Микроскопы
Микроскоп - это оптический прибор, позволяющий получить обратное изображение изучаемого объекта и рассмотреть мелкие детали его строения, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности глаза
История микроскопа
Невозможно точно определить, кто изобрёл микроскоп. Считается, что голландский мастер очков Ханс Янсен и его сын Захарий Янсен изобрели первый микроскоп в 1590, но это было заявление самого Захария Янсена в середине XVII века. Другим претендентом на звание изобретателя микроскопа был Галилео Галилей. Он разработал «occhiolino» ( «оккиолино» ), или составной микроскоп с выпуклой и вогнутой линзами в 1609 г. Галилей представил свой микроскоп публике в Академии деи Линчеи, основанной Федерико Чези в 1603 г. Десятью годами позже Галилея Корнелиус Дреббель изобретает новый тип микроскопа, с двумя выпуклыми линзами. Кристиан Гюйгенс, другой голландец, изобрел простую двулинзовую систему окуляров в конце 1600 -х, которая ахроматически регулировалась и, следовательно, стала огромным шагом вперед в истории развития микроскопов. В 1665 году англичанин Роберт Гук сконструировал собственный микроскоп и опробовал его на пробке. В результате этого исследования появилось название «клетки» .
• Антон Ван Левенгук (1632— 1723) считается первым, кто сумел привлечь к микроскопу внимание биологов, несмотря на то, что простые увеличительные линзы уже производились с 1500 -х годов, а увеличительные свойства наполненных водой стеклянных сосудов упоминались ещё древними римлянами (Сенека). Изготовленные вручную, микроскопы Ван Левенгука представляли собой очень небольшие изделия с одной очень сильной линзой. Они были неудобны в использовании, однако позволяли очень детально рассматривать изображения лишь из-за того, что не перенимали недостатков составного микроскопа (несколько линз такого микроскопа удваивали дефекты изображения). Понадобилось около 150 лет развития оптики, чтобы составной микроскоп смог давать такое же качество изображения, как простые микроскопы Левенгука. Так что, хотя Антон Ван Левенгук был великим мастером микроскопа, он не был его изобретателем вопреки широко распространённому мнению.
Разрешающая способность микроскопа дает раздельное изображение двух близких другу линий. Невооруженный человеческий глаз имеет разрешающую способность около 1/10 мм или 100 мкм. Лучший световой микроскоп примерно в 500 раз улучшает возможность человеческого глаза, т. е. его разрешающая способность составляет около 0, 2 мкм или 200 нм.
Разрешающая способность и увеличение не одно и тоже. Если с помощью светового микроскопа получить фотографии двух линий, расположенных на расстоянии менее 0, 2 мкм, то, как бы не увеличивать изображение, линии будут сливаться в одну. Можно получить большое увеличение, но не улучшить его разрешение. Различают полезное и бесполезное увеличения. Под полезным понимают такое увеличение наблюдаемого объекта, при котором можно выявить новые детали его строения. Бесполезное - это увеличение, при котором, увеличивая объект в сотни и более раз, нельзя обнаружить новых деталей строения.
1. Осветительная часть Предназначена для создания светового потока, который позволяет осветить объект таким образом, чтобы последующие части микроскопа предельно точно выполняли свои функции. Осветительная часть микроскопа проходящего света расположена за объектом под объективом в прямых микроскопах (например, биологические, поляризационные и др. ) и перед объектом над объективом в инвертированных. Осветительная часть конструкции микроскопа включает источник света (лампа и электрический блок питания) и оптико-механическую систему (коллектор, конденсор, полевая и апертурная регулируемые/ирисовые диафрагмы).
2. Воспроизводящая часть Предназначена для воспроизведения объекта в плоскости изображения с требуемым для исследования качеством изображения и увеличения (т. е. для построения такого изображения, которое как можно точнее и во всех деталях воспроизводило бы объект с соответствующим оптике микроскопа разрешением, увеличением, контрастом и цветопередачей). Воспроизводящая часть обеспечивает первую ступень увеличения и расположена после объекта до плоскости изображения микроскопа. Воспроизводящая часть включает объектив и промежуточную оптическую систему.
