Миненкова Ольга , Sigma-tau, Sp. A, Pomezia (Rome)

  • Размер: 12.4 Mегабайта
  • Количество слайдов: 80

Описание презентации Миненкова Ольга , Sigma-tau, Sp. A, Pomezia (Rome) по слайдам

Миненкова Ольга , Sigma-tau, Sp. A, Pomezia (Rome) 2014 Миненкова Ольга , Sigma-tau, Sp. A, Pomezia (Rome)

George P Smith, 1941.  Основатель метода фаговый дисплей. George P Smith, 1941. Основатель метода фаговый дисплей.

НИТЧАТЫЙ ФАГ М 13 НИТЧАТЫЙ ФАГ М

p. IIIp. VII p. IX НИТЧАТЫЙ ФАГ М 13 p. VIII p. IIIp. VII p. IX НИТЧАТЫЙ ФАГ М 13 p. VIII

p. IIIp. VII p. IX НИТЧАТЫЙ ФАГ М 13 p. VIII p. IIIp. VII p. IX НИТЧАТЫЙ ФАГ М 13 p. VIII

p. VIII p. IIIp. VII p. IX ФАГОВАЯ БИБЛИОТЕКАНИТЧАТЫЙ ФАГ М 13 p. VIII p. IIIp. VII p. IX ФАГОВАЯ БИБЛИОТЕКАНИТЧАТЫЙ ФАГ М

БЕЛОК-МИШЕНЬ АДСОРБИРОВАННЫЙ ТВЕРДОМ НОСИТЕЛЕБИБЛИОТЕКА АФФИННАЯ СЕЛЕКЦИЯ / БИОПАННИНГ БЕЛОК-МИШЕНЬ АДСОРБИРОВАННЫЙ ТВЕРДОМ НОСИТЕЛЕБИБЛИОТЕКА АФФИННАЯ СЕЛЕКЦИЯ / БИОПАННИНГ

БЕЛОК-МИШЕНЬ АДСОРБИРОВАННЫЙ ТВЕРДОМ НОСИТЕЛЕ отмывка. БИБЛИОТЕКА СЕЛЕКЦИЯ АФФИННАЯ СЕЛЕКЦИЯ / БИОПАННИНГ БЕЛОК-МИШЕНЬ АДСОРБИРОВАННЫЙ ТВЕРДОМ НОСИТЕЛЕ отмывка. БИБЛИОТЕКА СЕЛЕКЦИЯ АФФИННАЯ СЕЛЕКЦИЯ / БИОПАННИНГ

БЕЛОК-МИШЕНЬ АДСОРБИРОВАННЫЙ ТВЕРДОМ НОСИТЕЛЕ отмывка элюция ОБОГАЩЕННЫЙ ФАГОВЫЙ ПУЛБИБЛИОТЕКА СЕЛЕКЦИЯ A МПЛИФИКАЦИЯ АФФИННАЯ СЕЛЕКЦИЯ / БИОПАННИНГБЕЛОК-МИШЕНЬ АДСОРБИРОВАННЫЙ ТВЕРДОМ НОСИТЕЛЕ отмывка элюция ОБОГАЩЕННЫЙ ФАГОВЫЙ ПУЛБИБЛИОТЕКА СЕЛЕКЦИЯ A МПЛИФИКАЦИЯ АФФИННАЯ СЕЛЕКЦИЯ / БИОПАННИНГ НОВЫЙ РАУНД СЕЛЕКЦИИ

Как чужеродный полипептид может быть сшит с фаговыми белками p. III p. VI сигнальный пептид встройкаКак чужеродный полипептид может быть сшит с фаговыми белками p. III p. VI сигнальный пептид встройка N- концевой домен C- концевой домен p. III лейциновая застёжка p. III Fab

ТИПЫ ДИСПЛЕЯ НА НИТЧАТОМ ФАГЕ 3     33   3+3  ТИПЫ ДИСПЛЕЯ НА НИТЧАТОМ ФАГЕ 3 33 3+3 88 8+

ИССЛЕДОВАНИЯ СВОЙСТВ РЕКОМБИНАНТНЫХ ФАГОВ M 13 B   A E G D D P AИССЛЕДОВАНИЯ СВОЙСТВ РЕКОМБИНАНТНЫХ ФАГОВ M 13 B A E G D D P A K A. . . M 13 B 1 A E G E D P A K A. . . M 13 BOM 1 A E G E D Q A S G D P A. . . M 13 BOM 2 A E G Q A S G D P A. . . M 13 BOL 1 D H L M P D P A. . . M 13 BOL 2 A E G E D R W M P D P A. . . кислый домен 1 -6 амфипатичный домен 7 -20 гидрофобный домен 21 -39 основной домен 40 —

