Скачать презентацию Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное Скачать презентацию Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное

3efbddc839872a7749bf27929e07a448.ppt

  • Количество слайдов: 22

 Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «ОРЕНБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ» УДК 577. 23; 579. 083. 13; 577. 3. 043; 537 № госрегистрации 01201002541 Инв. № ОТЧЁТ О НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКОЙ РАБОТЕ по теме: ВЛИЯНИЕ МАГНИТНЫХ И НЕМАГНИТНЫХ ИЗОТОПОВ МАГНИЯ НА ФИЗИКОХИМИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ В КЛЕТКАХ IN VIVO (Итоговый) шифр « 2010 -1. 1 -142 -043 -00» ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОНТРАКТ № 02. 740. 11. 0703 от « 05» апреля 2010 г. в рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009 -2013 гг. , в рамках реализации мероприятия № 1. 1 Проведение научных исследований коллективами научно-образовательных центров в области физико-химической молекулярной и клеточной биологии. Научный руководитель д. ф. -м. н. В. Л. Бердинский Оренбург 2013 г.

Экспериментальные и теоретические исследования I этапа Теоретический расчёт эффектов внешнего постоянного магнитного поля и Экспериментальные и теоретические исследования I этапа Теоретический расчёт эффектов внешнего постоянного магнитного поля и ядерного спина магнитного изотопа 25 Мg на скорости ферментативных процессов в клетках живых организмов, в том числе на скорость синтеза молекулы АТФ Создание методики исследования влияния изотопов магния 24 Мg, 25 Мg и 26 Мg на рост, развитие и старение прокариотических бактериальных клеток Е. соli in vivo. Разработка методов приготовления питательных сред, обогащенных изотопами 24 Мg, 25 Мg и 26 Мg, позволяющих стимулировать и регистрировать магнитно-изотопные эффекты в молекулярной и клеточной биологии Проведение патентных исследований Разработка методики и оптимизация условий культивирования клеток на полученных питательных средах

Теоретический расчёт эффектов внешнего постоянного магнитного поля и ядерного спина магнитного изотопа 25 Мg Теоретический расчёт эффектов внешнего постоянного магнитного поля и ядерного спина магнитного изотопа 25 Мg на скорости ферментативных процессов в клетках живых организмов, в том числе на скорость синтеза молекулы АТФ Кинетическая схема образования АТФ фосфорилирующими ферментами Здесь A и В – исходные диамагнитные частицы, которые в результате переноса электрона превращаются в синглетную ион-радикальную пару [A • +, B • -]S с константой скорости k 1. Для синглетной ион-радикальной пары [A • +, B • -]S возможны три канала эволюции: 1) обратный перенос электрона на акцептор с константой скорости k-1; 2) дальнейший перенос электрона или трансформация субстратов, приводящие к образованию продуктов с константой скорости k; 3) спиновая эволюция, переводящая синглетную ИРП в триплетное состояние [A • +, B • -]T с частотой ωST, определяемую магнитными взаимодействиями неспаренных электронных спинов. Строго говоря, синглет-триплетную конверсию нельзя описывать константой скорости, так как это обратимый периодический процесс.

Результаты и выводы по теоретическим расчётам Внешнее постоянное магнитное поле за счет действия Δg-механизма Результаты и выводы по теоретическим расчётам Внешнее постоянное магнитное поле за счет действия Δg-механизма спиновой конверсии способно ускорять ферментативные ион-радикальные процессы и увеличивать выход продуктов в результате изменения соотношения синглетных и триплетных ИРП и состояний с разделенными зарядами. Эффективность действия магнитного поля определяется магнитными параметрами ион-радикальной пары, образующейся в ходе ферментативного процесса, и кинетическими параметрами фермента – константами скоростей элементарных актов ферментативных реакций. Магнитнополевые зависимости скорости образования продуктов позволяют определить кинетические параметры ферментативных реакций. Скорость образования продуктов определяется количеством ион-радикальных пар в синглетном состоянии и отношением констант скорости k исчезновения ИРП с образованием продуктов и реакции обратного переноса электрона k-1. Отношение этих констант играет роль «биохимического усилителя» , который увеличивает влияние ион-радикального механизма, делая его эффективным даже при достаточно малых концентрациях ИРП. Медленные ферментативные ион-радикальные процессы с электронным транспортом должна быть более чувствительны к влиянию внешнего магнитного поля по сравнению с быстрыми ферментативными процессами.