3. Визуализирующая часть Предназначена для получения реального изображения объекта на сетчатке глаза, фотоплёнке или пластинке, на экране монитора Визуализирующая часть расположена между плоскостью изображения объектива и глазами наблюдателя. Визуализирующая часть включает монокулярную, бинокулярную или тринокулярную визуальную насадку с наблюдательной системной (окулярами, которые работают как лупа). Кроме того, к этой части относятся системы дополнительного увеличения; проекционные насадки, ; рисовальные аппараты; системы анализа и документирования изображения с соответствующими адаптерами для цифровых камер.
В микроскопе выделяют две системы: оптическую и механическую. К оптической системе относят объективы, окуляры и осветительное устройство (конденсор с диафрагмой и светофильтром, зеркало или электроосветитель).
• Основная часть микроскопа - оптическая головка. В нижнюю часть ее вмонтирован объектив, состоящий из системы линз, которые можно переключать при помощи рукоятки и этим менять увеличение. Увеличения объектива обозначены цифрами на рукоятке - х0, 6, х1, х2, х4, х7. На корпусе головки имеется точка. Для установки нужного увеличения объектива надо цифру на рукоятке совместить с точкой на корпусе головки. • На верхнюю часть головки установлена бинокулярная насадка. Окуляры имеют увеличения х6, х8, х12, 5. Для установки удобного для глаз расстояния между окулярами надо раздвинуть или сдвинуть тубусы. • К задней стенке корпуса головки прикреплен кронштейн с реечным механизмом передвижения. Подъем и опускание корпуса головки осуществляется вращением винта. Кронштейн надет на стойку, прикрепленную к подставке. • Для работы в проходящем свете, в корпус подставки вмонтирован отражатель света, с зеркальной и матовой поверхностями. С передней стороны корпуса имеется окно для доступа дневного света. Для искусственного освещения предназначена лампа, которую вставляют или в отверстие с задней стороны корпуса (для проходящего света), или в кронштейн, укрепленный на объективе (для отраженного света). • Столик установлен в круглом окне на верхней поверхности корпуса подставки. Он может быть либо стеклянным (при проходящем свете), либо металлическим, с белой и черной поверхностями (при отраженном свете).
Объектив - одна из важнейших частей микроскопа, поскольку он определяет полезное увеличение объекта. Объектив состоит из металлического цилиндра с вмонтированными в него линзами, число которых может быть различным. Увеличение объектива обозначено на нем цифрами. В учебных целях используют обычно объективы х8 и х40. Качество объектива определяет его разрешающая способность. Окуляр устроен намного проще объектива. Он состоит из 2 -3 линз, вмонтированных в металлический цилиндр. Между линзами расположена постоянная диафрагма, определяющая границы поля зрения. Нижняя линза фокусирует изображение объекта, построенное объективом в плоскости диафрагмы, а верхняя служит непосредственно для наблюдения. Увеличение окуляров обозначено на них цифрами: х7, х10, х15. Окуляры не выявляют новых деталей строения, и в этом отношении их увеличение бесполезно. Таким образом, окуляр, подобно лупе, дает прямое, мнимое, увеличенное изображение наблюдаемого объекта, построенное объективом Для определения общего увеличения микроскопа следует умножить увеличение объектива на увеличение окуляра.
Основные параметры любого микроскопа • Разрешающая способность - это способность микроскопа разделять изображения двух близких друг к другу точек. Другими слова, данная характеристика отвечает за четкость деталей изображения. • Высчитывается разрешающая способность микроскопа по формуле: D = λ / 2 NA, • где λ- длина световой волны, • NA - числовая апертура. Например, максимальная разрешающая способность светового оптического микроскопа равна 0, 2 мкм
Классификация объективов значительно сложнее классификации микроскопов. Объективы разделяются по принципу расчетного качества изображения, параметрическим и конструктивно-технологическим признакам, а также по методам исследования и контрастирования. По принципу расчетного качества изображения объективы могут быть: ахроматическими; апохроматическими; объективами плоского поля (план).
Ахроматические объективы. • Ахроматические объективы рассчитаны для применения в спектральном диапазоне 486– 656 нм. Исправление любой аберрации (ахроматизация) выполнено для двух длин волн. • В этих объективах устранены сферическая аберрация, хроматическая аберрация положения, кома, астигматизм и частично — сферохроматическая аберрация. Изображение объекта имеет несколько синевато-красноватый оттенок.