ИССЛЕДОВАНИЯ СВОЙСТВ РЕКОМБИНАНТНЫХ ФАГОВ КОНТУРНАЯ ДЛИНА ФАГОВ Контурные длины рекомбинантных фагов совпадают с точностью 0. 3ИССЛЕДОВАНИЯ СВОЙСТВ РЕКОМБИНАНТНЫХ ФАГОВ КОНТУРНАЯ ДЛИНА ФАГОВ Контурные длины рекомбинантных фагов совпадают с точностью 0. 3% и превышают длину исходного фага М 13 mp 10 на 10% за счет встройки гена Ар.

ПОЛУЧЕНИЕ БАКТЕРИОФАГА М 13 BOL 2 p 17 11     19 . .ПОЛУЧЕНИЕ БАКТЕРИОФАГА М 13 BOL 2 p 17 11 19 . . . G E L D R W E K I . . . M 13 BOL 1 5 6 7 8 9 D H L M P D P A K A. . . 5′. . . GCT GAG GGT GAG GAT CAC CTG ATG CCT GAT CCC GCA AAA GCG. . . 3′ 3′-CCA CTC CTA G G C TAC GGA C-5′ C AC M 13 BOL 2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 A E G E D R W M P D P A K A. . . 5′. . . GCT GAG GGT GAG GAT CGC TGG ATG CCT GAT CCC GCA AAA GCG. . . 3′ олигонуклеотид- направленный мутагенез

ИССЛЕДОВАНИЯ СВОЙСТВ РЕКОМБИНАНТНЫХ ФАГОВ ИММУНОГЕННОСТЬ А – ВИЧ-1 положительная сыворотка человека В – кроличья сыворотка анти-МИССЛЕДОВАНИЯ СВОЙСТВ РЕКОМБИНАНТНЫХ ФАГОВ ИММУНОГЕННОСТЬ А – ВИЧ-1 положительная сыворотка человека В – кроличья сыворотка анти-М 13 mp 10 C – кроличья сыворотка анти-М 13 BOL

ДЕКАПЕПТИДНЫЕ ВСТРОЙКИ ЖИЗНЕСПОСОБНЫЕ ФАГИ PM 48. 1  LRQYSAQ GA  2  RNPIYYSTT  6ДЕКАПЕПТИДНЫЕ ВСТРОЙКИ ЖИЗНЕСПОСОБНЫЕ ФАГИ PM 48. 1 LRQYSAQ GA 2 RNPIYYSTT 6 KGNF AGPSG 7 HNRSTVDIP 4 TNALQ TALP 5 RYFLNSAAP 8 RTGYGSAPT 12 YGGGRSSAT 13 GSSWGYASP 14 TPLHFDSGA 23 THYQGRAGA PCR 1 SRYHQSPGA PCR 9 LRSVNQGYA PCR 10 HPTNYYPGS PCR 12 QHADLVSLP PCR 13 PYRSPPSSQ PCR 17 YARNASHLA PCR 22 RRSSNAVPLP ВСТРОЙКИ В ПЛАЗМИДУ F 2 LGRNFIAVT F 14 RHDIPGRTE F 28 VRNCSTLWG F 3 VLVHMNNNT F 15 EKEMQFLNG F 29 WPRLGLKLL F 4 INRTPLKTR F 16 NPSKIASS 1 QNPPPPTLT F 5 LLFSRSRRP F 18 SKPIGSTRQ 3 AQMSGRTAS F 6 QRSISPTRR F 19 THSHFTHPE 4 TGNFCLNLT F 8 PPRIHRAPR F 20 DHANKNRHG 6 LTNLSSGRP F 9 EYRAPLAPG F 22 SDKSSPQMP 7 EHDRNLKPP F 10 NTSARSRHP F 23 RFATRTISR 10 VTDGATWGS F 11 LIRTGARAT F 26 ADAIGVPLR 11 RSLPPTYHP F 12 PHSLDSFRL F 27 IQYPQSAAS 12 RTLCSPPAT F 13 FCGARRTSP ВСТРЕЧАЕМОСТЬ В ФАГЕ ВСТРЕЧАЕМОСТЬ В ФАГМИДЕ

