МОЛЕКУЛЯРНАЯ ФИЗИОЛОГИЯ Лекция 1 Молекулярная организация и функции

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ФИЗИОЛОГИЯ Лекция 1. Молекулярная организация и функции мембран клеток Цель курса - показать достижения в современной физиологии на основе применения инновационных биомедицинских исследований и продвинуть знания студентов на новые молекулярные уровни движения физиологических процессах в организме человека

Содержание лекции • • • Молекулярная физиология – определение Методы молекулярной физиологии Свойства биологических мембран Молекулярная организация и функции надмембранных, подмембранных структур, базальной мембраны Формирование мембранных плотов Эндоцитоз и его виды Адгезивные свойства мембраны Виды и функции клеточных контактов их значение в разных типах тканей. Виды транспорта через клеточную мембрану

Молекулярная физиология – определение • Предмет молекулярной физиологии – изучение молекулярных механизмов, обеспечивающих осуществление физиологических функций организма. • Молекулярная физиология - междисциплинарное направление современной биологической науки, включающее: • классическую физиологию • молекулярную биологию, • биохимию, • биофизику и ряд других дисциплин.

Методы молекулярной физиологии: • Электрофизиологические • Молекулярные • Изобразительные подходы • Физиологи в настоящее время исследовать способность молекул, обеспечивать клеточные функции, и исследовать способность тканей влиять на функции организма.

Методы молекулярной физиологии: Конфокальная микроскопия • Марвин Ли Минский (Marvin Lee Minsky) (09. 08. 1927 г. ) Американский учёный в области искусственного интеллекта, сооснователь Лаборатории искусственного интеллекта в Массачусетском технологическом институте. • Обладатель патентов на головной графический дисплей (1963) и конфокальный сканирующий микроскоп (1961, предшественник современных широкораспространённых конфокальных лазерных сканирующих микроскопов).

Одно- и двухфотонная конфокальная микроскопия Отличие двухфотонной микроскопии от однофотонной. Зоны возбуждения флуорофоров выделены розовым цветом Трёхмерные изображения поверхности гранул пыльцы а) мультифотонная сканирующая микроскопия; b) обычная конфокальная сканирующая микроскопия.

Two-Photon Microscope Confocal Microscope Digital-Imaging Fluorescence Microscope

Современный лазерный сканирующий конфокальный микроскоп Получение серии оптических срезов (Z-серия).

Применение конфокальной микроскопии • Изучение структуры объекта (3 D- или Z-серия) • Мультиспектральные исследования. Колокализации в клетке двух и более веществ, например, разных белков. Предварительно вещества или структуры метятся антителами с разными флуоресцентными метками. колокализации в клетке двух и более веществ, например, разных белков. Предварительно вещества или структуры метятся антителами с разными флуоресцентными метками. • Динамические процессы- прослеживание в живых организмах или клетках распространения каких-либо веществ, которые обладают либо собственной флуоресценцией, либо их необходимо метить флуоресцентными зондами. Например, можно исследовать потоки ионов Са++ через клеточные мембраны с использованием красителей типа FURA или FLUO, чувствительных к концентрации ионов.

Применение конфокальной микроскопии • Fluorescence Recovery After Photobleaching (Восстановление флуоресценции после фотовыжигания) – Измерение подвижности молекул посредством инициации фотохимического разложения флуорохрома в зоне облучения. • FLAP - Fluorescence Localization After Photobleaching (Локализация флуоресценции после фотовыжигания), • FLIP - Fluorescence Loss In Photobleaching (Потеря флуоресценции во время фотовыжигания), • фотоактивация молекул

Конфокальная микроскопия • С помощью конфокального микроскопа можно получить несколько изображений виртуальных срезов клетки, или же собранную из них трехмерную модель. • Фибробласты 3 Т 3 на стенках макропоры матрикса. Оптический срез в 50 мкм от поверхности матрицы. Матрикс выявлен TRITC (показан красным), ядра фибробластов выявлены SYTOX (показаны зеленым). Изображение получено с использованием микроскопа Axiovert 200 M с конфокальной приставкой LSM 510 META

Конфокальная лазерная сканирующая система, производства "НИКОН КОРПОРЕЙШН" (Япония) Изучение внутриклеточных сверхбыстрых процессов (в частности, динамической нестабильности цитоскелета) и межмолекулярных взаимодействий в живых клетках и тканях, таких как формирование лиганд -рецепторных комплексов, индукция апоптоза, внутриклеточный транспорт; Детальное исследование морфологии фиксированных и живых клеток и тканей, наряду со спектральным исследованием; Долгосрочное наблюдение клетки в естественных условиях.