В итоге были подобраны следующие условия культивирования бактериальных клеток Escherichia coli на изотопно-обогащенных питательных В итоге были подобраны следующие условия культивирования бактериальных клеток Escherichia coli на изотопно-обогащенных питательных средах, позволяющие обнаружить эффект влияния изотопов на физикохимические процессы в клетках: - температура 37º С; - скорость вращения платформы шейкера для обеспечения аэрации 160 об/мин; -концентрация сульфата магния в среде 2. 2 м. М/л. Созданная методика была экспериментально проверена. Подробное описание приведено ниже. Проводилось четыре серии эксперимента с двумя параллелями в каждой серии для соответствующих немагнитных и магнитного изотопов магния. В процессе культивирования бактериальных клеток, поддерживалась постоянная, оптимальная для бактерий, температура 37º С и непрерывная аэрация путём помещения питательных сред с культурой в термостат ТСО-1/80 СПУ на шейкер ST-3 ELMI. Шейкер ST-3 – прибор, предназначенный для создания вращательного движения жидкости и точного поддержания заданной температуры в иммунологических планшетах. Скорость вращения платформы выбиралась 160 об. /мин.

Экспериментальные ростовые кривые клеточной культуры, полученные при регистрации оптической плотности на длине волны 620 Экспериментальные ростовые кривые клеточной культуры, полученные при регистрации оптической плотности на длине волны 620 нм. Аналогичные экспериментальные ростовые кривые были получены при регистрации на длинах волн 450 нм и на 492 нм. Каждая точка представляет собой среднее значение. При статистической обработке экспериментальных кривых оказалось, что продолжительность лаг-фазы значительно короче, примерно на 40 %, в том случае, когда клетки пересеиваются в среду, которая содержит магнитный изотоп 25 Mg, по сравнению с теми случаями, когда клетки пересевались в среду, содержащую немагнитный изотоп 24 Mg или немагнитный изотоп 26 Mg 1 – 24 Mg. SO 4, 2 – 25 Mg. SO 4, 3 – 26 Mg. SO 4, 4 – 24, 25, 26 Mg. SO 4 (смесь 24 Mg, 25 Mg и 26 Mg изотопов в их природном соотношении)

Экспериментальные и теоретические исследования 2 этапа проведение исследования по влиянию магнитного и немагнитных изотопов Экспериментальные и теоретические исследования 2 этапа проведение исследования по влиянию магнитного и немагнитных изотопов магния на рост, развитие и воспроизводимость бактерий E. coli; проведение исследования по влиянию магнитного и немагнитных изотопов магния на морфологию поверхностных структур бактерий E. coli с помощью метода атомно-силовой микроскопии.

Содержание изотопов магния в питательной среде М 9, % Внутриклеточное обогащение E. coli после Содержание изотопов магния в питательной среде М 9, % Внутриклеточное обогащение E. coli после культивирования в изотопсодержащих средах, % Среда M 9 с 24 Mg с 25 Mg с 26 Mg 99, 5 6, 6 10, 0 Среда M 9 с 24 Mg Среда M 9 с 25 Mg Среда M 9 с 26 Mg 24 Mg 99, 7 1, 4 4, 5 24 Mg 87, 8 25 Mg 0, 12 98, 1 0, 61 25 Mg 5, 9 0, 23 92, 5 1, 6 26 Mg 0, 13 0, 5 94, 9 26 Mg 6, 3 0, 23 0, 87 88, 4 Lb-бульон Относительное содержание элементов питательных сред М 9 C(m. Mg) – концентрация элементов в средах М 9, где m – обозначает атомную массу изотопа (24, 25 или 26), добавляемого в соответствующую питательную среду. C(24 Mg) – концентрация элементов в питательной среде М 9, содержащей изотоп магния 24 Mg