ЗАВИСИМОСТЬ ОТ ДЛИНЫ ВСТРОЙКИ ЗАВИСИМОСТЬ ОТ ДЛИНЫ ВСТРОЙКИ

ПЕПТИДНАЯ БИБЛИОТЕКА ТИПА 8 МКА АНТИ- ИНТЕРЛЕЙКИН 1 N ND TA IP SND PF LP GПЕПТИДНАЯ БИБЛИОТЕКА ТИПА 8 МКА АНТИ- ИНТЕРЛЕЙКИН 1 N ND TA IP SND PF LP G ND NP FP R ND YS IP N ND TA IP N ND SV LP SND SP FP SND GA IP SND WT LP SND GA IP SND YG IP HR SND AV ЦИБАКРОН СИНИЙ G R W S K A E S R WT R D S RR Y QP D S RR A Y E P E RR F VSS E R P Y AP D A W R SQNQG Y N R Y R D V R Y R PP D V W K N R M D G Y RR GS T EМКА АНТИ-NGF (4 C 8) N TLQP IP N TLQ F IP M T PQP IP PTLQP VP PT N QP IP PTLQ V VP PTLQ A VP P S LQP IP P HP Q A VP PTLQP IP N TLQP VPМКА АНТИ-NGF ( -D 11) WGAS HD R YGAR HDV YGRS HDL RGSR H GP WRRP HDV LRAP HDV PTRF HDL LCPT HDV LRAP HDV

ЭВОЛЮЦИЯ ПЕПТИДНОЙ БИБЛИОТЕКИ  КОНСЕНСУСНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ   1 2 3 4 5 6 7 РАУНДЭВОЛЮЦИЯ ПЕПТИДНОЙ БИБЛИОТЕКИ КОНСЕНСУСНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ 1 2 3 4 5 6 7 РАУНД 0 Х Х Х Н ( 8. 4 ) Х 1 N (5. 4) Х X X A (4. 7) I (6. 7) P (13. 4) I (4. 0) L (4. 0) S (3. 1) M (4. 0) 2 N (8. 6) P (3. 4) G (3. 4) A (5. 2) F (13. 8) P (14. 6) P (3. 4) I (3. 4)

ДИСПЛЕЙ ПЕПТИДОВ ТИПА 8+8 фагмида + фаг-помощник ДИСПЛЕЙ ПЕПТИДОВ ТИПА 8+8 фагмида + фаг-помощник

РАЗРАБОТКА ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ HCV пептидные фаговые библиотеки б иопаннинг  с использованием сывороток пациентов фаговый пул,РАЗРАБОТКА ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ HCV пептидные фаговые библиотеки б иопаннинг с использованием сывороток пациентов фаговый пул, имеющий уменьшенную сложность скрининг реплик индивидуальных клонов с положительными и отрицательными сыворотками клоны, специфически реагирующие с положительными сыворотками клоны, взаимодействующие с антителами, очищенными при помощи уже известных пептидов пептиды HCV, соответствующие новым антигенным детерминантам мутанты с улучшенными связывающими свойствами

СЕЛЕКЦИЯ И ИММУНОСКРИНИНГ положительные клоны на чашке-матрице иммуноскрининг с использованием  смеси положительных сывороток иммуноскрининг сСЕЛЕКЦИЯ И ИММУНОСКРИНИНГ положительные клоны на чашке-матрице иммуноскрининг с использованием смеси положительных сывороток иммуноскрининг с индивидуальными сыворотка 1 сыворотка 2 сыворотка 3 сыворотка

ИДЕНТИФИКАЦИЯ НОВЫХ ЛИГАНДОВ ДЛЯ HCV-СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ очищенные клоны фагов антитела. PA 1 PA 3 PA 8ИДЕНТИФИКАЦИЯ НОВЫХ ЛИГАНДОВ ДЛЯ HCV-СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ очищенные клоны фагов антитела. PA 1 PA 3 PA 8 PA 12 PA 18 WT C 65/A 1 C 65/A 3 C 65/A 8 C 65/A 12 C 65/A 18 C 65 Значение O. D. 00. 30. 51. 01. 52.

АФФИННОЕ СОЗРЕВАНИЕ КЛОНА РА 12 PA 12  S  R  Q  L АФФИННОЕ СОЗРЕВАНИЕ КЛОНА РА 12 PA 12 S R Q L N K L F G I E Библиотека S* R* Q* L* N* K* L* F* G* I* E* N N

ФАГОВЫЕ ПЕПТИДЫ ФАГОВЫЕ ПЕПТИДЫ

ОТ ФАГОВЫХ ПЕПТИДОВ К СИНТЕТИЧЕСКИМ A E G E F ( пептид) D P K AAОТ ФАГОВЫХ ПЕПТИДОВ К СИНТЕТИЧЕСКИМ A E G E F ( пептид) D P K AA E G E F ( пептид) D P K A A E G E F ( пептид) D P K A K K K K G MAP – Multiple Antigenic Peptide

