Молекулярно-генетические методы диагностики

Скачать презентацию Молекулярно-генетические  методы диагностики Скачать презентацию Молекулярно-генетические методы диагностики

молекулярно-генетические методы .ppt

  • Количество слайдов: 43

>Молекулярно-генетические  методы диагностики Молекулярно-генетические методы диагностики

>   Общие методы l Выделение ДНК l Полимеразная цепная реакция l Рестрикционный Общие методы l Выделение ДНК l Полимеразная цепная реакция l Рестрикционный анализ l Электрофорез в полиакриламидном и агарозном геле l Блотинг по Саузерну

>  Оборудование для ДНК-   диагностики l Амплификаторы l Термостаты  настольные Оборудование для ДНК- диагностики l Амплификаторы l Термостаты настольные для пробирок (от 25 -95 С) l Центрифуга для микропробирок l Трансилюминатор

>  Выделение ДНК l Образец-  любые ядросодержащие  клетки l Фенол-хлороформный метод Выделение ДНК l Образец- любые ядросодержащие клетки l Фенол-хлороформный метод экстракции ДНК l Выделение с использованием ион- обменных смол

>Источники геномной ДНК l Цельная кровь l Культура клеток l Букальный эпителий l Пятна Источники геномной ДНК l Цельная кровь l Культура клеток l Букальный эпителий l Пятна высушенной крови Другие источники l Сыворотка, плазма крови, образцы мочи, образцы тканей При делециях мт. ДНК предпочтительный материал – образец мышечной ткани

>  Электрофорезная камера Буфер Фрагменты ДНК   Агарозный гель   Чем Электрофорезная камера Буфер Фрагменты ДНК Агарозный гель Чем меньше фрагменты ДНК, тем быстрее они передвигаются в геле

>Электрофорез Электрофорез

>   ПЦР l Состав  реакционной смеси: Образец Буфер, содержащий ионы магния ПЦР l Состав реакционной смеси: Образец Буфер, содержащий ионы магния Смесь д. НТФ Taq-полимераза Специфические олигонуклеотидные праймеры

>    ПЦР l Стадии  ПЦР   Денатурация  ПЦР l Стадии ПЦР Денатурация Отжиг Элонгация

>  ПЦР полимеразная цепная  реакция ПЦР полимеразная цепная реакция

>Специфичность ПЦР Специфичность ПЦР

>  ДНК-диагностика l Подтверждение диагноза l Диагностика носительства l Пресимптоматическая диагностика l Пренатальная ДНК-диагностика l Подтверждение диагноза l Диагностика носительства l Пресимптоматическая диагностика l Пренатальная (дородовая) диагностика l Предимплантационная диагностика

>  Прямая ДНК-диагностика Определение мутации, являющейся непосредственной причиной заболевания Косвенная ДНК-диагностика  Определение Прямая ДНК-диагностика Определение мутации, являющейся непосредственной причиной заболевания Косвенная ДНК-диагностика Определение хромосомы, несущей поврежденный ген при семейном анализе

>  ДНК-ДИАГНОСТИКА l  ПРЯМАЯ ДНК-    КОСВЕННАЯ   ДИАГНОСТИКА ДНК-ДИАГНОСТИКА l ПРЯМАЯ ДНК- КОСВЕННАЯ ДИАГНОСТИКА ДНК-ДИАГНОСТИ КА l Возможна только когда l Возможна когда известно известна структура гена положение гена, а мутация или последовательность неизвестны l Возможна и без больного члена l обязательно проведение семейного семьи ( анализ ДНК родителей анализа и анализ образца больного пробанда) члена семьи l Высокая точность l Точность зависит от расположения l Возможна при полилокусном маркеров заболевании l Обязательно наличие одного локуса заболевания

>  Прямая ДНК-диагностика l  ПЦР ( мультиплексная ПЦР, аллель- специфическая амплификация, ПДАФ) Прямая ДНК-диагностика l ПЦР ( мультиплексная ПЦР, аллель- специфическая амплификация, ПДАФ) l ПЦР-ПДРФ анализ ( анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов) l Секвенирование (определение последовательности) гена l Блотинг по Саузерну l Биочипы

>   ПДАФ l Полиморфизм длины амплифицированных  фрагментов Примеры : регистрация небольших ПДАФ l Полиморфизм длины амплифицированных фрагментов Примеры : регистрация небольших делеций и дупликаций ДНК-диагностика частой мутации ΔF 508 при муковисцидозе ДНК-диагностика заболеваний, связанных с экспрессией тринуклеотидных повторов