Ростовые кривые клеток E. сoli, выращенных на питательных средах М 9 с изотопами магния Ростовые кривые клеток E. сoli, выращенных на питательных средах М 9 с изотопами магния 24 Mg, 25 Mg и 26 Mg – питательная среда М 9 с соответствующим изотопом магния; *Mg – с природным магнием; **Mg – с магнием, полученным искусственно из смеси изотопов в их природном соотношении. Регистрация оптической плотности производилась на длине волны 492 нм. Все результаты были воспроизведены в 10 экспериментальных сериях, 4 из которых были «double blind» Относительные значения констант скорости роста для клеток как функция изотопии магния Относительные значения продолжительности адаптационной фазы роста как функция изотопии магния µi – константа скорости роста для клеток, выращенных на среде с i-м изотопом ; µ*Mg – константа скорости роста для клеток, ti – продолжительность адаптационной фазы для клеток, выращенных на среде с природным магнием *Mg. : 1 – выращенных на среде с i-м изотопом; t*Mg – продолжительность экспоненциальная; 2 – линейная аппроксимация адаптационной фазы для клеток, выращенных на среде с природным магнием *Mg

КОЕ клеток E. coli на стационарной фазе роста, выращенных на питательных средах М 9 КОЕ клеток E. coli на стационарной фазе роста, выращенных на питательных средах М 9 с изотопами магния 24 Mg, 25 Mg, 26 Mg и природным магнием *Mg, **Mg КОЕ клеток E. coli на начальной фазе отмирания, выращенных на питательных средах М 9 с изотопами магния 24 Mg, 25 Mg, 26 Mg Содержания АТФ в клетках E. coli, выращенных на средах с различными изотопами магния (24 Mg, 25 Mg, 26 Mg, *Mg). 8 часов культивирования Относительные значения констант скоростей отмирания клеток E. coli, как функция изотопии магния ki – константа скорости отмирания для клеток, выращенных на среде с i-м изотопом (24 Mg, 25 Mg или 26 Mg); k 24 Mg – константа скорости отмирания для клеток, выращенных на среде с изотопом магния 24 Mg

3 этап В задачи 2 года исследований входило исследование влияние изотопов магния (магнитного и 3 этап В задачи 2 года исследований входило исследование влияние изотопов магния (магнитного и немагнитных) на пострадиационное восстановление эукариотических дрожжевых клеток Saccharomyces cerevisiae. Подбирались условия культивирования на изотопных средах, питательная среда и условия обнаружения магнитно-изотопных эффектов. В качестве объекта исследования были выбраны дрожжи Saccharomyces cerevisiae LK 14. Поддержание музейной культуры проводили путем периодического пересева на скошенную твердую питательную среду – сусло-агар на основе пивного неохмеленного сусла (неохмеленное сусло (6– 7°Б) - 1 л, агар - 2 -2, 5 %). Хранение музейной культуры проводили в холодильнике при температуре +4°С. Перед началом эксперимента микробную культуру пересевали с «музейного» косяка на чашки Петри с твердой средой того же состава. Рост культуры на чашках происходил в термостате при + 32° С в течение 24 часов. Культивирование бактерий на изотопных средах, приготовление которых описано в предыдущем пункте, осуществляли при температуре + 32° С в течение 25 часов. Концентрацию клеток при культивировании в жидкой питательной среде определяли фотометрическим методом на двух длинах волн 540 и 620 нм на спектрофлуориметре «SOLAR CM 2203» . Для выявления магнитно-изотопного эффекта магния на пострадиационное восстановление клеток и последующие физико-химические процессы дрожжевые клетки, культивированные в течение 24 часов , подвергались облучению ультрафиолетовым светом. Культивирование клеток перед облучением на магний-изотопных средах необходимо для накопления микроорганизмами именно магния соответствующей изотопной формы.