ОТ ФАГОВЫХ ПЕПТИДОВ К СИНТЕТИЧЕСКИМ ОТ ФАГОВЫХ ПЕПТИДОВ К СИНТЕТИЧЕСКИМ

КОММЕРЧЕСКИЕ ТЕСТ-СИТЕМЫ КОММЕРЧЕСКИЕ ТЕСТ-СИТЕМЫ

НЕОПРЕДЕЛЕННЫЕ СЫВОРОТКИ положит. отриц. неопределенные C 25 R 1 R 6 R 13 C 26 CНЕОПРЕДЕЛЕННЫЕ СЫВОРОТКИ положит. отриц. неопределенные C 25 R 1 R 6 R 13 C 26 C 42 C 46 C 53 C 55 C 77 C 88 R 1 R 5 R 8 R 10 R 12 R 14 S 8 S 20 S 42 S 127 S 172 E 6 E 12 E 23 E 39 D 37 D 38 D 42 D 53 D 61 D 115 D 116 A m 1909. 2 m 1913. 2 B m 1901. 31 m 1901. 34 m 3344. 3 m 3362. 3 C m 1977. 1 D m 3551. 3 E m 3566. 3 F m 858 m. F 78 m. H 1 G m. A 12. 1 m. A 12. 2 m. A 12. 13 H m. B 11. 17 I m. G 21. 2 J m 1929 A 3. 1 m 1929 C 3. 4 m 1929. 21 K m. S 48. 5 L m. N 15. 301. 52. 02. 53. 0 Значение O. D. 6 сывороток – 0 8 сывороток – 1 пептид 7 сывороток – 2 группы пептидов 10 сывороток – множественная реактивность

НЕОПРЕДЕЛЕННЫЕ СЫВОРОТКИ На найлоновой мембране иммобилизованы следующие пептиды, разделенные на 10 групп,  согласно их специфичности:НЕОПРЕДЕЛЕННЫЕ СЫВОРОТКИ На найлоновой мембране иммобилизованы следующие пептиды, разделенные на 10 групп, согласно их специфичности: (A): m 1909. 2 и m 1913. 2; (B): m 1901. 31, m 3323. 3 и m 3362. 3; (C): m 1977. 1; (D): m 3551. 3; (E): 3566. 3; (F): m 858, m. F 78 и m. H 1; (G): m. A 12. 1, m. A 12. 2 и m. A 12. 13; (H): m. B 11. 17; (I): m. G 21. 2; (J): m 1929 A 3. 1, m 1929 C 3. 4 и m 1929. 21. Дополнительная линия содержит очищенные человеческие иммуноглобулины в качестве внутреннего положительного контроля.

ДИСПЛЕЙ АНТИТЕЛ p. IIIsc. Fv нитчатый фаг ДИСПЛЕЙ АНТИТЕЛ p. IIIsc. Fv нитчатый фаг

VL CH 1 CL VH VL CH 1 CL CH 2 CH 3 CH 1 CHVL CH 1 CL VH VL CH 1 CL CH 2 CH 3 CH 1 CH 2 CH 3 VHVH VL CLFc MAB VLVH Fab sc. Fv. ДИСПЛЕЙ АНТИТЕЛ источник человеческих клеток м. РНК к. ДНК специфическая PCR для амплификации VH и VL клонирование в фаговом векторе электропорация компетентных клеток наработка фага с использованием фага помощника

ДИСПЛЕЙ РЕКОМБИНАНТНЫХ АНТИТЕЛ, БИБЛИОТЕКИ Качество библиотеки зависит от: a.  размера библиотеки b.  разнообразия c.ДИСПЛЕЙ РЕКОМБИНАНТНЫХ АНТИТЕЛ, БИБЛИОТЕКИ Качество библиотеки зависит от: a. размера библиотеки b. разнообразия c. источника генов Ig Источник генов Ig: лимфоциты периферической крови ( PBL ) селезенка костный мозг околоопухолевые лимфатические узлы( TDLN ) отдельные гены антител (синтетические библиотеки) лимфоциты инфильтрированные в опухоль ( TIL ) клональность < 1/20. 000 7% 18 -78% PBL TDLN TIL

ДИСПЛЕЙ РЕКОМБИНАНТНЫХ АНТИТЕЛ Pleader sc. Fv FLAG p. III amber P leader sc. Fv FLAG p.ДИСПЛЕЙ РЕКОМБИНАНТНЫХ АНТИТЕЛ Pleader sc. Fv FLAG p. III amber P leader sc. Fv FLAG p. III amber

