questo ordine: • 1) lunghezza d'onda del picco: massima differenza delle coppie di Bijvoet • 2) punto di flessione: minimo della f’ • 3) un valore ad alta energia: massimo della f’ • 4) un valore a bassa energia: massimo alternativo della f’ con la minima f”, dati che mancano delle differenze di Bijvoet. Il Selenio ha lo spigolo di assorbimento ad una lunghezza d’onda ottimale per la diffrazione http: //www. bmsc. washington. edu/scatter

Confronto tra mappe MIR e MAD La raccolta dati su più cristalli della tecnica Confronto tra mappe MIR e MAD La raccolta dati su più cristalli della tecnica MIR con le relative problematiche di non perfetta isomorficità dei cristalli rende generalmente le relative mappe Patterson differenza più “sporche” delle corrispondenti Mappe anomale ottenuta dalla tecnica MAD Patterson differenza |FPH-FP|2 Patterson Anomala |FPH(hkl)-FPH(-h-k-l)|2 Tuttavia anche l’uso di sorgenti moto brillanti porta al danneggiamento piuttosto rapido dei cristalli con la conseguenza che anche i data sets raccolti a diverse lunghezze d’onda della tecnica MAD portano a mappe piuttosto “sporche” Recentemente dopo lo sviluppo di software opportuni si è visto che è possibile determinare la struttura altrettanto bene (se non addirittura meglio) usando il singolo gruppo di dati raccolto alla lunghezza d'onda di picco (SAD).

Localizzazione degli atomi pesanti Direttamente a mano dalle Mappe Pattersons Se il numero di Localizzazione degli atomi pesanti Direttamente a mano dalle Mappe Pattersons Se il numero di atomi pesanti da localizzare è piccolo, i siti possono essere trovati direttamente a mano utilizzando o la Patterson differenza del derivato isomorfo (calcolata con i coefficienti |FPH|-|FP|) o la Patterson differenza anomala (calcolata con i coefficienti |F(hkl)|-|F(-h-k-l)|) ed usando l’arcana magia delle sezioni di Harker Utilizzando programmi che risolvono le Patterson In presenza di tantissimi siti, dati difficili, bassa occupazione e simmetria complicata del gruppo spaziale può essere difficile la risoluzione a mano delle mappe Patterson. Diversi programmi sono disponibili per aiutare ad interpretare la funzione Patterson: SHELX, RSPS, SOLV, VECSUM etc. Mediante metodi diretti I metodi diretti di determinazione delle fasi delle intensità di diffrazione è basato sul presupposto della atomicità della struttura: Anche se questo presupposto non è valido alle risoluzioni tipiche dei cristalli di proteina, la separazione degli atomi pesanti rende questo presupposto quasi valido. I metodi diretti sono un'opzione in SHELX e sono usati nei programmi quali SIR, MULTAN e Shake&Bake

Sovrapposizione della mappa sperimentale a quella teorica • Cella esagonale: a = 64. 99Å, Sovrapposizione della mappa sperimentale a quella teorica • Cella esagonale: a = 64. 99Å, c = 23. 45Å, Gruppo spaziale: la coppia enantiomorfa P 6222 P 6422 • 1 atomo di Co nella A. U. ; 12 atomi di Co in cella; 132 vettori Co-Co in cella consistenti con il G. S. • Dalla interpretazione della Patterson si ricava x, y, z dell’atomo di Co • Si può verificare la soluzione sovrapponendo le tracce dei vettori interatomici Co-Co con la mappa Mappa Patterson Anomala sperimentale sul picco del Co ( = 1. 606Å) Tracce dei vettori Co-Co calcolati

Software per ottenere le fasi • SOLVE (Tom Terwilliger) http: //www. solve. lanl. gov/ Software per ottenere le fasi • SOLVE (Tom Terwilliger) http: //www. solve. lanl. gov/ -Risolve la struttura degli atomi pesanti partendo da soli pochi siti trovati con i metodi Patterson -Altamente automatizzato. Utilizza il metodo della massima verosimiglianza -Include un certo numero di controlli altamente sofisticati per confermare che il processo sta andando nel senso giusto -Calcola le mappe per confermare la presenza della continuità nella densità elettronica • PHASES ([email protected] CIS. PITT. EDU) -Un altro package altamente automatizzato per la determinazione delle sub-strutture pesanti e delle fasi • SHARP sviluppato dal gruppo di Gérard Bricogne (http: //babinet. globalphasing. com/sharp/) -Affinamento dei siti degli atomi pesanti e calcolo delle probabilità delle fasi • SHELXC/D/E (G. M. Sheldrick) http: //shelx. uni-ac. gwdg. de/ -Dal trattamento dei dati (SHELXC) alla determinazione dei siti degli atomi pesanti (SHELXD) alle mappe di densità elettronica (SHELXE) • MLPHARE -Il software di fasatura del package CCP 4 -Utilizza il metodo della massima verosimiglianza -Abbastanza buono per i casi più semplici di MIRAS/SIRAS e può essere usato (anche se non è ottimale) per l’affinamento dei siti e relativa fasatura da MAD