Ростовые кривые для дрожжевых клеток Saccharomyces cerevisiae, культивируемых на магнийизотопных средах. control – природный Ростовые кривые для дрожжевых клеток Saccharomyces cerevisiae, культивируемых на магнийизотопных средах. control – природный магний, is 24 – 24 Mg, is 25 - 25 Mg, is 26 - 26 Mg Кривые выживаемости как функция продолжительности восстановления для клеток Saccharomyces cerevisiae, облученных УФ-светом и выращенных на магний-изотопных средах. *Mg – среда с природным магнием

Результаты исследований 3 этапа Выживаемость микроорганизмов, предварительно культивируемых на среде с магнитным изотопом магния Результаты исследований 3 этапа Выживаемость микроорганизмов, предварительно культивируемых на среде с магнитным изотопом магния 25 Mg, оказалась на 12 % выше, чем для немагнитных изотопов. Однако данные результаты в 2 случаях из 3 находятся в пределах экспериментальной ошибки. влияние магнитного изотопа магния на процессы пострадиационного восстановления, а, именно, процессов репарации, оказывается незначительным и компенсируется влиянием других факторов, общих для всех дрожжевых клеток; положительное влияние магнитного изотопа магния на синтез аденозитрифосфорной кислоты, необходимой для работы репаразных структур, предположительно, объясняет количественное преимущество выживыших дрожжевых клеток, выращенных на среде с магнием-25; для выяснения деталей полученных эффектов и механизмов действия изотопов магния на пострадиационное восстановление дрожжей требуются дополнительные эксперименты.

4 этап При выполнении НИР 4 этапа исследовалась одна из основных морфологических характеристик дрожжевых 4 этап При выполнении НИР 4 этапа исследовалась одна из основных морфологических характеристик дрожжевых клеток Saccharomyces cerevisiae с помощью электронной микроскопии, - это количество почкующихся клеток после суток культивирования на магний-изотопных средах. Статистически достоверных различий не было обнаружено. Однако дрожжи, выращенные на средах с магнитным изотопом магния, из эксперимента в эксперимент показывали большее количество почкующихся клеток. Вторая морфологическая характеристика дрожжей, исследуемая с помощью методов электронной микроскопии, - это морфометрические параметры. При статистической обработке экспериментальных данных в Statistika 6. 0, полученных при исследовании более 12 образцов дрожжевых клеток для каждого изотопа магния, не было выявлено различий в общих размерах клеток. Их средняя длина составила 13, 12± 0, 35 мкм. Линейные размеры клеток достоверно не различались для дрожжей, культивируемых на разных изотопах магния. Однако размеры митохондрий дрожжевых клеток, выращенных на среде с присутствием магнитного изотопа магния 25 Mg, были достоверно на 5 % больше, чем для клеток, выращенных на немагнитных изотопах магния. Кроме того, по своей внутриклеточной структуре Saccharomyces cerevisiae, обогащенные магнием-25, соответствовали зрелой дрожжевой кульуре: имели четко очерченные оболочки, неоднородную и зернистую цитоплазму, а также большое количество вакуолей средних размеров, - по сравнению с другими клетками. Это означает, что АТФ-синтезируещие системы наиболее активны для клеток, растущих на магнии-25, который является более эффективным кофактором для многих ферментов.

5 этап В ходе выполнения работ по 5 этапу была разработана методика исследования влияния 5 этап В ходе выполнения работ по 5 этапу была разработана методика исследования влияния внешних постоянных магнитных полей на рост и развитие бактериальных клеток E. coli, культивируемых в магний-изотопных средах. Подобранные условия культивирования соответствуют оптимальным для E. coli: температура культивирования 37°С; p. H среды 6. 8± 0. 25; концентрация сульфата магния 2. 2 ммоль/л. После внесения инокулята объёмом 50 мкл в жидкую синтетическую питательную среду М 9 объёмом 6 мл, содержащую различные изотопные формы магния, В каждое магнитное поле 100, 75, 50, 30, 20, 8, 4, 0, 4 м. Тл помещалось по два образца с культурой клеток для магнитного 25 Mg и немагнитного 24 Mg изотопа, контролем служили образцы клеток, культивируемые на среде М 9, в отсутствие магнитного поля. Поле 0, 4 м. Тл соответствуют магнитному полю, в котором растут бактерии в условиях культивирования в обычном стационарном термостате на шейкере. Клетки в этом поле были контролем.

