Молекулярно-генетические методы диагностики
молекулярно-генетические методы .ppt
- Количество слайдов: 43
Молекулярно-генетические методы диагностики
Общие методы l Выделение ДНК l Полимеразная цепная реакция l Рестрикционный анализ l Электрофорез в полиакриламидном и агарозном геле l Блотинг по Саузерну
Оборудование для ДНК- диагностики l Амплификаторы l Термостаты настольные для пробирок (от 25 -95 С) l Центрифуга для микропробирок l Трансилюминатор
Выделение ДНК l Образец- любые ядросодержащие клетки l Фенол-хлороформный метод экстракции ДНК l Выделение с использованием ион- обменных смол
Источники геномной ДНК l Цельная кровь l Культура клеток l Букальный эпителий l Пятна высушенной крови Другие источники l Сыворотка, плазма крови, образцы мочи, образцы тканей При делециях мт. ДНК предпочтительный материал – образец мышечной ткани
Электрофорезная камера Буфер Фрагменты ДНК Агарозный гель Чем меньше фрагменты ДНК, тем быстрее они передвигаются в геле
Электрофорез
ПЦР l Состав реакционной смеси: Образец Буфер, содержащий ионы магния Смесь д. НТФ Taq-полимераза Специфические олигонуклеотидные праймеры
ПЦР l Стадии ПЦР Денатурация Отжиг Элонгация
ПЦР полимеразная цепная реакция
Специфичность ПЦР
ДНК-диагностика l Подтверждение диагноза l Диагностика носительства l Пресимптоматическая диагностика l Пренатальная (дородовая) диагностика l Предимплантационная диагностика
Прямая ДНК-диагностика Определение мутации, являющейся непосредственной причиной заболевания Косвенная ДНК-диагностика Определение хромосомы, несущей поврежденный ген при семейном анализе
ДНК-ДИАГНОСТИКА l ПРЯМАЯ ДНК- КОСВЕННАЯ ДИАГНОСТИКА ДНК-ДИАГНОСТИ КА l Возможна только когда l Возможна когда известно известна структура гена положение гена, а мутация или последовательность неизвестны l Возможна и без больного члена l обязательно проведение семейного семьи ( анализ ДНК родителей анализа и анализ образца больного пробанда) члена семьи l Высокая точность l Точность зависит от расположения l Возможна при полилокусном маркеров заболевании l Обязательно наличие одного локуса заболевания
Прямая ДНК-диагностика l ПЦР ( мультиплексная ПЦР, аллель- специфическая амплификация, ПДАФ) l ПЦР-ПДРФ анализ ( анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов) l Секвенирование (определение последовательности) гена l Блотинг по Саузерну l Биочипы
ПДАФ l Полиморфизм длины амплифицированных фрагментов Примеры : регистрация небольших делеций и дупликаций ДНК-диагностика частой мутации ΔF 508 при муковисцидозе ДНК-диагностика заболеваний, связанных с экспрессией тринуклеотидных повторов
Аллель-специфичная ПЦР l Один из праймеров коплементарен мутантному аллелю, другой- нормальному. Обратный праймер – общий для двух реакций N M N M 1 2 3
Эндонуклеазы рестрикции l Ферменты, узнающие определенные короткие (4 -8 пн) последовательности в ДНК (сайты) и разрезающие двухцепочечную ДНК - Пример: Msp. I (CCGG) GCTGATCCGGGGCATGGTTCCGGAT
ПДРФ анализ --------CCGG-------норма режет --------CCGA-------мутация не режет Msp. I узнает 100 пн 300 пн последовательность ’CCGG, 400 пн соответствующую нормальному 400 пн аллелю 300 пн 100 пн
Пример: КЛАССИЧЕСКАЯ ГАЛАКТОЗЕМИЯ 5’ экзоны: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Характеристика гена GALT - локализация гена 9 p 13 - 11 экзонов Характеристика мутации - Описано более 160 различных мутаций - Мутации Q 188 R, K 285 N обуславливают тяжелый фенотип (самые частые мутации 70 -80% аллелей) - N 314 D обуславливает, т. н. вариант Дуарте - S 135 L обуславливает легкий фенотип (62 % аллелей, Африка)