ДИСПЛЕЙ РЕКОМБИНАНТНЫХ АНТИТЕЛ р. КМ 17 р. КМ 18 р. КМ 19 sc. Fv anti-CEA FLAGДИСПЛЕЙ РЕКОМБИНАНТНЫХ АНТИТЕЛ р. КМ 17 р. КМ 18 р. КМ 19 sc. Fv anti-CEA FLAG N-terminus C-terminus p. III

ДИСПЛЕЙ РЕКОМБИНАНТНЫХ АНТИТЕЛ ДИСПЛЕЙ РЕКОМБИНАНТНЫХ АНТИТЕЛ

ДИСПЛЕЙ РЕКОМБИНАНТНЫХ АНТИТЕЛ 1.  Production of human hybridomas, obtained from TIL, able to secrete tumor-specificДИСПЛЕЙ РЕКОМБИНАНТНЫХ АНТИТЕЛ 1. Production of human hybridomas, obtained from TIL, able to secrete tumor-specific antibodies [ Sikora K et al. , Lancet 1982; Sikora K et al. , Br. J. Cancer 1983 ]; 2. B cell expansion of TIL from human tumor biopsies [ Punt CJA et al. , Cancer Immunol. Immunother. 1994 ]; 3. B cell expansion of melanoma-derived TIL and following cloning the sc. Fv antibody from single B cell clone with specific melanoma reactivity [ Zang H et al. , Cancer Res. 1995 ]; 4. Subcutaneous transplantation of human lung cancer tissue in immunodeficient mice producing human antibodies derived from TIL-B, which recognized two tumor-specific proteins [ Imahayashi S et al. , Cancer Invest. 2000; Yasuda et al. , Cancer Res. 2002 ] Антитела, происходящие из TIL-B способны узнавать раковые клетки

ДИСПЛЕЙ РЕКОМБИНАНТНЫХ АНТИТЕЛ НС CDR 3 PCR амплификация района V(D)J ДИСПЛЕЙ РЕКОМБИНАНТНЫХ АНТИТЕЛ НС CDR 3 PCR амплификация района V(D)J

ДИСПЛЕЙ РЕКОМБИНАНТНЫХ АНТИТЕЛ HC CDR 3 специфицескиепраймеры для Ig. G 1, Ig. G 2, Ig. AДИСПЛЕЙ РЕКОМБИНАНТНЫХ АНТИТЕЛ HC CDR 3 специфицескиепраймеры для Ig. G 1, Ig. G 2, Ig.

Bклетки м. РНК к. ДНК гены Ig сборка sc. Fv, конструкция библиотекиопухоль Библиотека Источник генов иммуноглобулиновBклетки м. РНК к. ДНК гены Ig сборка sc. Fv, конструкция библиотекиопухоль Библиотека Источник генов иммуноглобулинов Пациент (возраст) Размер библиотеки sc. Fv. B 87 TIL B 87 (55) 4. 7 x 10 5 sc. Fv. B 95 TIL B 95 (73) 1. 1 x 10 7 sc. Fv. B 96 TIL B 96 (72) 2. 6 x 10 7 sc. Fvmix TIL B 85 (47), B 91 (70), B 92 (79), B 93 (66) 2. 4 x 10 7 sc. Fv. EC 23 PBL EC 23 (65) 1. 8 x 10 7 mix. TIL — Sc. Fv. B 87 + Sc. Fv. B 95 + Sc. Fv. B 96 + Sc. Fvmix mix. LIB TIL+PBL — Sc. Fv. B 87 + Sc. Fv. B 95 + Sc. Fvmix + Sc. Fv. EC 23 ДИСПЛЕЙ РЕКОМБИНАНТНЫХ АНТИТЕЛ

ДИСПЛЕЙ РЕКОМБИНАНТНЫХ АНТИТЕЛ СЕЛЕКЦИЯ НА ОПУХОЛЕВЫХ АНТИГЕНАХ ДИСПЛЕЙ РЕКОМБИНАНТНЫХ АНТИТЕЛ СЕЛЕКЦИЯ НА ОПУХОЛЕВЫХ АНТИГЕНАХ

ДИСПЛЕЙ РЕКОМБИНАНТНЫХ АНТИТЕЛ АНТИ- MUC 1 MB 5 АНТИ-СЕА СВ 37 ДИСПЛЕЙ РЕКОМБИНАНТНЫХ АНТИТЕЛ АНТИ- MUC 1 MB 5 АНТИ-СЕА СВ

ИНКУБАЦИЯ ОТМЫВКА ЭЛЮЦИЯ, АМПЛИФИКАЦИЯ ФАГАСелекция антител на клетках MCF 7 ИНКУБАЦИЯ ОТМЫВКА ЭЛЮЦИЯ, АМПЛИФИКАЦИЯ ФАГАСелекция антител на клетках M

