О Р Ы Н Д А Ғ А

О Р Ы Н Д А Ғ А Н : Е С М У Р А Т О В А А 6 0 5 — 1 Т О П Т Е К С Е Р Г Е Н : С А Д В А К А С А. СИФА диагностикасы

Жоспар ИФА-ны ж ргізу дісіү ә Иммуннды реакция механизмі ИФА сатылары олданылатын конъюгат рамы Қ құ дісті сезімталды ы. Ә ң ғ ИФА классификациясы атты фазалы ИФА Қ ИФА тікелей дісі ә Тікелей емес ИФА Сэндвич- діс ә Конкурентті ИФА Ингибиторный ИФА Иммуноферментті да дісі қ ә Н тижені есептеу ә ИФА-ны т жірибеде олданылуы ң ә қ ИФА к мегімен аны талатын инфекциялар ө қ орытынды Қ

ИФА жүргізу әдісі Серодиагностика шін 96 полистирольды айт різді планшеттер олданылады, ү ә қ таба шаларды абыр аларында алдын-ала антиген адсорбирленіп алынады. қ ң қ ғ 1 • Шайыл ан хромогенді зат осыл ан со , таба шлардан дамып келе жат ан боял ан ғ қ ғ ң қ қ ғ реакцияны к реміз. Боялу интенсивтілігі фермент ж не антидене санына ө ә байланысты. Таба шада ы с йы ты ты оптикалы ты ызды ын (ОП) лшегенде қ ғ ұ қ қ ң қ ғ ғ ө ж не оны ба ылау лгісімен салыстыр анда антиденелер концентрациясы бірлік ә қ ү ғ к лемде есептеледі. ө 2 • рі арай таба шалар а ферментпен белгіленген адам иммуноглобулиніне Ә қ қ ғ арсы антидене осады. Егер зерттелетін сарысуда аны талатын антиденелер қ қ қ кездессе, б л сатыда олар белгіленген антиденелермен сер ететін антиген ұ ә р лінде болады. ө 3 • Зерттелетін сарысу планшетті таба шаларына йылады. Сонымен атар ң қ құ қ гомологиялы антигенге антиденелер байланысады. Байланыспа ан антиденелер қ ғ шайылып кетеді.

Иммуннды реакция механизмі 1. Ал аш ы реакция аны талып жат ан Ig (Ab) ж не оздыр ышты ғ қ қ қ ә қ ғ ң тазартыл ан антигеніні арасында болады, ол иммунологиялы ғ ң қ планшетті лункасыны беткейіне бекітіледі. ң ң 2. Пайда бол ан иммунды комплекстерді аны тау шін екінші ғ қ ү иммунологиялы реакция ж ргізіледі, б л кезде антиген ретінде қ ү ұ байланыс ан спецификалы Ig, ал антидене ретінде – конъюгат қ қ алынады. 3. рі арай конъюгат молекуласыны ферментті б лігімен Ә қ ң ө катализирленетін ферментативті реакция ж реді. Б л реакцияны ү ұ ң субстраты т ссіз зат — хромоген , реакция барысында боял ан зат а ү ғ қ айналады. Лункада ы боялу интенсивтілігі иммуноглобулин ғ сынамасыны рамында ыны санына байланысты. ң құ ғ ң

ИФА 3 арнайы сатыдан т радыұ 1. иммунды комплексті ң т зілуіне ү келетін, ә антиденеге спецификалы қ тестіленетін байланысты тану сатысы. 2. Конъюгаттты ң иммунды комплекспен байланыс руы құ немесе бос орындармен байланысу сатысы. 3. Фермент белгісіні ң тіркеуші сигнал а ғ айналу сатысы.