>Аллель-специфичная ПЦР    l  Один из праймеров    коплементарен Аллель-специфичная ПЦР l Один из праймеров коплементарен мутантному аллелю, другой- нормальному. Обратный праймер – общий для двух реакций N M N M 1 2 3

> Эндонуклеазы рестрикции l Ферменты,  узнающие определенные  короткие (4 -8 пн) последовательности Эндонуклеазы рестрикции l Ферменты, узнающие определенные короткие (4 -8 пн) последовательности в ДНК (сайты) и разрезающие двухцепочечную ДНК - Пример: Msp. I (CCGG) GCTGATCCGGGGCATGGTTCCGGAT

>     ПДРФ анализ     --------CCGG-------норма режет ПДРФ анализ --------CCGG-------норма режет --------CCGA-------мутация не режет Msp. I узнает 100 пн 300 пн последовательность ’CCGG, 400 пн соответствующую нормальному 400 пн аллелю 300 пн 100 пн

>  Пример: КЛАССИЧЕСКАЯ    ГАЛАКТОЗЕМИЯ 5’ экзоны:   1 Пример: КЛАССИЧЕСКАЯ ГАЛАКТОЗЕМИЯ 5’ экзоны: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Характеристика гена GALT - локализация гена 9 p 13 - 11 экзонов Характеристика мутации - Описано более 160 различных мутаций - Мутации Q 188 R, K 285 N обуславливают тяжелый фенотип (самые частые мутации 70 -80% аллелей) - N 314 D обуславливает, т. н. вариант Дуарте - S 135 L обуславливает легкий фенотип (62 % аллелей, Африка)

>  ДЕТЕКЦИЯ МУТАЦИИ Q 188 R    (исчезновение сайта рестрикции) 1. ДЕТЕКЦИЯ МУТАЦИИ Q 188 R (исчезновение сайта рестрикции) 1. ПЦР экзонов 5 -6 гена GALT – 377 п. н. фрагмент размером 477 п. н. 2. Рестрикционный анализ с 270 п. н. использованием фермента рестрикции Bst 2 UI (CC^WGG) 3. При мутации Q 188 R исчезает сайт рестрикции для Bst 2 U I и появляется фрагмент размером 377 п. н. 107 п. н. 4. На рисунке справа: 100 п. н. 1 – Q 188 R в гетерозиготном состоянии 2 – норма 1 2 3 3 - Q 188 R в гомозиготном состоянии

>  ДЕТЕКЦИЯ МУТАЦИИ К 285 N  (появление сайта рестрикции) 1. ПЦР экзона ДЕТЕКЦИЯ МУТАЦИИ К 285 N (появление сайта рестрикции) 1. ПЦР экзона 9 гена GALT – фрагмент размером 160 п. н. 2. Рестрикционный анализ с 160 п. н. использованием фермента рестрикции Sse 9 I (^AATT) 3. При мутации K 285 N возникает сайт рестрикции для Sse 9 I и появляются 98 п. н. фрагменты размером 98 п. н. И 62 п. н. 4. На рисунке справа: 1– Норма 62 п. н. 2 – K 285 N в гетерозиготном состоянии

>  Мультиплексная ПЦР l ПЦР с несколькими парами праймеров,  соответствующих разным участкам Мультиплексная ПЦР l ПЦР с несколькими парами праймеров, соответствующих разным участкам гена Пример –ДНК-диагностика делеций при миодистрофии Дюшена

>Методы поиска мутаций в   генах l. SSCP-анализ l. Денатурирующий  гель электрофорез Методы поиска мутаций в генах l. SSCP-анализ l. Денатурирующий гель электрофорез или денатурирующая ВЭЖХ l Секвенирование l. Биочипы l. Блотинг по Саузерну (детекция крупных перестроек)

>  SSCP-анализ l Анализ конформационного  полиморфизма однонитевой ДНК l Замена даже одного SSCP-анализ l Анализ конформационного полиморфизма однонитевой ДНК l Замена даже одного нуклеотида приводит к измененим конформации цепей, что изменяет их электрофоретическую подвижность l Чувствительность 70 -80%

>    Гибридизация l Комплементарное взаимодействие между  одноцепочечными полинуклеотидами из Гибридизация l Комплементарное взаимодействие между одноцепочечными полинуклеотидами из разных источников меченная ДНК –проба, зонд связывается с комплементарной ей последовательностью