Селекция антител на клетках MCF 7 Селекция антител на клетках M

Селекция антител на клетках MCF 7 Селекция антител на клетках M

b+ b - biotinylated annexin V - streptavidinated Dynabeads + bb b b b bb intactb+ b — biotinylated annexin V — streptavidinated Dynabeads + bb b b b bb intact cells. Оптимизированная селекция антител на живых клетках

Оптимизированная селекция антител на живых клетках A  клетки до очистки B  после очистки CОптимизированная селекция антител на живых клетках A клетки до очистки B после очистки C фракция клеток связанных с микросферами (увел. х10) D (увел. х20)

phage pools MCF 7  positive alive cells  positive dead cells IV old 0 35phage pools MCF 7 % positive alive cells % positive dead cells IV old 0 35 V B 96 0 34 V new 61 52 Оптимизированная селекция антител на живых клетках

MCF 7 MCF 10 -2 A MDA-MB-231 MDA-MB-468 M 13 IV mix. TIL old prot. VMCF 7 MCF 10 -2 A MDA-MB-231 MDA-MB-468 M 13 IV mix. TIL old prot. V sc. Fv. B 96 old prot. V mix. TIL 2 A 41 43 48 62 68 71 72 75 81 Оптимизированная селекция антител на живых клетках

ОСНОВНЫЕ ТИПЫ ДИСПЛЕЯ НА НИТЧАТОМ ФАГЕ дисплей основанный на p. III: 1. В фаге присутствует толькоОСНОВНЫЕ ТИПЫ ДИСПЛЕЯ НА НИТЧАТОМ ФАГЕ дисплей основанный на p. III: 1. В фаге присутствует только 5 копий белка p. III 2. p. III не чувствителен к длине встройки 3. p. III подходит для диспея пептидов и белков, включая Fab и sc. Fv дисплей основанный на p. VIII: 1. В фаге присутствует 2700 копий белка p. VIII 2. p. VIII чувствителен к длине встройки 3. p. VIII подходит для диспея пептидов

ДИСПЛЕЙ ОСНОВАННЫЙ НА ФАГЕ ЛАМБДА белок gp. D белок gp. V 1. gp. D – 420ДИСПЛЕЙ ОСНОВАННЫЙ НА ФАГЕ ЛАМБДА белок gp. D белок gp. V 1. gp. D – 420 копий 2. N- и C- концы белка gp. D используются для дисплея 3. gp. D не чувствителен к размеру встройки полипептида 4. 50 -90% общего белка gp. D приходятся на рекомбинантный gp. D в системе, основанной на двух генах 1. gp. V – около 200 копий 2. C- конец белка gp. V используются для дисплея

DIFFERENCE BETWEEN LAMBDA AND FILAMENTOUS PHAGES M 13 собирается на бактериальной мембране Ламбда является литическим фагомDIFFERENCE BETWEEN LAMBDA AND FILAMENTOUS PHAGES M 13 собирается на бактериальной мембране Ламбда является литическим фагом bacterial cell

СЕЛЕКЦИЯ ОПУХОЛЕВЫХ АНТИГЕНОВ КОМБИНАЦИЯ МЕТОД A  SEREX И ФАГОВОГО ДИСПЛЕЯ м. РНК Spe. I NNNNNNСЕЛЕКЦИЯ ОПУХОЛЕВЫХ АНТИГЕНОВ КОМБИНАЦИЯ МЕТОД A SEREX И ФАГОВОГО ДИСПЛЕЯ м. РНК Spe. I NNNNNN Spe. INNNNNNNNN Not. I 10 7 клеток MCF 7 или образец карциномы молочной железы синтез двухцепочечной к. ДНК, прайминг случайной последовательностью с введением сайта Not I денатурация цепей и вторичный прайминг с введением сайта Spe I фрагмент для ориентированного клонирования к. ДНК в лямбда векторе

Скринингбиблиотеки перенос бляшек на мембрану инкубирование фильтра ссывороткой БИБЛИОТЕКА окрашивание хроматогенным субстратом Скринингбиблиотеки перенос бляшек на мембрану инкубирование фильтра ссывороткой БИБЛИОТЕКА окрашивание хроматогенным субстратом

Идентификация опухолевых антигенов путем скрининга библиотек к. ДНК, экспонированных на поверхности фага лямбда, с помощью сыворотокИдентификация опухолевых антигенов путем скрининга библиотек к. ДНК, экспонированных на поверхности фага лямбда, с помощью сывороток пациентов gp. D TAmp R Col. E 1 lac. I q Ptrc gp. D imm 21 nin 5 c. DNA amb Xba I (Dam 15) 24508 A B gp. D c. DNA C -концевая сшивка gp. Dc. DNA N -концевая сшивка

