ОКРАШИВАНИЕ НЕРВНОЙ ТКАНИ Этапы окрашивания нервной ткани

ОКРАШИВАНИЕ НЕРВНОЙ ТКАНИ

Этапы окрашивания нервной ткани 1. Подготовка препарата Фиксация ü Обезвоживание ü Заливка ü Приготовление раствора ü 2. Окрашивание

Окрашивание нейронов. Метод Ниссля 1. 2. 3. 4. 5. 6. Фиксация Получение и окрашивание срезов Обезвоживавние Приготовление раствора Методика окрашивания Результат

Упрощенный метод Ниссля Фиксированный в спирте материал заливают в спирт целлоидин. Срезы собирают в 70 % спирт, где их можно хранить долгое время. Методика окраски 1. Расправленные срезы помещают в 0, 1 % раствор толуидинового синего или тионина, который после этого дважды нагревают до появления паров. 2. После охлаждения ополаскивают в воде и 70 % спирте. 3. Дифференцируют в 96 % спирте. 4. Проводят через 100 % спирт, ксилол, бальзам или окрашивают, как указано выше; дифференцируют в анилиновом масле со спиртом. 5. Извлекают срезы на предметное стекло, просушивают фильтровальной бумагой. 6. Просветляют кайепутовым маслом, затем масло сливают. 7. Просушивают, проводят через ксилол и заключают в бальзам. Результат: глыбки тигроида, ядерная оболочка и ядрышки интенсивно синие или фиолетовые, цитоплазма ганглиозных и глиальных клеток бледно синяя, волокнистое нервное вещество не окрашено

Окрашивание нервных волокон. Метод Шпильмейера Методика окраски 1. Срезы промывают в 3 сменах дистиллированной воды. 2. Переносят на предметное стекло, смазанное смесью белка с глицерином, и подсушивают на воздухе. 3. Погружают в 2, 5 % раствор железоаммонийных квасцов на 2 сут (можно дольше) и держат в темном месте. 4. Промывают в 3 сменах дистиллированной воды и обезжиривают в 96 % спирте 15 — 30 мин. 5. Помещают в гематоксилин (15 мл гематоксилина Бемера и 85 мл дистиллированной воды) на 1 сут и держат на свету. 6. Промывают в 3 сменах дистиллированной воды и дифференцируют в 2, 5 % растворе железоаммонийных квасцов (контролируя процесс под микроскопом). 7. Промывают в дистиллированной воде, затем оставляют на 30 мин в проточной воде. 8. Просушивают на воздухе, проводят через ксилол и заключают в бальзам. Результаты: на светлом слегка желтоватом фоне миелиновые волокна темно серо синеватого оттенка; ядра дренажной олигодендроглии в белом веществе того же оттенка.

Метод Хеквиста Методика окраски 1. Срезы проводят через 100 %, 96 %, 80 %, 70 % спирты и дистиллированную воду. 2. Переносят в 0, 5 % раствор фосфорно молибденовой кислоты на ночь. Одновременно готовят краситель (35 мл 1 % водного раствора метиленового синего + 35 мл 1 % водного раствора желтого или красного эозина, через 1 сут после приготовления растворы сливают и добавляют 120 мл воды). 3. Срезы быстро ополаскивают в дистиллированной воде и переносят на ночь в краситель. 4. Ополаскивают в воде, быстро проводят через спирты и ксилол, заключают в бальзам. Результаты: на синем фоне ткани миелиновая оболочка нервных волокон приобретает окраску от розовой до ярко красной, осевые цилиндры окрашиваются в темно синий цвет.

Метод окрашивания синапсов Гольджи-Дейнеки 1. Материал фиксируют в свежем растворе АФА (состоит из равных частей 96 % спирта, 20 %нейтрального формалина и насыщенного раствора мышьяковистой кислоты) до 3 ч. 2. Промывают в 1 % растворе нитрата серебра и оставляют в этом растворе на срок от 18 дней до 2, 5 мес. . 3. Переносят в восстановительную смесь, в состав которой входят 2 г гидрохинона, 0, 5 г сульфита натрия, 5 мл 40 % нейтрального формалина и 100 мл дистиллированной воды, на 1 сут. 4. Проводят через 70 %, 80 %, 96 % спирты по 3 ч в каждом и оставляют в 100 % спирте на ночь. 5. Переносят в 6 % целлоидин на 2 — 3 сут, затем в 8 % целлоидин на 2 сут (лучше только в 6 % целлоидин на 2 — 3 сут). 6. После заливки на блоках готовят срезы толщиной от 15 до 30 мкм и переносят их в 70 % спирт. 7. Промывают срезы в дистиллированной воде и погружают до почернения в вираж (1, 5 г тиосульфата натрия, 1, 5 г тиоцианата аммония, 50 мл дистиллированной воды, на каждые 10 мл виража 1 мл 1 % трихлорида золота). 8. Дифференцируют до просветления в растворе перманганата калия (2 — 3 кристалла на 50 мл дистиллированной воды + 1 капля серной кислоты). 9. Не промывая срезы, погружают их в 1 % раствор щавелевой кислоты на 1 — 3 мин (щавелевая кислота отмывает перманганат калия). 10. Проводят через карбол ксилол 1— 2 мин, 2 — 3 порции ксилола и заключают. Результат: фон препаратов светлый, тела нейронов и дендриты светло серого цвета. Аксонные синаптические окончания импрегнируются интенсивно, дендриты — более интенсивно.