Метод поверхностного плазмонного резонанса Исследование физикохимических параметров взаимодействия отдельных высокоаффинных молекул, таких как рекомбинатные антитела и их антигены.

Метод поверхностного плазмонного резонанса • Метод поверхностного плазмонного резонанса широко применяется при создании химических и биологических сенсоров (биосенсоров). • При контакте с биообъектами (ДНК, вирусы, антитела) плазмонные эффекты позволяют более чем на порядок увеличить интенсивность сигналов флуоресценции, то есть значительно расширяют возможности обнаружения, идентификации и диагностики биологических объектов[1] • Метод регистрации ППР имеет преимущества перед классическими методами исследования межмолекулярного взаимодействия, поскольку не требует мечения реагентов ни радиоактивными, ни какими-либо еще метками и позволяет определять равновесные параметры взаимодействия без разделения свободных и связанных форм.

Высокочувствительное оптическое молекулярное изображение • high-resolution digital x-ray

Метод исследования движения отдельных частиц Single particle tracking (SPT) • Метод наблюдения движения отдельных частиц в среде. • Метод применяется для изучения количественного «поведения» белка на поверхности клетки. • Метод применеятс ядл понимания клеточной кинетики многих белков, например HIV-1 Tat Protein Transduction domain (Tat. PTD) • Изучения броуновской диффузии • Изучения мембранной диффузии • Метод основан на применении флуоресцентных или оптических меток. Применение оптических меток, таких как наночастиц золота, называется нановайд микроскопией. • Nanometer video-enhanced microscopy- is a microscopic technique aimed at visualizing colloidal gold particles of 20 -40 nm diameter (nanogold, immunogold) as dynamic markers at the light microscopic level.

Single molecule tracking of membrane lipids glycosylphosphatidylinositol (GPI) coupled Green uorescent protein (GFP) labeled with Quantum dot Дендритный компартмент Аксонный компартмент Example of a quantum dot labeled GFP-GPI on dendrites and axons of cultured hippocampal neurons 14 DIV, trajectories (red) are from 1 min recording at 30 Hz acquisition frequenc

Quantum dots • Alexey I. Ekimov is a Russian solid state physicist who discovered the semiconductor nanocrystals known as quantum dots, while working at the Vavilov State Optical Institute. He was awarded the 1975 USSR State Prize in Science and Engineering for work on electron spin orientation in semiconductors. • Self-assembled quantum dots are typically between 10 and 50 nm in size. • He is co-recipient of the 2006 R. W. Wood prize of the Optical Society of America for "discovery of nanocrystal quantum dots and pioneering studies of their electronic and optical properties". • He currently works for Nanocrystals Technology Inc. • The usage of quantum dots for highly sensitive cellular imaging has seen major advances over the past decade.

The patch clamp technique is a laboratory technique in electrophysiology that allows the study of single or multiple ion channels in cells. Neher and Sakmann received the Nobel Prize in Physiology or Medicine in 1991 for this work.

Patch-clamp

Patch-clamp

Patch-clamp

Micro. PET Imaging

Некоторые функции биологических мембран • Активный транспорт ионов K+, Na+, Ca 2+, подержание осмотического равновесия • Связывание гормонов и включение механизмов внутриклеточной сигнализации • Генерация потенциалов покоя и действия, распространение потенциала действия • Перенос электронов на кислород и синтез АТФ (окислительное фосфорилирование) • Перенос ионов кальция из клеточного сока внутрь везикул • Поглощение квантов света и генерация внутриклеточного сигнала

Структура мембран

Мембраны клетки

Эндоцитоз / экзоцитоз

Структурная функция мембран

Особенности мембраны клеток

Исследование динамики мембранных белков

Основные липидные компоненты мембран

Схема структуры мембраны

Липидные компоненты мембран Фосфатидилхолин Сфингомиелин и холестерол

Молекулярная организация динамики бислоя мембраны Фосфатидилхолин Фосфатидилэтаноламин

Интегральный мембранный белок Интегральные белки обеспечивают селективный обмен ионов через каналы мембран между экстрацеллюлярной и интрацеллюлярной жидкостью, а также действуют как белки — переносчики крупных молекул.