Апохроматические объективы. • Апохроматические объективы имеют расширенную спектральную область, и ахроматизация выполняется для трех длин волн. • При этом, кроме хроматизма положения, сферической аберрации, комы и астигматизма, достаточно хорошо исправляются также вторичный спектр и сферохроматическая аберрация, благодаря введению в схему линз из кристаллов и специальных стекол. • По сравнению с ахроматами, эти объективы обычно имеют повышенные числовые апертуры, дают четкое изображение и точно передают цвет объекта.
По обеспечению методов исследования и контрастирования объективы можно разделить следующим образом: - объективы, работающие с покровным и без покровного стекла; - объективы проходящего и отраженного света (безрефлексные); - люминесцентные объективы (с минимумом собственной люминесценции); - поляризационные объективы (без натяжения стекла в оптических элементах, т. е. не вносящие собственную деполяризацию); - фазовые объективы (имеющие фазовый элемент — полупрозрачное кольцо внутри объектива); - иммерсионные и безыммерсионные объективы.
Классификация объективов по увеличению • • Объективы малых увеличений (до 10 х). Объективы средних увеличений (до 50 х). Объективы больших увеличений (50 -100 х) Объективы сверхбольших увеличений (более 100 х).
Классификация объективов по числовой апертуре: • Объективы малых числовых апертур (до 0, 25). • Объективы средних числовых апертур (до 0, 65). • Объективы больших числовых апертур (более 0, 65).
Апертура объектива диаметр светового пучка на входе в объектив и целиком проходящего через его апертурную диафрагму
Классификация объективов по полю наблюдения: • Объективы для наблюдения в пределах нормального поля (до 18 мм). • Широкопольные объективы (до 22, 5 мм). • Сверхширокопольные объективы (более 22, 5).
Маркировка объектива для микроскопа • увеличение • числовая апертура • буквенная маркировка
Буквенная маркировка указывает на метод исследования объектива: • Ф или Ph (фазовый, то есть с фазовым элементом внутри, которое представляет собой полупрозрачное кольцо). • П или Pol (поляризационный объектив), • Л или L (люминесцентный объектив), • ФЛ или Ph. L (фазово-люминесцентный объектив).
в буквенной маркировке может указываться тип оптической коррекции АПО или APO (апохроматический), ПЛАН или PL (планарный), ПЛАН-АПО (планапохромат), СФ или М-ФЛЮАР (полуапохромат). S (фирма Opti. Tech, ахромат с пружинным механизмом) • Semi. Plan • SP объективы - что-то среднее межу ахроматами и планахроматами • • •
Например, что означает маркировка 40 х/0, 65 Ф? • Первое числовое значение указывает на увеличение в 40 х, • второе на значение числовой апертуры - 0, 65.
Иммерсия (от лат. immersio — погружение) — жидкость, заполняющая пространство между объектом наблюдения и специальным иммерсионным объективом (конденсором и предметным стеклом). В основном применяются три типа иммерсионных жидкостей: масляная иммерсия (МИ/Oil), водная иммерсия (ВИ/W) и глицериновая иммерсия (ГИ/Glyc) Иммерсия применяется в тех случаях, когда требуется повысить разрешающую способность микроскопа или её применения требует технологический процесс микроскопирования. При этом происходит: повышение видимости за счет увеличения разности показателя преломления среды и объекта; увеличение глубины просматриваемого слоя, который зависит от показателя преломления среды.
Классификация объективов по типу иммерсии: • сухие (безыммерсионные) • водная иммерсия • масляная иммерсия
Иммерсионная жидкость • это жидкость, которая находится между покровным стеклом и объективом и благодаря которой повышается разрешение объектива (используются в объективах с большими увеличениями).
Ход лучей в микроскопе • Иммерсионные объективы, между фронтальной линзой которых и препаратом помещается жидкая среда с показателем преломления, близким к показателю преломления стекла. • При этом между фронтальной линзой объектива и препаратом устанавливается однородная (гомогенная) среда (стекло препарата – масло – стекло объектива) с одинаковым показателем преломления. • Благодаря этому все лучи, не преломляясь и не изменяя направления, попадают в объектив, создавая условия наилучшего освещения препарата. Величина (n) показателя преломления равна: • для воды 1, 33, • для кедрового масла 1, 515, • для монобромнафталина 1, 6.