Конъюгат – бұл ферментті белгімен белгіленген антиген немесе антидене. Сенімді конъюгат келесі асиеттерге ие болуы керек: қ — лкен ерітіндіде олдану шін, жо ары антидене титрімен ж не ү қ ү ғ ә жо ары антигенге састы а ие , сонды тан ол спецификалы емес ғ ұқ ққ қ қ байланысты т мендетеді. ө — Ертінді спецификалылы ы жеткілікті болу керек; ғ — Мономерлі т рі полмерліден басымболуы крек, ү — Фермент пен антидене арасында оптимальды молярлы атынас қ болады (оптимальды атынасы 1: 1); қ — Конъгатты жеткілі ті ферментативті активтілігі. ң ң

ИФА-ны сезімталдылы ың ғ дісті сезімталдылы ы ( антиген ж не антидене саныны Ә ң ғ ә ң минимальды аны талуы) келесі факторлармен аны талады: қ қ антиденелер састы ы, моноклональды антиденелерді ұқ ғ пайдалану ; ферментті спецификалы активтілігі ; ң қ сигналды интенсивтілігі; ң сигналды ескру сезімталды ы. ғ ИФА ны орташа сезімталды ы – 10 -9 – 10 -12 моль. ң ғ

ИФА классификациясы 1. ИФА-ны бірінші сатысында кездесетін ң реагенттер типі бойынша, конкурентті ж не ә конкурентті емес дістер. ә А) Конкурентті ИФА-да бірінші сатыда ж йеде бір ү уа ытта талданып жат ан байланыс ж не оны қ қ ә ң аналогы болады. Б) Конкурентті емес діс шін бірінші сатыда тек ә ү талданып жат ан байланыс ж не спецификалы қ ә қ байланысу орталы ы т н. ғ ә

2. ИФА-ны барлы дістері гомогенді ж не гетерогенді болып ң қ ә ә б лінеді. ө Гомогенді ИФА негізіне , т мен молекулярлы ө субстанцияларды аны тау шін олданылатын, антиген қ ү қ немесе антиденемен байланысатын ферментті ң белсенділігіні ингибирленуі жатады. Ферментті ң ң белсенділігі антиген-антидене реакциясыны орытындысы ң қ негізінде алпына келеді. қ Гетерогенді діс шін анализді екіфазалы ж йеде атты ә ү ү қ фазалы- тасымалдаушы атысуымен ж ргізу т н. Міндетті қ ү ә сатысы иммунды комплексті сер к рсетпеген компоненттен ә ө б лу. Иммунды комплексті бірінші сатыда т зілуі атты ө ң ү қ фазада ж реді – атты фазалы діс деп аталады. ү қ ә

3. Тестіленетін затты аны тау принципі бойынша: қ А) Затты концентрациясын (антигена или антидене) ң тікелей аны тау бірге сер ететін байланыс орталы тарымен қ ә қ атар ж реді. Б л жа дайда ферментті белгі пайда бол ан қ ү ұ ғ ғ спецификалы АГ-АД комплексте болады. Аны талып қ қ отыр ан затты концентрациясы тіркелген сигнал а тікелей ғ ң ғ пропорционал болады. Б) Байланысу орындарыны жалпы саныны рт рлілігі ң ң ә ү ж не ал ан бос байланысу орталы тарына байланысты ә қ ғ қ затты концентрациясын аны тау. Б л кезде аны талатын ң қ ұ қ затты концентрациясы седі, тіркелетін сигнал т мендейді. ң ө ө

Твердофазные Гетерогенно-гомогенные. Тип I Определение специфического иммунного комплекса анализируемого соединения Тип II Определение оставшихся свободных центров специфического связывания. Методы ИФА Неконкурентные Конкурентные Гетерогенные Го мо ген ные Гете ро ген ные Ге теро ген ные Го мо г ен ные Гетерогенно-гомогенные Твер до фаз ные Различные схемы проведения анализа Твер до фаз ные

Қаттыфазалы ИФА Қатты фаза ретінде ИФА –ны жүргізу үшін әртүрлі материалдарды қолдануға болады: полистирол, поливинилхлорид, полипропилен және т. б. Қатты фаза ретінде пробирка қабырғасы, 96 -ай тәрізді және басқа. планшеттер, шариктер, нитроцеллюлозды және басқа мембраналар. Осы фазада антиген және антидененің иммобилизациясы 3 жолмен жүреді: – пассивті адсорбция, белоктар және синтетикалық беткеймен қатты гидрофобты әсерге негізделген; – қатты фазаға ковалентті байланыс; – иммунохимиялық. (коваленті емес және адсорбционды емес байланыс).