Miglioramento delle fasi mediante modifica in modo iterativo della densità elettronica Density Modification (DM) Miglioramento delle fasi mediante modifica in modo iterativo della densità elettronica Density Modification (DM) r’ r INFORMAZIONI |F|(sperimentale), f(stimata) |F|(sperimentale) f(migliorata) |F|(calcolato), f(migliorata) INFORMAZIONI = A) I cristalli di proteina contengono regioni di solvente disordinato (Solvent flattening) B) La densità elettronica di coppie equivalenti deve essere simile (NCS Averaging) C) La densità elettronica deve avere una lunga continuità (Skeletonization) D) Le proteine tendono ad avere una determinata distribuzione della densità (Histogram matching) A) Solvent flattening: B) Averaging: A=B “Non-crystallographic” symmetry

Limite di risoluzione Trasformata di Fourier RISOLUZIONE = dmim = /2 sen max 6Å Limite di risoluzione Trasformata di Fourier RISOLUZIONE = dmim = /2 sen max 6Å Si riescono a intravedere le -eliche appaiono come dei cilindri. La catena polipeptidica può essere tracciata solo per proteine globulari. 3Å Con fortuna la catena polipeptidica può essere tracciata completamente. Le catene laterali sono visibili ma non identificabili. E’ difficile stabilire il piano del peptide 2Å La struttura della catena principale è certa. Le catene laterali possono essere identificate correttamente senza la conoscenza della sequenza primaria con il 50% di probabilità. Le acque più fortemente legate possono essere localizzate. 1. 5Å Gli atomi sono quasi risolti. La struttura delle acque è chiara. Si possono affinare i fattori termici isotropi. 1. 2Å Risoluzione a livello atomico. Possibilità di intravedere gli idrogeni. Affinamento di B anisotropo.

Mappe 2 Fo-Fc Trasformata di Fourier F(gatto-coda) Trasformata di Fourier |F|(gatto), f(gatto-coda) Trasformata di Mappe 2 Fo-Fc Trasformata di Fourier F(gatto-coda) Trasformata di Fourier |F|(gatto), f(gatto-coda) Trasformata di Fourier |F|2(gatto)-|F|(gatto-coda)

Costruzione del modello (Model building) Metodo manuale usando programmi di grafica molecolare come O Costruzione del modello (Model building) Metodo manuale usando programmi di grafica molecolare come O (Alwyn Jones) Generalmente con questo approccio gerarchico: -Vengono prima posizionati i Ca nella densità elettronica, -Gli atomi della catena principale vengono poi posizionati facendo riferimento ad un data base di strutture ben affinate -Le catene laterali vengono aggiunte con le conformazioni derivate da una analoga libreria di strutture ben affinate -Vengono infine posizionate le molecole d’acqua Oppure quando la risoluzione lo permette (<2. 5 Å) in modo automatico con specifici programmi (ARP/w. ARP Lamzin e Perrakis ) -Gli atomi vengono disposti nelle posizioni dei picchi di densità elettronica -Il programma riconosce questi atomi e li interpreta secondo la struttura della proteina

AFFINAMENTO MODELLO DI PARTENZA REFMAC Murshudov ALCUNI CICLI DI AFFINAMENTO PER RENDERE MINIMI GLI AFFINAMENTO MODELLO DI PARTENZA REFMAC Murshudov ALCUNI CICLI DI AFFINAMENTO PER RENDERE MINIMI GLI SCARTI TRA IO E IC O TRA FO E FC. Modificando xyz e B degli atomi CALCOLO DEI FATTORI DI STRUTTURA (Fasi) Calcolo delle mappe di densità elettronica |Fo|; 2|Fo|-|Fc| ; |Fo|-|Fc| FIT MANUALE TRA MODELLO e 2|Fo|-|Fc| FINE AFFINAMENTO R < 0. 20