Ростовые кривые клеток E. coli, выращенных на среде с содержанием изотопа магния: 24 Mg. Ростовые кривые клеток E. coli, выращенных на среде с содержанием изотопа магния: 24 Mg. SO 4 в слабом магнитном поле Константы скорости роста в log-фазе для клеток E. coli как функции магнитного поля для магнитного и немагнитного изотопа магния КОЕ клеток E. coli как функция магнитного поля

 В магнитном поле 75 м. Тл наблюдался пик экспериментально полученного значения КОЕ. Это В магнитном поле 75 м. Тл наблюдался пик экспериментально полученного значения КОЕ. Это говорит о том, что суммарное действие внешнего и внутреннего магнитного поля на жизнеспособность клеток максимально. Выращивание бактериальных клеток E. coli c использованием разработанной методики показало, что внешнее магнитное поле усиливает эффект магнитного изотопа магния на колониеобразующую способность клеток. Количество КОЕ (колониеобразующих единиц) для клеток, выращенных на среде с магнитным изотопом магния 25 Mg, было выше в несколько раз по сравнению с бактериями, растущими на средах с немагнитным изотопом магния 24 Mg. Достоверных различий во влиянии магнитного и немагнитных изотопов магния на рост дрожжевых клеток не обнаружено. Значение оптической плотности 0, 9 на графиках соответствует 108 клеткам в 1 мл суспензии. Однако при увеличении величины внешнего постоянного магнитного поля скорость роста дрожжевой культуры незначительно, но увеличивалась. При этом не наблюдалось различий в константах скорости роста для микроорганизмов, культивируемых на магнитном 25 Mg и немагнитном изотопе 24 Mg магния. Очевидно, что эффективность действия внешнего постоянного магнитного поля на внутриклеточные процессы с участием ионов магния значительно меньше, чем на процессы с участием других элементов, имеющих ядерный спин и магнитный момент, соответственно.

Относительное содержание химических элементов в клетках E. coli, после цикла культивирования на средах М Относительное содержание химических элементов в клетках E. coli, после цикла культивирования на средах М 9 с изотопами магния. Сi – содержание элемента в клетках, выращенных на среде с i-м изотопом (24 Mg, 25 Mg, 26 Mg); С*Mg – содержание элемента в исходной клеточной культуре, выращенной на питательной среде с природным Mg

Элементный состав клеток как функция магнитного поля Где C(isotope)/C(start)-относительное значение содержания элементов в клетках, Элементный состав клеток как функция магнитного поля Где C(isotope)/C(start)-относительное значение содержания элементов в клетках, выращенных на изотопах, к исходным клеткам

Элементный состав клеток как функция магнитного поля Где C(isotope)/C(start)-относительное значение содержания элементов в клетках, Элементный состав клеток как функция магнитного поля Где C(isotope)/C(start)-относительное значение содержания элементов в клетках, выращенных на изотопах, к исходным клеткам

 Клетки потребляют или накапливают различное количество жизненно важных элементов в зависимости от типа Клетки потребляют или накапливают различное количество жизненно важных элементов в зависимости от типа изотопов и от значения внешнего магнитного поля, влияющее на них. Как видно из полученных данных, в полях диапазоном от 0 до 100 м. Тл, потребность клеток в основных элементах, таких как Ca, Fe, Mn и др. , снижается. Область от 0 до 10 м. Тл требует дальнейших исследований. Результаты экспериментальных исследований подтверждают теоретические расчёты и коррелируют с экспериментальными данными in vitro. Внешнее магнитное поле увеличивает действие магнитного изотопа магния 25 Mg на колониеобразующую способность бактерий E. coli по сравнению с немагнитным изотопом магния 24 Mg. Это свидетельствует о способности магнитного момента ядерного спина влиять на внутриклеточные процессы, а, именно, на ферментативные процессы, идущие с переносом одного или нескольких электронов. Справедливо предположение, что внешнее магнитное поле стимулирует влияние на ферментативные процессы и других природных магнитных стабильных изотопов, которые содержатся в клетках всегда, например, изотоп фосфора 31 Р. Таким образом, в полях 0 -10 м. Т внешнее магнитное поле влияет не только на магний-зависимые клеточные подсистемы, но и на другие системы с присутствием ядерного спина. Этим объясняется наличие максимум и минимумов для содержания основных жизненно важных элементов. Экспериментальные данные для дрожжевых клеток отличались в разных экспериментальных сериях. Характер влияния внешнего постоянного магнитного поля и магнитного момента ядерного спина изотопа магния 25 Mg носил случайный характер. Поэтому эти данные не приведены.