ИФА-ның тікелей әдісі 1. Та тайша лункаларында антиген немесе антидене (зерттелетін қ материал)адсорбирленеді. Ба ылау ретінде о адсорбирленген ба ылау лгісі қ ң қ ү бар лунка олданылады, оны ішінде міндетті т рде ал ан антигендер қ ң ү қ ғ болады. 2. «Казеин к мегімен атты фазада ал ан байланысатын ө қ қ ғ бос орындарды тежейді. ( атты фазада конъюгатты қ ң спецификалы емес сорбциясыны алдын алады). қ ң 3. Лунка а ферментпен белгіленген антиген немесе антидене ғ салынады(конъюгат). Конъюгатты фазамен байланысы ж йені екі ң қ ү ң компонентіні комплементарлылы ы ж ргенде ана болады. Конъюгатпен ң ғ ү ғ инкубациядан кейін лунканы жуады, осылайша конъюгатты байланыспа ан ң ғ б лігін жояды. ө 4. Лунка а олданылып отыр ан ферменке спецификалы субстратты ғ қ ғ салады , инкубирлейді. Оі ба ылаулы лункада ы боялу оптимальды қ ғ де гейге жеткен со ферментативті реакцияны то татады. ң ң қ 5. Реакцияны к ру. Алдымен реакция н тижесін к збен ба алайды. Боялу ө ә ө ғ интенсивтілігіне байланысты на ты н тижені ба алау ИФАда с йкес қ ә ғ ә светофильтрмен ба аланады. Ж ргізілген анализ орытындысы бойынша ғ ү қ , концентрациясынан оптикалы ты ызды графигі т р ызылыды. қ ғ қ ұ ғ

Тікелей емес ИФА-ны б л н с асы ң ұ ұ қ спецификалы антиденелерді қ аны тау шін олданылады. қ ү қ Та тайша лункаларында қ стандартты антиген адсорбирленеді ж не нау астан ә қ алын ан сарысу немесе бас а ғ қ биологиялы материал лгісі қ ү (ж лын с йы ты ы, сілекей ж не ұ ұ қ ғ ә т. б)инкубацияланады. атты фазада антигенмен Қ байланыс ан спецификалы қ қ антиденені конъюгатты ң антиглобулині к мегімен ө аны талады. қ

Сэндвич-әдіс ИФА-ның бұл түрімен анықталатын антигендер, антиденені байланыстыратын бірнеше эпитоптардан тұрады. Антидене ферменттері антидене байланыстыратын бірнеше эпитоптардан тұрады. ИФА-ның бұл түрін жүргізгенде жоғарыспецификалық поли немесе моноклоналды антиденелер қатты фазада келесідй инкубирленеді. Шаю процедурасынан кейін лункаларға ферментпен белгіленген антиденені қосады, ары қарай антигенге реакцияның барлық қалған этаптарын жүргізеді. Спецификалық комплекстің эффективтілігінің түзілуі анализдің әр деңгейінде антиген –антидене реакциясын байланыстыратын константаға байланысты.

Конкурентті ИФА Анализді б л варианты конъюгат ж не ң ұ ә зерттелетін антиденені атты фазада ң қ адсорбирленген антигенмен байланысы шін б секелестігі. ү ә атты фаза а байланыс ан ферментті Қ ғ қ ң саны осындыда бос антидене болуына қ байланысты пропорциональды т мендейді. . ө Антигенді аны тау шінсол н с а қ ү ұ қ олданылады, біра б л жа дайда ал ан қ қ ұ ғ қ ғ антиген стандартты антигенмен антидене байланысы шін б секелеседі. ү ә

Ингибиторлы ИФА 1. ИФА-ны б л н с асында зерттелеетін лгіде болатын ң ұ ұ қ ү антиген фертментті белгімен белгіленетін моноклональды антиденелермен байланысады ж не иммобилизирленген ә атты фазада оларды стандартты антигенімен серін қ ң ә ингибирлейді. 2. Конъюгат а спецификалы антигенні лгіде аз б лігіні қ ң ү ө ң болуыны зі белгіленген антиденені иммобилизирленген ң ө ң антигенмен байланысын ингибирлейді. 3. Ингибирлену де гейі ерітінді рамында ы антигенге ң құ ғ тікелей пропорциональды. Сан анализін жасау шін ү калибрленген исы сызы ты рады. қ құ