Bontà dell’affinamento • Per una proteina di 40 k. D circa 3000 atomi non-H, Bontà dell’affinamento • Per una proteina di 40 k. D circa 3000 atomi non-H, il numero di parametri da affinare è 3000 x 4 = 12000 (4 parametri per atomo = x, y, z, B) • Per una proteina di queste dimensioni, con un cristallo che diffrange a 2. 8 Å di risoluzione, possiamo ottenere circa 20000 riflessioni osservabili. • il problema non è altamente determinato in quanto abbiamo 12000 parametri da affinare contro solo 20000 osservabili (il rapporto ottimale è 1/7) e questo porta ad un sovra-affinamento delle strutture (R migliora mentre il modello strutturale peggiora dal punto di vista “chimico”) Un parametro utile per controllare il sovra-affinamento delle strutture è l’Rfree (introdotto da Axel Brunger nel 1992). Una percentuale delle riflessioni (in genere 5%) è selezionata prima dell’affinamento e viene esclusa da questo processo. Il fattore R calcolato per questi riflessi è chiamato Rfree. E’ estremamente utile controllare l’Rfree mentre l’affinamento progredisce in quanto questo può impedire il sovraaffinamento. L’Rfree è tipicamente 5% superiore a R. Per dati a bassa risoluzione (3Å) Rfree può essere anche attorno al 30%. A più alta risoluzione (<1. 5Å) l’Rfree si avvicina ad R. Generalmente abbiamo bisogno di un numero maggiore di osservazioni da introdurre nel processo di affinamento. Questo problema viene risolto utilizzando come “pseudo-osservazioni” la nostra conoscenza sulla geometria e sulla chimica dei sistemi proteici

Aggiunta di informazioni extra Covalenti Non-covalenti -Elettrostatiche -Legami ad Idrogeno -Van der Waals angoli Aggiunta di informazioni extra Covalenti Non-covalenti -Elettrostatiche -Legami ad Idrogeno -Van der Waals angoli torsionali angoli di legame lunghezze di legame Queste informazioni geometriche insieme alle intensità di diffrazione sono considerate nei programmi di affinamento in termini energetici (come nei calcoli di meccanica molecolare) E = E X - Ray + å k(d - d 0 )2 + legami å k(q - q 0 )2 + angoli å k[1 + cos(nw + w 0 )] + torsioni qi q j å å 4 pe r +. . . . i g i, j Dove: do, o, wo, sono i valori ideali delle distanze e angoli di legame ed angoli torsionali. k solo le costanti di forza determinate dalle energie stimate per la deformazione dei legami.

Problema dei minimi locali Energia Modello di partenza Parametri (es. la coordinata x dell’atomo Problema dei minimi locali Energia Modello di partenza Parametri (es. la coordinata x dell’atomo 1) Minimo locale Il problema dei minimi locali può essere in parte risolto rendendo il sistema dinamico: Mediante una simulazione al calcolatore fatta in questi termini: -Agli atomi viene assegnata una certa energia cinetica, relazionata ad una data temperatura -Risolvendo l’equazione del moto degli atomi per un brevi periodi di tempo (tipicamente ~ 1 fs), in presenza sia dell’energia cinetica che dell’energia potenziale descritta dalle precedenti osservabili si ottiene un sistema dinamico. -Si parte da una temperatura simulata ad esempio di 2000 K e si “raffredda” il sistema lentamente fino allo 0 K in modo da dare tempo al sistema di convergere verso il modello a più bassa energia potenziale. Questo processo che ha il vantaggio di modificare casualmente le forze che agiscono sugli atomi viene chiamato “simulated annealing” X-PLOR/CNS (Axel T. Brünger) http: //cns. csb. yale. edu

Validazione del modello La validazione del modello viene effettuata da programmi come PROCHECK http: Validazione del modello La validazione del modello viene effettuata da programmi come PROCHECK http: //www. biochem. ucl. ac. uk/~roman/procheck. html • La geometria covalente, distanze ed angoli • La planarità • Gli angolo diedri • La chiralità • Le interazioni di non-legame • I legami ad idrogeno della catena principale • I legami disolfuro • I parametri stereochimici • Il confronto con le strutture ottenute alla stessa risoluzione

Ramachandran Plot Ramachandran Plot

Over-expressione Dalla proteina alla struttura 3 D Purificazione Cristallizzazione Check preliminari Cella, gruppo spaziale Over-expressione Dalla proteina alla struttura 3 D Purificazione Cristallizzazione Check preliminari Cella, gruppo spaziale Raccolta dati raggi-X MIR, SIR MAD Derivati Isomorfi Patterson Differenza SAD Esperimenti di diffusione anomala Patterson Anomala e Dispersiva MR Molecular Replacement Matrici di rototraslazione Valutazione della fase Mappe di densità elettronica Affinamento strutturale Struttura 3 D