ДЕТЕКЦИЯ МУТАЦИИ Q 188 R (исчезновение сайта рестрикции) 1. ПЦР экзонов 5 -6 гена GALT – 377 п. н. фрагмент размером 477 п. н. 2. Рестрикционный анализ с 270 п. н. использованием фермента рестрикции Bst 2 UI (CC^WGG) 3. При мутации Q 188 R исчезает сайт рестрикции для Bst 2 U I и появляется фрагмент размером 377 п. н. 107 п. н. 4. На рисунке справа: 100 п. н. 1 – Q 188 R в гетерозиготном состоянии 2 – норма 1 2 3 3 - Q 188 R в гомозиготном состоянии
ДЕТЕКЦИЯ МУТАЦИИ К 285 N (появление сайта рестрикции) 1. ПЦР экзона 9 гена GALT – фрагмент размером 160 п. н. 2. Рестрикционный анализ с 160 п. н. использованием фермента рестрикции Sse 9 I (^AATT) 3. При мутации K 285 N возникает сайт рестрикции для Sse 9 I и появляются 98 п. н. фрагменты размером 98 п. н. И 62 п. н. 4. На рисунке справа: 1– Норма 62 п. н. 2 – K 285 N в гетерозиготном состоянии
Мультиплексная ПЦР l ПЦР с несколькими парами праймеров, соответствующих разным участкам гена Пример –ДНК-диагностика делеций при миодистрофии Дюшена
Методы поиска мутаций в генах l. SSCP-анализ l. Денатурирующий гель электрофорез или денатурирующая ВЭЖХ l Секвенирование l. Биочипы l. Блотинг по Саузерну (детекция крупных перестроек)
SSCP-анализ l Анализ конформационного полиморфизма однонитевой ДНК l Замена даже одного нуклеотида приводит к измененим конформации цепей, что изменяет их электрофоретическую подвижность l Чувствительность 70 -80%
Гибридизация l Комплементарное взаимодействие между одноцепочечными полинуклеотидами из разных источников меченная ДНК –проба, зонд связывается с комплементарной ей последовательностью
Блотинг l Саузерн-блотинг 1. Рестрикция 2. Разделение изучаемого фрагмента в геле 3. Денатурация 4. Перенос на мембрану 5. Гибридизация с меченной пробой
Делеции мт. ДНК Del N 8000 пн 12 000 пн 16500 пн 8500 пн 4500 пн
Биочипы l Матрица на которую нанесены тысячи олигонуклеотидов Олигонуклеотиды специфично гибридизуются с меченными молекулами ДНК
Секвенирование ДНК
Косвенная ДНК-диагностика l Основана анализе 1 2 3 4 сцепления l Анализ полиморфных маркеров ДНК 1 4 2 3 1 3
Вариабельность ДНК l Около 99, 7% ДНК-последовательности у всех людей идентичны l Около 0, 3% (примерно 10 000 нуклеотидов) различаются между отдельными индивидами.
Полиморфные варианты ДНК l Различия в последовательности ДНК (Однонуклеотидные полиморфизмы – SNP) ------AGGCTG------- ------AAGCTG------- l Различия в длине последовательностей -----AATG--------AATG-------
Повторяющиеся последовательности l Сателлитная ДНК – размер повторяющегося элемента от нескольких сотен до нескольких тысяч пн l Минисательтная ДНК (VNTR – variant number tandem repeats) размер повторяющегося элемента 10 -100 пн l Микросательтная ДНК (STR – short tandem repeats) размер повторяющегося элемента 2 -6 пн
Номенклатура ДНК- маркеров l ДНК-маркеры, расположенные за пределами гена обозначаются согласно их положению на хромосоме. D 16 S 539 D – ДНК 16 - хромосома S – единичная копия последовательности 539 - 539 локус описанный на хромосоме 16
Выбор ДНК-маркеров l Внутригенные ДНК-маркеры (полиморфизмы в генах ) l Расположенные близко к исследуемому гену. Фланкирующие ген с теломерной и центромерной сторон
l. Чем ближе расположены маркеры к гену, те чем теснее они сцеплены, тем ниже процент ошибки A 4 A 3 A 4 A 3 A 4 Н М Н М A 1 М Н A 2 A 1 A 2 A 1 l. Расстояниеоценивают в сантиморганидах (1 СМ – 1%- 1000 пн)
?
Пример ? 105 пн 99 пн 96 пн 90 пн
Пример ? 105 пн 99 пн 96 пн 90 пн
Пример ? 105 пн 99 пн 96 пн 90 пн
ДНК-диагностика § по возможности использовать несколько подходов к диагностике (например, прямые и косвенные) § анализ семейного материала даже в случае прямой диагностики § Контроль воспроизводимости результатов § Контроль на загрязнение плодного материала материнским
Номенклатура ДНК- маркеров l Еслимаркер находится внутри гена, то для обозначения используют сокращенное наименование гена HUMTH 01 HUM- Геном человека TH-Ген тирозин гидроксилазы 01 –интрон 1 данного гена