Молекулярные механизмы репликации Лекция 2 для студентов

Молекулярные механизмы репликации Лекция № 2 для студентов специальности «Микробиология» Лектор: Давыдова Ольга Константиновна, к. б. н. , доцент 1 2/6/2018

План лекции: • Организация генома бактерий • Размер генома. Парадокс избыточности генома. Минимальный бактериальный геном • Механизмы репликации ДНК • Современная модель репликации • Ферменты репликации

Организация генома бактерий • Хромосома сильно компактизована. • Центральная область нуклеоида представлена суперспирализованной транскрипционно неактивной ДНК, а на расположенных на периферии деспирализованных петлях происходят интенсивные процессы образования различных типов РНК. • Хромосомы бывают не только кольцевыми, метод пульс-электрофореза позволил идентифицировать линейную бактериальную хромосому у спирохеты из рода боррелий Borrelia burgdorferi и у актиномицетов. • Бактерии могут иметь больше одной хромосомы на клетку. У Agrobacterium tumefaciens 2 плазмиды (200 тпн и 450 тпн) и 2 очень больших молекулы ДНК (2, 1× 106 и 3× 106 пн). Меньшая из них линейная, большая – кольцевая.

Организация генома бактерий

Геном бактерий • Размеры бактериальных геномов могут различаться более чем в 20 раз - от 6*105 у некоторых облигатных паразитов до более чем 107 н. п. у цианобактерий. • Размеры ДНК от 580 тыс н. п. у Micoplasma genitalium до 9500 тыс. н. п. у Myxococcus xantus • E. coli - 4600 тыс. н. п.

Геном бактерий • Количество хромосомной ДНК, приходящейся на один ген у бактерий -1000 п. н. то есть гены упакованы очень плотно

Избыточность генома • С-парадокс — отсутствие корреляции между физическими размерами генома и сложностью организмов. • Размеры генома: Кузнечик – 17 pg Лошадь – 3, 2 pg (1 pg ДНК = 1000 млн. п. н. ) • "Судить о степени эволюционной продвинутости по размерам генома столь же правомочно, как оценивать общественное положение человека по его весу"

Избыточность генома • Суммарное количество ДНК в гаплоидном геноме принято обозначать латинским символом С (от constant или characteristic), обозначая тот факт, что размер гаплоидного генома довольно постоянен внутри любого вида. • Но между видами величина С широко варьирует как у прокариот, так и у эукариот. • В 1978 г. Т. Кавалье-Смит заметил, что у эукариот транскрибируется лишь незначительная часть последовательностей нуклеотидов генома (3% генома человека).

Классификация генов по их функциям • У кишечной палочки не понятны функции около 1/3 из 4289 генов.

Минимальный геном • • Институту Крейга Вентера принадлежит эксклюзивное право на набор генов, достаточный для создания свободноживущего, способного к самостоятельному росту и размножению микроорганизма, обладающего минимальным набором генетического материала. Такую генетическую единицу вполне можно было бы назвать «элементом жизни» - «минимальной» клеткой. «Минимальной» клетки пока не существует, а организм с синтетическим геномом уже есть Mycoplasma laboratorium - бактерия, ДНК которой является полностью синтезированой. Синтетическая хромосома M. genitalium JCVI-1. 0 имеет молекулярную массу 360, 110 килодальтон (k. Da) и содержит 517 генов, из которых 482 кодируют белки.

Минимальный геном • • Секвенировали геном обычного штамма Mycoplasma genitalium. Химическими методами синтезировали 101 модуль ДНК. Для того, чтобы синтетический геном можно было отличить от естественного, в него встроили короткие последовательности ДНК, кодирующие информацию, не встречающуюся в природе. После этого ли разработали 5 -ступенчатый процесс последовательной сборки модулей в более крупные фрагменты. На первом этапе объединение четверок модулей позволило получить 25 фрагментов ДНК, их клонировали в бактериях Escherichia coli. E. coli не могут синтезировать фрагменты ДНК необходимого им размера и, в поисках замены, обнаружили, что дрожжи способны не только клонировать крупные фрагменты ДНК, но и объединять их между собой с помощью механизма гомологичной рекомбинации. В результате четвертинки генома были успешно объединены в одно целое, содержащее более 580 000 пар нуклеотидных оснований. Полученную хромосому снова секвенировали для подтверждения точности химической структуры.

Минимальный геном • • • В 1996 г. Аркадий Мушегян и Евгений Кунин (США) предположили, что 256 ортологичных генов, общих для Haemophilus influenzae и Mycoplasma genitalium, являются хорошим приближением к минимальному набору генов бактериальной клетки. В 2004 г. группа исследователей (Испания) предложила набор из 206 кодирующих белки генов, полученный в результате анализа нескольких бактериальных геномов. К 2005 г. расширили список жизненно необходимых генов до 382. В дальнейшем были обнаружены бактериальные геномы меньшего размера. В 2003 году был секвенирован геном Nanoarchaeum equitans размером 490 885 пар. Установлено также, что несеквенированный геном вида Buchnera имеет длину около 450 тыс. пар. В 2006 г. секвенировали геном внутриклеточного эндосимбионта листоблошек бактерии Carsonella, состоящий из 159 662 нуклеотидных пар и содержащий всего 182 гена, кодирующих белки.