Метод Глисса в модификации Владимировой 1. Небольшой кусочек ткани головного мозга погружают в жидкость Бодиана (5 мл формалина, 5 мл ледяной уксусной кислоты и 90 мл 80 % спирта) на 3 — 4 дня. 2. Промывают в проточной воде в течение 24 ч. 3. Срезы толщиной 12 — 15 мкм получают на замораживающем микротоме, ополаскивают в дистиллированной воде и помещают на 24 ч в 50 % спирт, добавив в него 10 капель крепкого аммиака. 4. Ополаскивают в дистиллированной воде и помещают в 10 % раствор нитрата серебра на срок от нескольких часов до 5 дней (пока срез не станет коричневым). 5. Не ополаскивая, переносят в 10 % формалин, меняя его несколько раз, пока не исчезнет муть. 6. Ополаскивают в проточной воде. 7. Погружают на 30 с (можно до 1 мин) в смесь, состоящую из 10 мл 100 % спирта и 10 мл 20 % раствора нитрата серебра (выпадающий осадок растворяют аммиаком, прибавляя его по каплям). 8. Переносят в 10 % формалин, меняя несколько раз до исчезновения мути. 9. Промывают в дистиллированной воде и помещают в 1 % раствор хлорного золота до появления стального цвета. 10. Переносят в 5 % раствор тиосульфата натрия. 11. Промывают в дистиллированной воде. 12. Переносят на предметное стекло, подсушивают на воздухе, затем проводят через ацетон, ксилол, заключают в бальзам. Результат: на сером фоне видны темные нервные клетки, ядра, нейрофибриллы в нервных клетках и синаптических волокнах, синаптические окончания

Третий метод Рамон-и-Кохаль Материал фиксируют 24 ч в смеси 50 мл 96 % или 100 % спирта и 1— 12 капель (для большого мозга 1— 3 капли, моз жечка— 4, спинного и продолговатого мозга— 8— 12, периферических окончаний — 2 — 3) раствора аммиака (молекулярная масса 0, 910). Если аммиака добавлено слишком много, то импрегнация получается бледная. Сжатие можно уменьшить, если объект вначале поместить на 6 ч в 70 % спирт, затем на 2— 4 ч в 85 % спирт и лишь после этого перенести в аммиачный спирт. После обсушивания фильтровальной бумагой обработку проводят так же, как при использовании метода II.

Окраска глии методом Рамон-и. Кохаля 1. Срезы промывают в 3 сменах дистиллированной воды и переносят на 2 сут в свежий бромистый фиксатор (14 мл нейтрального формалина, 2 г бромида аммония и 100 мл дистиллированной воды). 2. Тщательно промывают в 3 сменах дистиллированной воды и переносят в раствор трихлорида золота с сулемой (8 мл 5 % прозрачного раствора сулемы, 10 мл 1 % раствора трихлорида золота и 60 мл дистиллированной воды) на 1 сут в темное место. 3. Промывают в 3 сменах дистиллированной воды и помещают в 5 % раствор тиосульфата натрия на 1 мин. 4. Переносят в дистиллированную воду, затем наклеивают на предметное стекло, смазанное смесью белка с глицерином, подсушивают на воздухе до полного высыхания. 5. Просветляют в ксилоле и заключают в бальзам под покровное стекло. Результат: в белом веществе на сиреневом фоне (разной интенсивности) четко определяются черновато фиолетовые фиброзные астроциты, а в сером веществе — более светлые

Окраска глии методом Хорнеца 1. Срезы переносят в дистиллированную воду, на 100 мл которой добавлено 15 капель раствора аммиака (недолго). 2. Помещают в 5 % раствор бромисто водородной кислоты на 1 ч при температуре 37 °С. 3. Промывают в 3 сменах дистиллированной воды, а затем в дистиллированной воде, к которой добавлено несколько капель уксусной кислоты. 4. Переносят на 15— 24 ч в раствор, состоящий из 1 г трихлорида золота в 75 мл дистиллированной воды +25 мл 2 % сулемы+18 мл дистиллированной воды + 15 капель уксусной кислоты, препараты приобретают темно коричневую или красно коричневую окраску. 5. Помещают в 5 % раствор щавелевой кислоты (до приобретения ими серой окраски). 6. Ополаскивают в дистиллированной воде, переносят в 5 % раствор тиосульфата натрия с несколькими каплями раствора аммиака; быстро ополаскивают и заключают. Результат: на сиреневом фоне выявляются темно синие фиброзные астроциты с отростками, видны капилляры и красные эритроциты в их просвете.