Интегральный мембранный белок

Надмембранный комплекс аппарата клеток • Надмембранный комплекс поверхностного аппарата клеток характеризуется многообразием строения. • Универсальным компонентом надмембранного комплекса эукариот являются углеводы - компоненты гликолипидов и гликопротеинов плазмалеммы. Благодаря этому его исходно называли гликокаликсом (от греч. гликос - сладкий, углевод и лат. каллум - толстая кожа, оболочка). • Кроме углеводов, в состав гликокаликса относят периферические белки над билипидным слоем.

Функции гликокаликса • Гликокаликс — «заякоренные» в плазмолемме молекулы олигосахаридов, полисахаридов, гликопротеинов и гликолипидов. Гликокаликс выполняет рецепторную и маркерную функции, а также участвует в обеспечении избирательности транспорта веществ и пристеночном (примембранном) пищеварении.

Периферические белки • Периферические белки почти все функционируют как энзимы (ацетилхолинестераза, кислая и шелочная фосфатазы и др. ). Но некоторые энзимы также представлены интегральными белками — АТФ-аза.

Сопряжение гликокаликсной сети с цитоскелетом

Подмембранные белки • Субмембранный (от лат. суб - под) комплекс характерен только для эукариотических клеток. Он состоит из разнообразных белковых нитевидных структур: тонких фибрилл (от лат. фибрилла - волоконце, ниточка), микрофибрилл (от греч. микрос малый), скелетных (от греч. скелетон высушенное) фибрилл и микротрубочек. Они связаны друг с другом белками и формируют опорно-сократительный аппарат клетки.

Структура и функции

Микрофиламенты и промежуточные волокна • • Микрофиламенты, построенные из F-актина, пронизывают микроворсинки, образуя узлы. Эти микроволокна удерживаются вместе с помощью актинсвязывающих белков, наиболее важными из которых являются фимбрин и виллин. Кальмодулин и миозиноподобная АТФ-аза соединяют крайние микроволокна с плазматической мембраной. Еще один актинсвязывающий белок, фодрин, соединяет волокна актина у основании, а также прикрепляет их к цитоплазматической мембране и к сетке, построенной из промежуточных волокон. Микротрубочки принимают участие в поддержании формы клетки. Они же служат направляющими «рельсами» для транспорта органелл. Вместе с ассоциированными белками (динеин, кинезин) микротрубочки способны осуществлять механическую работу, например транспорт митохондрий, движение ресничек (волосоподобных выростов клеток в эпителии легких, кишечника и яйцеводов) и биение жгутика сперматозоида. Кроме того, микротрубочки выполняют важные функции во время деления клеток.

Функция цитоскелета • • Цитоскелект выполняет несколько ключевых функций: Он выполняет структурную функцию в клетках и выступает в качестве каркаса для прикрепления большинства органелл. Он ответсвенен за способность клеток к движению. Он необходим для правильного деления клеток в процессе их воспроизводства. Каркас представляет собой динамичную структуру, которая постоянно обновляется по мере изменения внешних условий и состояния клетки.

• Служит клетке механическим каркасом, который придает клетке типическую форму и обеспечивает связь между мембраной и органеллами. Каркас представляет собой динамичную структуру, которая постоянно обновляется по мере изменения внешних условий и состояния клетки.

Надмембранные и подмембранные белки GPI anchor is a glycolipid that can be attached to the C -terminus of a protein Acylation is the process of adding an acyl group to a compound. Prenylation ( lipidation) is the addition of hydrophobic molecules to a protein or chemical compound

Антигены мембраны эритроцитов. Система АВО

Активное место надмембранного белка The active site is the small port of an enzyme where substrate molecules bind and undergo a chemical reaction.

Внеклеточные матриксные белки Fibronectin is a high-molecular weight (~440 k. Da) glycoprotein of the extracellular matrix that binds to membrane-spanning receptor proteins called integrins. insoluble cellular fibronectin is a major component of the extracellular matrix.