Репликация ДНК Процесс репликации основан на комплементарном спаривании оснований и предполагает обязательное разделение двух цепей ДНК и узнавание каждого нуклеотида в ДНК свободным комплементарным нуклеотидом.

Механизмы репликации ДНК • 3 альтернативные гипотезы репликации: • консервативная, • полуконсервативная (каждая молекула ДНК состоит из одной цепи исходной молекулы и одной вновь синтезированной цепи), • дисперсионная.

Механизмы репликации ДНК • 1957 г. А. Корнберг обнаружил ДНК-полимеразу I – фермент, катализирующий процесс полимеризации ДНК из нуклеотидов. Этот фермент способен наращивать ДНК только на 3΄– конце. • 1958 г. Подтверждена гипотеза полуконсервативной репликации (эксперимент Мезельсона-Сталя)

Механизмы репликации ДНК • Реплицирующуюся ДНК бактерии можно наблюдать в электронном микроскопе, у нее вначале образуется "глазок", затем он расширяется, в конце концов вся кольцевая молекула ДНК оказывается реплицированной. • Репликация всегда начинается в определенной области, Ori. С, и идет в основном симметрично по правому и левому полукружию хромосомы к конечной точке, Тег. С. • Такой механизм носит название Өмеханизм.

Расхождение хромосом • Специфические мембранные белки обеспечивают контакт ДНК с внутренней поверхностью цитоплазматической мембраны. Наиболее типичным является формирование подобного контакта в зоне мезосомы, положение которого соответствует точке старта репликации ДНК. • Завершение репликации служит началом для клеточного деления. • Дуплицированные геномы сегрегируют по одному в каждую дочернюю клетку.

Современная модель репликации

ДНК-праймаза • ДНК-полимеразы способны только добавлять новые нуклеотиды к уже имеющему с 3’-ОН-концу полинуклеотидной цепи. Эту предобразованную цепь называют затравкой или праймером. • Фермент синтезирующий из рибонуклеозидтрифосфатов праймеры называется ДНК-праймазой. • Молекула праймазы непосредственно сцепленная с ДНК-геликазой – расплетающим двойную спираль ферментом, образуют вместе с ней на отстающей цепи структуру, называемую праймосомой.

Расплетание ДНК перед репликационной вилкой • Двойная спираль ДНК должна расплетаться по ходу продвижения репликационной вилки, чтобы поступающие дезоксирибонуклеозидтрифосфаты могли спариваться с родительской матричной цепью. Однако, в обычных условиях двойная спираль весьма стабильна. • Ферменты ДНК-геликазы присоединяются к одноцепочечной ДНК и двигаясь вдоль расплетают двойные участки. В области репликационной вилки работают две ДНКгеликазы, одна из которых перемещается по ведущей, а другая по отстающей цепи, т. е. движутся в противоположных направлениях. • Белки, связывающиеся с одноцепочечной ДНК (SSB-белки) оставляют основания доступными для спаривания.

«Репликационная машина» • Позади «репликационной машины» по ходу её движения остаётся на отстающей цепи ряд несшитых фрагментов Оказаки, всё ещё содержащих РНК-затравки, которые должны быть сшиты при помощи репарирующих ферментов, работающих позади репликационной вилки. • Чтобы репликационная вилка могла продвигаться вперёд, вся хромосома впереди неё должна быстро вращаться. Это решается образованием в спирали своего рода «шарнира» , особого класса белков, называемых ДНК-топоизомеразами (типа I и II), которые разрывают цепь и присоединяются к разорванному концу.

Ферменты репликации • ДНК – полимераза I: репаративный синтез ДНК в двух процессах: вырезает повреждённые участки одной цепи и застраивает брешь комплиментарными нуклеотидами; удаляет затравочную РНК. • ДНК – полимераза II: обуславливает начало синтеза каждого нового фрагмента (инициация), окончание синтеза фрагмента (терминация). • ДНК – полимераза III: наращивание синтезируемой цепи в длину – элонгация. • ДНК – праймаза: синтез затравочной РНК. • ДНК – геликаза: раскручивание спирали ДНК. • ДНК – лигаза: сшивает разрывы в цепи ДНК при синтезе фрагментов Оказаки и репарации. • Топоизомеразы: проводят временный разрыв в одной цепи или разрыв двойной спирали. • ДНК – гираза: поддерживает сверх спирализацию и ослабляет напряжение скручивания перед репликационной вилкой. • Белок SSB: предохраняет одноцепочечную ДНК в процессе репликации, репарации и рекомбинации.