Иммуноферментті да дісіқ ә 1 • Пайда бол ан да тарды микроскоп ар ылы санайды, б р ғ қ қ ұ секретирлеуші клеткаларды саны боладың 2 • атты фаза ретінде нитрацелюлозды мембрананы олдану а болады. Қ қ ғ НЦМ –ны жо ар ы адсорбционды абілеттілігі антигенні е аз ң ғ ғ қ ң ң м лшерін ажет етеді. ө қ 4 • Секретирлеуші клеткаларды санын параллельді аны тау шін ж не лункада ы ң қ ү ә ғ антигенні немесе антиденені жалпы секретирлеуші санын аны тау шін, бас а ң ң қ ү қ субстратты олдан ан кезде бірлік клеткамен секртетирлеуші затты санын қ ғ ң аны тау а болады. қ ғ • Б л діс клеткалар санын, секретирлеуші антигенді ұ ә ба алау а олданылады ғ ғ қ.

Нәтижені есептеу Реакция то та ан со арнайы ралдарды к мегімен қ ғ ң құ ң ө лункалар а фотометрлеу ж ргізіледі. ғ ү Н тижені есептеу шін арнайы рыл ы олданады. ә ү құ ғ қ Ба ылау сынамаларыны оптикалы ты ызды ын қ ң қ ғ ғ салыстыру шін анализ н тижесіне математикалы ү ә қ есеп ж ргізіледі. ү яшы та ы оптикалы ты ызды арт ан сайын Ұ қ ғ қ қ , сынамады спецификалы антидене саны арта т седі. қ ү

ИФА-ның тәжірибеде қолданылуы • Инфекциялы аурулап диагностикасы шін ( рт рлі спецификалы қ ү ә ү қ антигендер немесе антиденелердіаны тау шін); қ ү • Биологиялы лгілерден гормондарды ж не д рілік препараттарды қ ү ә ә аны тау; қ • Антигене арсы антидене изотиптерін аны тау; қ қ • Иммунды комплекстерді аны тау; қ • Онкомаркерлерді аны тау; қ • ан сарысуынан белокты аны тау (ферритин, фибронектин); Қ қ • Жалпы Ig. E ж не спецификалы Ig. E антиденелерін аны тау; ә қ қ • Моноклональды антиденелер скринингі; • Биологиялы с йы ты тан цитокиндерді аны тау. қ ұ қ қ қ

ИФА көмегімен анықталатын инфекциялар. Сифилис диагностикасы шін олданылады (бас а ү қ қ реакциялармен бірге), ВИЧ-инфекциясы, вирусты гепатиттер. Хламидия инфекциясыны диагностикасы шін , ң ү цитомегаловирусты инфекция ж не бас а герпестік ә қ инфекциялар. анда антидене де гейін аны тау біріншілік жыныс Қ ң қ жолдарымен берілетін инфекция диагностикасы шін ажет ү қ емес. ИФА н тижесі бойынша микропреципитация реакциясымен ә бірге сифилисты таниды.

Қорытынды ИФА бас а дістермен салыстыр анда антиген ж не қ ә ғ ә антидене детекциясы мына асиеттерге ие. 0, 05 нг/мл қ концентрацияны аны тау шін жо ары сезімталды а ие. қ ү ғ ққ Зерттелетін заттарды минимальды к лемін олдану а ң ө қ ғ болады. ИФА-ны ж ргізу шін керекті ингридиенттерді ү ү са тауда т ра ты. Реакцияны ж ргізу ы айлы. Реакцияны қ ұ қ ү ңғ ң барлы этаптарыны автоматизациясы. Диагностикалы қ ң қ ралдарды т мен ба ада болуы. зіні жо ары емес құ ң ө ғ Ө ң ғ ба асына байланысты ж не экологиялы ауіпсіздігіне ғ ә қ қ байланысты ИФА барлы «рутинді» анализдерді арт а қ қ алдырды. қ

Пайдаланылған әдебиеттер 1. Самойликов П. В. Принципы иммуноферментного анализа, основные виды ИФА, применение в диагностике интерн кафедры «Клинической лабораторной диагностики» Российский государственный медицинский университет 2009. 2. Кишкун А. А. Иммунологические исследования и методы диагностики инфекционных заболеваний в клинической практике. Медицинское информационное агентство, 2009 г. . 3. Кондратьева И. А. Практикум по иммунологии. Учебное пособие для ВУЗов. Академия, 2004 г.