Функции некоторых внеклеточных матриксных белков • Fibronectin is a high-molecular weight (~440 k. Da) glycoprotein of the extracellular matrix that binds to membrane-spanning receptor proteins called integrins. insoluble cellular fibronectin is a major component of the extracellular matrix. • Proteoglycans are a major component of the animal extracellular matrix, • involved in binding cations (such as sodium, potassium and calcium) and water, and also regulating the movement of molecules through the matrix. • Nidogen/entactin basement membrane sulfated glycoprotein);

Липидный рафт • Липидный рафт (дословно липидный плот, англ. lipid raft) — микродомен липидного бислоя клеточной мембраны, обогащённый холестерином, сфинголипидами и насыщенными фосфолипидами. • Это участок плотно-упакованного липида, «плавающего» на поверхности «жидкого» фосфолипида (отсюда название липидный плот). • Липидный рафт относительно нерастворим в окружающем липиде, представляет собой достаточно гетерогенную и нестабильную структуру размером от 50 до 200 нм. • Встраивание специфических мембранных белков в липидный рафт приводит к его стабилизации. • Связывание лигандов с рецепторами или гликосфинголипидами, локализующимся в таких рафтах, приводит к их слиянию и запускает передачу внутриклеточного сигнала.

Мембранные плоты липидов • Плазменная мембрана клеток сделана из комбинации glycosphingolipids и рецепторов белка, организованных в glycolipoprotein микрообластях, которые называют плотами липида. • Эти специализированные мембранные микрообласти разделяют клеточные процессы, служа организацией центров собрания сигнальных молекул, влияния на мембранную текучесть и мембранную торговлю белком, и регулирование neurotransmission и торговлю рецептором. • Плоты липида более заказаны и плотно переполнены чем окружающий двойной слой, но плавают свободно в мембранном двойном слое.

Схема строения липидного плота (А) Внутриклеточная среда, цитоплазма, (B) внешняя среда или внутривезикулярное пространство аппарата Гольджи. Обозначения: 1. липид в жидкой неупорядоченной фазе, окружающий плотноупакованный липидный рафт (2); 3. трансмембранный белок, связанный с липидным рафтом; 4. белок клеточной мембраны; 5. олигосахаридные остатки на белке рафта (гликопротеин); 6. гликозилфосфатидилинозитол; 7. холестерин; 8. олигосахаридные остатки на липидах (гликолипид)

Мембранные плоты липидов Плоты липида содержат двойное количество холестерина, найденного в окружающем двойном слое. Кроме того, плоты липида обогащены sphingolipids, таким как sphingomyelin, который как правило поднимается на 50 % выше по сравнению с плазменной мембраной.

Формирование цитозольных структур мембраны

Acetyl-Co. A/Cholesterol

Эндоцитоз / экзоцитоз

Эндоцито з • Эндоцито з (англ. endocytosis) — процесс захвата (интернализации) внешнего материала клеткой, осуществляемый путём образования мембранных везикул. • В результате эндоцитоза клетка получает для своей жизнедеятельности гидрофильный материал, который иначе не проникает через липидный бислой клеточной мембраны. Различают фагоцитоз, пиноцитоз и рецепторопосредованный эндоцитоз.

Фагоцито з • Фагоцито з (др. -греч. φαγεῖν — пожирать и κύτος — клетка) — процесс, при котором специально предназначенные для этого клетки крови и тканей организма (фагоциты) захватывают и переваривают твёрдые частицы. Осуществляется двумя разновидностями клеток: циркулирующими в крови зернистыми лейкоцитами (гранулоцитами) и тканевыми макрофагами. • У человека различают два типа профессиональных фагоцитов: • нейтрофилы • моноциты (в ткани — макрофаги)

Пиноцитоз • Пиноцитоз (питьё клеткой) — процесс поглощения клеткой жидкой фазы из окружающей среды, содержащей растворимые вещества, включая крупные молекулы (белки, полисахариды и др. ). • При пиноцитозе от мембраны отшнуровываются внутрь клетки небольшие пузырьки — эндосомы. • Они меньше фагосом (их размер до 150 нм) и обычно не содержат крупных частиц. • После образования эндосомы к ней подходит первичная лизосома, и эти два мембранных пузырька сливаются. • Образовавшаяся органелла носит название вторичной лизосомы. • Процесс пиноцитоза постоянно осуществляют все эукариотические клетки.