Ход лучей в микроскопе • Сухим называется такой объектив, между фронтальной линзой которого и рассматриваемым препаратом находится воздух. • При этом ввиду разницы показателя преломления стекла (1, 52) и воздуха (1, 0) часть световых лучей отклоняется и не попадает в глаз наблюдателя. • Объективы сухой системы имеют обычно большое фокусное расстояние и дают малое (10×) или среднее (40×) увеличение.
Окуляры классифицируются по тем же группам признаков, что и объективы: -окуляры компенсационного (К — компенсируют хроматическую разность увеличения объективов свыше 0, 8%) и безкомпенсационного действия; -окуляры обычные и плоского поля; -окуляры широкоугольные , сверхширокоугольные -окуляры с вынесенным зрачком для работы в очках и без; -окуляры для наблюдения, проекционные, фотоокуляры с внутренней наводкой (с помощью подвижного элемента внутри окуляра происходит настройка на резкое изображение сетки
Осветительное устройство состоит из зеркала или электроосветителя, конденсора с ирисовой диафрагмой и светофильтром, расположенных под предметным столиком. Они предназначены для освещения объекта пучком света. Зеркало служит для направления света через конденсор и отверстие предметного столика на объект. Оно имеет две поверхности: плоскую и вогнутую. В лабораториях с рассеянным светом используют вогнутое зеркало. Электроосветитель устанавливается под конденсором в гнездо подставки. Конденсор состоит из 2 -3 линз, вставленных в металлический цилиндр. При подъеме или опускании его с помощью специального винта соответственно конденсируется или рассеивается свет, падающий от зеркала на объект. Ирисовая диафрагма расположена между зеркалом и конденсором. Она служит для изменения диаметра светового потока, направляемого зеркалом через конденсор на объект, в соответствии с диаметром фронтальной линзы объектива и состоит из тонких металлических пластинок. С помощью рычажка их можно то соединить, полностью закрывая нижнюю линзу конденсора, то развести, увеличивая поток света. Кольцо с матовым стеклом или светофильтром уменьшает освещенность объекта. Оно расположено под диафрагмой и передвигается в горизонтальной плоскости. Механическая система микроскопа состоит из подставки, коробки с микрометренным механизмом и микрометренным винтом, тубуса, тубусодержателя, винта грубой наводки, кронштейна конденсора, винта перемещения конденсора, револьвера, предметного столика. Подставка - это основание микроскопа.
Коробка с микрометренным механизмом, построенном на принципе взаимодействующих шестерен, прикреплена к подставке неподвижно. Микрометренный винт служит для незначительного перемещения тубусодержателя, а, следовательно, и объектива на расстояния, измеряемые микрометрами. Полный оборот микрометренного винта передвигает тубусодержатель на 100 мкм, а поворот на одно деление опускает или поднимает тубусодержатель на 2 мкм. Во избежание порчи микрометренного механизма разрешается крутить микрометренный винт в одну сторону не более чем на половину оборота. Тубус или трубка - цилиндр, в который сверху вставляют окуляры. Тубус подвижно соединен с головкой тубусодержателя, его фиксируют стопорным винтом в определенном положении. Ослабив стопорный винт, тубус можно снять. Револьвер предназначен для быстрой смены объективов, которые ввинчиваются в его гнезда. Центрированное положение объектива обеспечивает защелка, расположенная внутри револьвера. Тубусодержатель несет тубус и револьвер. Винт грубой наводки используют для значительного перемещения тубусодержателя, а, следовательно, и объектива с целью фокусировки объекта при малом увеличении. Предметный столик предназначен для расположения на нем препарата. В середине столика имеется круглое отверстие, в которое входит фронтальная линза конденсора. На столике имеются две пружинистые клеммы - зажимы, закрепляющие препарат. Кронштейн конденсора подвижно присоединен к коробке микрометренного механизма. Его можно поднять или опустить при помощи винта, вращающего зубчатое колесо, входящее в пазы рейки с гребенчатой нарезкой