СЕЛЕКЦИЯ ОПУХОЛЕВЫХ АНТИГЕНОВ Список библиотек к. ДНК, экспонированных на бактериофаге лямбда. Название библиотеки Место сшивки сСЕЛЕКЦИЯ ОПУХОЛЕВЫХ АНТИГЕНОВ Список библиотек к. ДНК, экспонированных на бактериофаге лямбда. Название библиотеки Место сшивки с gp. D Источник к. ДНК Размер библиотеки Т 5 N-конец MCF 7+MDA-MB-468 1. 7 х10 7 Т 6 С-конец MCF 7+MDA-MB-468 3. 4 х10 7 Т 7 N-конец опухоль молочной жел. , пациент В 81 1. 5 х10 6 Т 9 N-конец опухоль молочной жел, пациент В 84 2. 3 х10 7 Т 11 N-конец Тестикулы человека 1. 3 х

A B фаговый пул ELISA,  иммуноскрининг со смесью сывороток B 13 p 13 II BA B фаговый пул ELISA, иммуноскрининг со смесью сывороток B 13 p 13 II B 13: B 9 B 11 B 14 B 15 B 16 B 17 B 18 B 19 B 20 p 13 III…. ELISA с отдельными сыворотками 1 й раунд селекции фаговые пулы. Библиотека c. DNA на фаге B 9 B 11 B 13 B 20 p 20 I p 13 I p 11 I p 9 I …. B 9 B 11 B 13 B 20 2 ой раунд селекции фаговые пулыp 20 II p 13 II p 11 II p 9 II иммуноскрининг СЕЛЕКЦИЯ ОПУХОЛЕВЫХ АНТИГЕНОВ

СЕЛЕКЦИЯ ОПУХОЛЕВЫХ АНТИГЕНОВ/иммуноскрининг сыворотки здоровых доноров сыворотки пациентов СЕЛЕКЦИЯ ОПУХОЛЕВЫХ АНТИГЕНОВ/иммуноскрининг сыворотки здоровых доноров сыворотки пациентов

СЕЛЕКЦИЯ ОПУХОЛЕВЫХ АНТИГЕНОВ Название каждого клона включает название библиотеки (Т 1, Т 2 и т. д.СЕЛЕКЦИЯ ОПУХОЛЕВЫХ АНТИГЕНОВ Название каждого клона включает название библиотеки (Т 1, Т 2 и т. д. ) и порядковый номер клона.

АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ ОПУХОЛЕВЫХ АНТИГЕНОВ АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ ОПУХОЛЕВЫХ АНТИГЕНОВ

 ИССЛЕДОВАНИЕ ГУМОРАЛЬНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА У ПАЦИЕНТОВ С ОПУХОЛЯМИ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ИССЛЕДОВАНИЕ ГУМОРАЛЬНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА У ПАЦИЕНТОВ С ОПУХОЛЯМИ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

ИССЛЕДОВАНИЕ ГУМОРАЛЬНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА У ПАЦИЕНТОВ С ОПУХОЛЯМИ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ  Клон  GST сшивка ИССЛЕДОВАНИЕ ГУМОРАЛЬНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА У ПАЦИЕНТОВ С ОПУХОЛЯМИ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ Клон GST сшивка Контрольные сыворотки (положительные/об щее число) I-IV стадии (положительные /общее число) P Относи-те льный риск ДИ (Н пр -В пр ) T 1 -32 GST_T 1 -32 5/41 (12. 20%) 23/182 (12. 64%) 1 1. 04 0. 35 — 3. 74 T 5 -9 GST_T 5 -9 0/33 (0%) 6/182 (3. 30%) 0. 59 ∞ 0. 21 — ∞ T 5 -18 GST_T 5 -18 0/27 (0%) 13/182 (7. 14%) 0. 23 ∞ 0. 45 — ∞ T 6 -2 GST_T 6 -2 0/26 (0%) 25/182 (13. 74%) 0. 05 >4. 12 0. 96 — ∞ T 9 -21 GST_T 9 -22 1/29 (3. 45%) 19/182 (10. 44%) 0. 32 3. 25 0. 48 – 140. 32 gp. D сшивка T 1 -52 D 1 -52 5/74 (6. 76%) 8/182 (4. 4%) 0. 53 0. 64 0. 18 — 2. 56 T 1 -74 D 1 -74 6/47 (12. 77%) 28/182 (15. 38%) 0. 82 1. 24 0. 46 — 3. 92 T 4 -11 D 4 -11 0/60 (0%) 15/182 (8. 24%) 0. 03 >5. 36 1. 24 — ∞ T 4 -19 D 4 -19 5/115 (4. 35%) 34/186 (12. 28%) 4. 8 0/39 (0%) Т 11 -5 0/20 (0%) 7/172 ( 4. 07%) 1 ∞ 0/20 (0%)