>Блотинг l  Саузерн-блотинг 1.  Рестрикция 2.  Разделение  изучаемого  фрагмента Блотинг l Саузерн-блотинг 1. Рестрикция 2. Разделение изучаемого фрагмента в геле 3. Денатурация 4. Перенос на мембрану 5. Гибридизация с меченной пробой

>Делеции мт. ДНК  Del N  8000 пн  12 000 пн Делеции мт. ДНК Del N 8000 пн 12 000 пн 16500 пн 8500 пн 4500 пн

>Биочипы  l  Матрица на которую  нанесены тысячи  олигонуклеотидов  Олигонуклеотиды Биочипы l Матрица на которую нанесены тысячи олигонуклеотидов Олигонуклеотиды специфично гибридизуются с меченными молекулами ДНК

>Секвенирование ДНК Секвенирование ДНК

>  Косвенная ДНК-диагностика l Основана  анализе   1  2 Косвенная ДНК-диагностика l Основана анализе 1 2 3 4 сцепления l Анализ полиморфных маркеров ДНК 1 4 2 3 1 3

>  Вариабельность ДНК l Около 99, 7% ДНК-последовательности у всех людей идентичны l Вариабельность ДНК l Около 99, 7% ДНК-последовательности у всех людей идентичны l Около 0, 3% (примерно 10 000 нуклеотидов) различаются между отдельными индивидами.

>  Полиморфные варианты  ДНК l Различия  в последовательности ДНК  (Однонуклеотидные Полиморфные варианты ДНК l Различия в последовательности ДНК (Однонуклеотидные полиморфизмы – SNP) ------AGGCTG------- ------AAGCTG------- l Различия в длине последовательностей -----AATG--------AATG-------

>  Повторяющиеся  последовательности l Сателлитная ДНК – размер повторяющегося  элемента от Повторяющиеся последовательности l Сателлитная ДНК – размер повторяющегося элемента от нескольких сотен до нескольких тысяч пн l Минисательтная ДНК (VNTR – variant number tandem repeats) размер повторяющегося элемента 10 -100 пн l Микросательтная ДНК (STR – short tandem repeats) размер повторяющегося элемента 2 -6 пн

>   Номенклатура ДНК-   маркеров l  ДНК-маркеры, расположенные за пределами Номенклатура ДНК- маркеров l ДНК-маркеры, расположенные за пределами гена обозначаются согласно их положению на хромосоме. D 16 S 539 D – ДНК 16 - хромосома S – единичная копия последовательности 539 - 539 локус описанный на хромосоме 16

> Выбор ДНК-маркеров l Внутригенные ДНК-маркеры  (полиморфизмы в генах ) l Расположенные близко Выбор ДНК-маркеров l Внутригенные ДНК-маркеры (полиморфизмы в генах ) l Расположенные близко к исследуемому гену. Фланкирующие ген с теломерной и центромерной сторон

> l. Чем ближе расположены маркеры к гену,  те чем теснее они сцеплены, l. Чем ближе расположены маркеры к гену, те чем теснее они сцеплены, тем ниже процент ошибки A 4 A 3 A 4 A 3 A 4 Н М Н М A 1 М Н A 2 A 1 A 2 A 1 l. Расстояниеоценивают в сантиморганидах (1 СМ – 1%- 1000 пн)

>? ?

>  Пример   ?    105 пн 99 пн 96 Пример ? 105 пн 99 пн 96 пн 90 пн

>  Пример   ?    105 пн 99 пн 96 Пример ? 105 пн 99 пн 96 пн 90 пн

>  Пример   ?    105 пн 99 пн 96 Пример ? 105 пн 99 пн 96 пн 90 пн

>   ДНК-диагностика § по возможности использовать несколько  подходов к диагностике (например, ДНК-диагностика § по возможности использовать несколько подходов к диагностике (например, прямые и косвенные) § анализ семейного материала даже в случае прямой диагностики § Контроль воспроизводимости результатов § Контроль на загрязнение плодного материала материнским

>   Номенклатура ДНК-   маркеров l Еслимаркер находится внутри гена, то Номенклатура ДНК- маркеров l Еслимаркер находится внутри гена, то для обозначения используют сокращенное наименование гена HUMTH 01 HUM- Геном человека TH-Ген тирозин гидроксилазы 01 –интрон 1 данного гена