Правила работы с микроскопом При работе с микроскопом необходимо соблюдать операции в следующем порядке: 1. Работать с микроскопом следует сидя; 2. Микроскоп осмотреть, вытереть от пыли мягкой салфеткой объективы, окуляр, зеркало или электроосветитель; 3. Микроскоп установить перед собой, немного слева на 2 -3 см от края стола. Во время работы его не сдвигать; 4. Открыть полностью диафрагму, поднять конденсор в крайнее верхнее положение; 5. Работу с микроскопом всегда начинать с малого увеличения; 6. Опустить объектив 8 - в рабочее положение, т. е. на расстояние 1 см от предметного стекла; 7. Установить освещение в поле зрения микроскопа, используя электроосветитель или зеркало. Глядя одним глазом в окуляр и пользуясь зеркалом с вогнутой стороной, направить свет от окна в объектив, а затем максимально и равномерно осветить поле зрения. Если микроскоп снабжен осветителем, то подсоединить микроскоп к источнику питания, включить лампу и установить необходимую яркость горения;
Правила работы с микроскопом 8. Положить микропрепарат на предметный столик так, чтобы изучаемый объект находился под объективом. Глядя сбоку, опускать объектив при помощи макровинта до тех пор, пока расстояние между нижней линзой объектива и микропрепаратом не станет 4 -5 мм; 9. Смотреть одним глазом в окуляр и вращать винт грубой наводки на себя, плавно поднимая объектив до положения, при котором хорошо будет видно изображение объекта. Нельзя смотреть в окуляр и опускать объектив. Фронтальная линза может раздавить покровное стекло, и на ней появятся царапины; 10. Передвигая препарат рукой, найти нужное место, расположить его в центре поля зрения микроскопа; 11. Если изображение не появилось, то надо повторить все операции пунктов 6, 7, 8, 9; 12. Для изучения объекта при большом увеличении, сначала нужно поставить выбранный участок в центр поля зрения микроскопа при малом увеличении. Затем поменять объектив на 40 х, поворачивая револьвер, так чтобы он занял рабочее положение. При помощи микрометренного винта добиться хорошего изображения объекта. На коробке микрометренного механизма имеются две риски, а на микрометренном винте - точка, которая должна все время находиться между рисками. Если она выходит за их пределы, ее необходимо возвратить в нормальное положение. При несоблюдении этого правила, микрометренный винт может перестать действовать; 13. По окончании работы с большим увеличением, установить малое увеличение, поднять объектив, снять с рабочего столика препарат, протереть чистой салфеткой все части микроскопа, накрыть его полиэтиленовым пакетом и поставить в шкаф.
Классификация микроскопов в зависимости от величины разрешения микрочастиц • • оптические (световые) электронные рентгеновские сканирующие зондовые микроскопы
Оптические микроскопы. • состоит из механической, оптической и осветительной частей. С помощью такого микроскопа можно различать микрочастицы до 0, 20 мкм, а максимальное увеличение микроскопа составляет 2000 крат. Оптические микроскопы подразделяются на подвиды в зависимости от назначения.
Электронные микроскопы • Позволяют добиться гораздо большего увеличения, чем оптические. Все дело в использовании пучка электронов вместо светового потока, благодаря чему электронный микроскоп обеспечивает увеличение до 200 000 раз. Что касается разрешающей способности, то она в 1000 раз превосходит разрешающую способность оптического светового микроскопа.
Рентгеновские микроскопы. • Действие таких микроскопов основано на использовании электромагнитного излучения с длиной волны от 0, 01 до 1 нм, что позволяет исследовать с их помощью очень малые объекты. Исходя из разрешающей способности рентгеновские микроскопы по их мощности можно позиционировать как нечто среднее межу оптическими и электронными микроскопами (разрешающая способность около 220 нм).