Значимость встречаемости антител в зависимости от стадии болезни (Р). Антиген Стадии с I по IV Значимость встречаемости антител в зависимости от стадии болезни (Р). Антиген Стадии с I по IV P Стадии I, III vs. IV P Пять стадий P D 4 -19 0. 554 0. 835 0. 002 D 7 -1 0. 049 0. 042 0. 001 ИССЛЕДОВАНИЕ ГУМОРАЛЬНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА У ПАЦИЕНТОВ С ОПУХОЛЯМИ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

Дисплей sc. Fv антител  на фаге ламбда filamentous phage lambda phagep. IIIsc. Fv VHVL VHДисплей sc. Fv антител на фаге ламбда filamentous phage lambda phagep. IIIsc. Fv VHVL VH VL VH VL

Дисплей sc. Fv антител  на фаге ламбда Дисплей sc. Fv антител на фаге ламбда

Lambda phage clones Number of infective particles/plaque KM 8 wt 1. 7 x 10 6 +Lambda phage clones Number of infective particles/plaque KM 8 wt 1. 7 x 10 6 + 0. 65 x 10 6 -CEA-N- 2. 1 x 10 6 + 0. 82 x 10 6 KM 10 wt 3. 1 x 10 6 + 0. 79 x 10 6 -CEA-C- 1. 3 x 10 3 + 0. 86 x 10 3 -CEA-C- plaques in top-agar nitrocellulose filter developed with anti-FLAG secondary antibody immunoscreening. Дисплей sc. Fv антител на фаге ламбда

Дисплей sc. Fv антител  на фаге ламбда Дисплей sc. Fv антител на фаге ламбда

Дисплей sc. Fv антител  на фаге ламбда Дисплей sc. Fv антител на фаге ламбда

Lambda-GFP VHVL VH VLVHVL VH VL VH VL GFP AP + sc. Fv. Lambda-AP-sc. Fv VHLambda-GFP VHVL VH VLVHVL VH VL VH VL GFP AP + sc. Fv. Lambda-AP-sc. Fv VH VLVHVL GFP + sc. Fv. Двойной дисплей на фаге ламбда

VHVL VH VLVHVLVH VL VH VLДвойной дисплей на фаге ламбда VHVL VH VLVHVLVH VL VH VLДвойной дисплей на фаге ламбда

VHVL VH VLДвойной дисплей на фаге ламбда VHVL VH VLДвойной дисплей на фаге ламбда

in vitro VHVL VH VLVHVL Иммуннологическое окрашивание нефиксированных клеток Lo. Vo and HT 29 фагом GFP/in vitro VHVL VH VLVHVL Иммуннологическое окрашивание нефиксированных клеток Lo. Vo and HT 29 фагом GFP/ -CEA- . Двойной дисплей на фаге ламбда

in vivo Кинетика распределения фага ламбда в мышах nude  после введения в вену, внутрибрюшинно иin vivo Кинетика распределения фага ламбда в мышах nude после введения в вену, внутрибрюшинно и орально phage titer/g tissue (log 10) after per os administration 30 min 2 h 24 h 48 h blood 0. 00 brain 0. 00 liver 0. 00 kindey 0. 00 spleen 0. 00 intestine n. d. 7. 4 0. 00 n. d.

in vivo VHVL VH VLVHVL VH VL VH VLТаргетинг опухоли фагами введенными внутривенно Lo. Vo. HTin vivo VHVL VH VLVHVL VH VL VH VLТаргетинг опухоли фагами введенными внутривенно Lo. Vo. HT

Спасибо за внимание Спасибо за внимание

безконкурентный ингибитор сывороткапептидинги-GST-HCVGST-HCVGST-HCVGST битора(1 -127)(1186 -1647)(1694 -1904)(1679 -1711)(1904 -1959) C 12 m. A 12. 1 Cбезконкурентный ингибитор сывороткапептидинги-GST-HCVGST-HCVGST-HCVGST битора(1 -127)(1186 -1647)(1694 -1904)(1679 -1711)(1904 -1959) C 12 m. A 12. 1 C 83 m. A 12. 2 C 74 m. A 12. 13 C 74 m 1929. A 3. 1 0 0. 30. 51. 01. 52. 0 Значение O. D. КАРТИРОВАНИЕ ВИРУСНЫХ ЭПИТОПОВ