Рецептор-опосредованный эндоцитоз • Рецептор-опосредованный эндоцитоз — активный специфический процесс, при котором клеточная мембрана выпучивается внутрь клетки, формируя окаймлённые ямки. • Внутриклеточная сторона окаймлённой ямки содержит набор адаптивных белков (адаптин, клатрин, обуславливающий необходимую кривизну выпучивания, и др. белки). • Макромолекулы, связывающиеся со специфическими рецепторами на поверхности клетки, проходят внутрь со значительно большей скоростью, чем вещества, поступающие в клетки за счет пиноцитоза. • Внешняя сторона мембраны при этом включает специфические рецепторы (например, ЛПНП-рецептор)

Рецептор-опосредованный эндоцитоз • Рецептор-опосредованный эндоцитоз включается для быстрого и контролируемого поглощения клеткой соответствующего лиганда (например, ЛПНП). • Пузырьки быстро теряют свою кайму и сливаются между собой, образуя более крупные пузырьки — эндосомы. • Эндосомы сливаются с первичными лизосомами, в результате чего формируются вторичные лизосомы. • Например, когда животной клетке необходим холестерин для синтеза мембраны, она экспрессирует ЛПНП-рецепторы на плазматической мембране. Богатые холестерином и эфирами холестерина ЛПНП, связавшиеся с ЛПНП-рецепторами, быстро доставляют холестерин в клетку.

Адгезивные свойства мембраны клеток

Виды и функции межклеточных контактов

Межклеточные контакты

Виды и функции межклеточных контактов

Виды и функции межклеточных контактов

Межклеточные адгезии

Клеточно-клеточная адгезия. Кадрегин

Клеточно-клеточная адгезия. Десмосомальный кадрегин

Клеточно-матриксные адгезии. Полудесмосомы

Функции субпопуляций интегринов

Клеточно-клеточные адгезии. Плотные контакты (Tight junction) Белки tight junction

Клеточно-клеточные адгезии. Gap junction

Gap junction • A gap junction or nexus or macula communicans is a specialized intercellular connection between a multitude of animal cell-types. • It directly connects the cytoplasm of two cells, which allows various molecules and ions to pass freely between cells. • One gap junction channel is composed of two connexons (or hemichannels) which connect across the intercellular space. • At gap junctions, the intercellular space is 4 nm • Gap junctions are analogous to the plasmodesmata that join plant cells.

Базальная мембрана

Коллагеновые волокна. Представительство в тканях

Формирование сети

Синтез коллагена

Типы коллагеновых волокон

Базальная мембрана

Базальная мембрана

Типы взаимодействия

Внеклеточные матриксные протеины

Транспорт через клеточную мембрану

Transmembrane Transport of Ions and Small Molecules

Некоторые типы транспортеров

АТФ-зависимая помпа

Ионные каналы

Трансмембранные транспортеры

Механизмы транспорта

Скорости транспорта на примере глюкозы

Циклы транспорта

Транспорт воды

Р-класс помп P-class pumps- these transport all types of ions, although each type of pump is specific to only one or two kinds of ions. They are composed of two α subunits and sometimes two regulatory β subunits. P-class pumps use the hydrolysis of ATP to pump ions by forming a phosphorylated intermediate which results in a conformational change. Some P-class pumps can transport more than one type of ion at a time, e. g. the Na+/K+ pump. Other examples include the Ca 2+ pump found in the sarcoplasmic reticulum and the H+ pump in the plasma membrane of plants, fungi and bacteria.

V-класс помп V-class pumps. These only transport protons and do not form a phosphoprotein intermediate like P-class proteins. They have a very different structure to P-class pumps, with at least 13 subunits, all of which are unconnected to the subunits in Pclass pumps. V-class pumps are normally used to maintain a low p. H in vacuoles and lysosomes.

F-класс протонных помп F-class pumps- these are very similar to V-class pumps in that they only transport protons and do not form a phosphoprotein intermediate. They also have similar structures. However, F-class pumps transport protons down their electrochemical gradient, using the movement of the protons to power ATP synthesis, such as the ATP synthase pump found in mitochondria.

ABC суперсемейство помп ABC (ATP Binding Cassette) superfamily pumps This is a very diverse class of pumps which can transport all kinds of molecules, including polysaccharides and proteins. All pumps in the ABC superfamily contain two transmembrane domains and two cytosolic domains which bind ATP. ABC pumps are found in both prokaryotic and eukaryotic organisms and are needed for many essential functions in the human body, e. g. the CFTR pump in the membrane of epithelial cells, which can cause cystic fibrosis if mutated.

Спасибо за внимание!