Сканирующие зондовые микроскопы. • для построения изображения используется специальный зонд для сканирования поверхности. • получают трехмерное изображение с очень высоким разрешением (вплоть до атомарного). • разрешение менее 0, 1 нм и позволяют видеть молекулы и атомы, а также воздействовать на них (при этом объекты могут изучаться не только в вакууме, но и в газах и жидкостях)
Методы контрастирования в световой микроскопии • • • Метод светлого поля Метод темного поля Метод фазового контраста
Метод светлого поля • светлое поле в проходящем и отраженном свете. • используется для изучения прозрачных объектов (просвечивая их, для этого источник света находится снизу). • качестве микропрепарата могут выступать очень тонкие срезы растительных тканей. • для изучения непрозрачных объектов применяется метод светлого поля в отраженном свете. Здесь осветитель располагается сверху, над изучаемым объектом. • Благодаря различиям в отражающей способности элементов препарата с помощью такого метода можно изучать структуру объекта, отмечать его неоднородности. • В качестве объекта может выступать тонкая пластинка (шлиф) металлов. • метод косого освещения, когда свет направлен под углом (осветитель находится снизу). Благодаря такому методу можно тщательно изучить рельеф объекта по образованным теням.
Метод темного поля • освещение объекта полым конусом света • Свет в таком случае направляется на объект специальным конденсором темного поля • лучи света проходят через препарат и образуют пучок в виде полого конуса, при этом лучи не попадают в объектив (так как объектив находится внутри этого конуса) • Данный метод контрастирования применяется при изучении прозрачных объектов, которые применении метода светлого поля не видны. • Такой метод подойдет для изучения живых неокрашенных биологических образцов, например, простейших или отдельных живых клеток.
Ход лучей в темнопольном конденсоре • Кардиоид-конденсор • Параболоид-конденсор
Метод фазового контраста • используется для изучения прозрачных и бесцветных образцов, которые не могут быть рассмотрены методом светлого поля, неокрашенные животные ткани. • Метод основан на различиях показателях преломления элементов образца, при этом глазом воспринимаются изменения яркости (так называемый "фазовый рельеф"). • Для получения фазово-контрастного изображения используются объективы со специальными фазовыми пластинками, конденсоры с поворачивающимся диском. • В результате использования данного метода получают либо позитивный фазовый контраст (изображение темных организмов на светлом фоне) или негативный фазовый контраст (изображение светлых организмов на темном фоне). • применении метода темного поля выявляются только лишь контуры объекта, то метод фазового контраста дает возможность рассмотреть элементы внутренней структуры.
Световая микроскопия, окраска 1% раствором метиленового синего. Фазово-контрастная микроскопия Bacillus Cereus на плотной питательной среде (в камере М. А. Пешкова) Использование техники микроскопии в темном поле. В центре изображена бледная трепонема
Инвертированная микроскопия • Микроскопы инвертированные - это оптические микроскопы, отличающиеся тем, что объектив в них располагается под наблюдаемым предметом, а конденсор - сверху. Направление хода лучей, прошедших сверху вниз через объектив, изменяется системой зеркал, и в глаз наблюдателя они попадают, как обычно, снизу вверх. • Микроскопы этого типа предназначены для исследования громоздких объектов. В биологии и медицине с помощью таких микроскопов изучают находящиеся в питательной среде культуры тканей.
Инвертированная микроскопия • Таким образом, микроскопы инвертированные бывают лабораторные и исследовательские. • Пoзвoляют иcпoльзoвaть cлeдующиe мeтoды: свeтлoe пoлe; фaзoвый кoнтpacт; Хoффмaнa мoдуляциoнный кoнтpacт; флуopecцeнция (люминecцeнция), метод Номарски Дифференциального Интерференционного Контраста. • Мoтopизoвaнные вapиaнты идeaльнo пoдxoдит для кoнфoкaльнoй микpocкoпии, paбoты в зaкpытыx бoкcax и aвтoмaтичecкoгo иccлeдoвaния oбpaзцoв. • Для задач документирования изображений, инвертированные микроскопы оснащают фото/видеовыходом. Инвepтиpoвaнныe микpocкoпы идeaльны для caмoгo шиpoкoгo pядa иccлeдoвaний в физиoлoгии, пpи paбoтe c ткaнями, клeтoчными культуpaми, в ЭKO (IСSI) а также для материаловедения и металлографии.