Результаты исследований При выполнении НИР по проекту впервые в мире получены надежные экспериментальные доказательства Результаты исследований При выполнении НИР по проекту впервые в мире получены надежные экспериментальные доказательства влияния магнитных изотопов на функционирование живых организмов. Обнаружение, исследование биологических эффектов магнитных и немагнитных изотопов магния ( 24 Mg, 25 Mg и 26 Mg) и внешнего магнитного поля и их надёжное доказательство позволит создавать новые способы управления биологическими процессами в живых организмах, в т. ч. скоростью образования АТФ. Прикладное значение данной работы заключается в возможности создания принципиально новых методов лечения и профилактики болезней, а также нового класса магнитно-изотопных лекарств и биологически-активных добавок, способных стимулировать или подавлять жизненно важные внутриклеточные процессы. Было показано, что спинзависимые ион-радикальные ферментативные реакции в различных участках тел могут быть “первичным магниторецептором“ в живых организмах без создания специального органа. Продукты этих реакций “превращают” эффекты ядерного спина и магнитного поля в “биохимический отклик“ живых организмов. Рассмотрены два механизма синглет-триплетной конверсии ион-радикальных пар: g-механизм, обусловленный разностью g-факторов ионрадикалов, и СТВ-механизм, обусловленный сверхтонкими взаимодействиями неспаренных электронных спинов с ядерными спинами. Получены зависимости скоростей ферментативных реакций от величины констант сверхтонких взаимодействий, от напряженности магнитного поля и от констант скоростей элементарных актов ферментативных реакций. Исследовано влияние спинселективной рекомбинации на скорость реакции. Результаты экспериментов показали, что константа скорости роста для бактерий Escherichia coli, растущих на средах с 25 Mg, оказывается достоверно на 10 -15 % выше по сравнению с клетками, потребляющих в качестве питательного субстрата немагнитные изотопы магния 24 Mg и 26 Mg. Качественно полученные экспериментальные зависимости совпадают с данными по влиянию магнитного изотопа магния на скорость ферментативного фосфорилирования, полученными в экспериментах in vitro. Это говорит об увеличении скорости деления клеток за счёт большей скорости синтеза АТФ в присутствии магнитного изотопа 25 Mg по сравнению с немагнитными изотопами 24 Mg и 26 Mg. Полученный магнитно-изотопный эффект изотопа магния определяется, в том числе, и скоростью накопления бактериями достаточного количества макроэргических молекул АТФ, необходимого для активной жизни. При подсчёте КОЕ на стационарной фазе роста бактерий были получены результаты, которые подтверждают полученную кинетику роста микроорганизмов – на среде с магнитным изотопом 25 Mg колониеобразующая способность клеток E. coli выше 1, 5 -2 раза в различных экспериментальных сериях по сравнению с немагнитными изотопами 24, 26 Mg. Исследование влияния внешнего магнитного поля на рост бактериальных клеток и дрожжевых клеток на средах с магнитным и немагнитным изотопом магния показало, что эффект магнитного изотопа магния 25 Mg на колониеобразующую способность клеток увеличивается при включении внешнего магнитного поля по сравнению с немагнитным изотопом магния 24 Mg. Изучение изотопного и элементного состава дрожжевых и бактериальных клеток, выращенных на питательных средах в нулевом и постоянном магнитном поле 0 -100 м. Тл, обогащенных различными изотопами магния, показало, что роль магнитных изотопов в клетках не сводится к ускорению отдельных ферментативных процессов. Магнитно-изотопное обогащение клеток и изменение биологических процессов включает процессы внутриклеточной регуляции, что приводит к удалению одних химических элементов и накоплению других. Полученные экспериментальные данные и проведенные теоретические расчёты влияния магнитных поля в живых организмах открывает широкие горизонты для исследования действия стабильных магнитных изотопов жизненно важных элементов на внутриклеточные процессы. Подобные исследования станут фундаментом для новых научных направлений – спиновой биохимии и спиновой микробиологии.