Инвертированная микроскопия • Инвертированные М. отличаются тем, что объектив в них располагается под наблюдаемым предметом, а конденсор — сверху. Направление хода лучей, прошедших сверху вниз через объектив, изменяется системой зеркал, и в глаз наблюдателя они попадают, как обычно, снизу вверх
Принципиальная оптическая схема инвертированного микроскопа
Поляризационный микроскоп • В основе принципа действия поляризационных микроскопов лежит получение изображения исследуемого объекта при его облучении поляризованными лучами, которые в свою очередь должны быть получены из обычного света с помощью специального прибора — поляризатора. • В сущности прохождении поляризованного света через вещество либо отраженное от него меняет плоскость поляризации света в результате чего на втором поляризационном фильтре выявляется в виде излишнего затемнения. • Либо дают специфичные реакции как двойное лучепреломление в жирах
Поляризационный микроскоп • Поляризационные микроскопы оснащаются поляфильтрами — поляризатором и анализатором, через которые пропускают отраженный или проходящий свет. При этом качество изображений зависит от точности оптической системы устройства.
Поляризационный микроскоп • • Фильтры поляризационного микроскопа линейно-поляризованы и могут вращаться относительно друга. В случае, когда изотропный материал (воздух, вода, стекло) попадает между фильтрами, поток света гасится. Однако, анизотропные прозрачные материалы и минералы изменяют поляризацию проходящего света, что позволяет части света проходить через анализатор к наблюдателю. Используя один поляризатор, можно увидеть понижении яркости поляризованного света, в то время как использование двух позволяет проводить анализ при скрещенном положении фильтров поляризованного света. Чтобы наблюдать вид изменений, специальные петрографические микроскопы обычно включают дополнительный оптический элемент - линзу Бертрана, которая сосредотачивает и увеличивает фигуру. Также возможно удалить линзу окуляра, чтобы сделать возможным прямое наблюдение объективной поверхности линзы. В дополнение к модификациям оптической системы микроскопа поляризационные микроскопы позволяют вводить в путь лучей специально ориентируемые фильтры из двупреломляющих минералов (Кварцевый клин, пластину слюды в полволны или пластину слюды в четвертьволны). Это даёт возможность в оптической технологии при поляризации идентифицировать положительное и отрицательное двупреломление, и позволяет быстро выполнить исследование структуры минералов.
Электронный микроскоп • вместо потока световых лучей, которые несут информацию об объекте и которые мы можем просто увидеть, приблизив наши глаза к окулярам, в электронном микроскопе используется поток электронов – точно такой же, как и в обычном телевизоре • Изображение, наблюдаем на экране, покрытом специальным составом, светящимся при попадании на него потока электронов • магнитное и электрическое поля изменяют движение потока электронов, что делает возможным фокусировку электронных «лучей» с теми же самыми эффектами, что и в привычной «стеклянной» световой оптической системе
Электронный микроскоп • Т. к. предельно малые размеров электронов и значительное «преломления» электронных потоков - увеличение изображения достигается в тысячу раз большее, чем у оптического микроскопа • изображение либо проецируется на очень маленький люминесцентный экран, с которого наблюдатель рассматривает его в привычный оптический микроскоп с небольшим увеличением, либо с помощью оптикоэлектронного преобразователя выводится на обычный телевизионный экран, либо – что чаще всего и применяется на практике – фиксируется на фотопластинку
Электронный микроскоп • Для электронного микроскопа не существует такого параметра, как точность цветопередачи, ведь цвет – это свойства световых лучей, а не электронов. • В микромире нет цвета, потому «цветные» снимки, полученные с помощью электронного Стволовые клетки, электронная микроскопия, микроскопа – не более чем фото - stem-cells. ru условность
Конструкция электронного микроскопа • Электронная пушка. Источник потока электронных лучей, по конструкции практически совпадающий с такой же «пушкой» обыкновенного телевизора. Нагретый до высокой температуры катод производит эмиссию (испускание электронов), которые затем разгоняются с помощью анода, находящегося под высоким (сотни тысяч вольт) электрическим напряжением. • Конденсорная линза. Собственно, в электронном микроскопе линзы внешне мало похожи на оптические – это на самом-то деле системы, состоящие из электрических катушек, по которым пропущен ток. Ток этот создает электромагнитное поле, отклоняющее электронные потоки в нужном направлении. Конденсорная линза позволяет направить как можно более плотный поток электронов на исследуемый образец. • Конденсорная диафрагма. Подобно диафрагме оптического микроскопа, непрозрачная преграда с регулируемой величиной пропускающего отверстия
Конструкция электронного микроскопа • Конденсорная диафрагма. Подобно диафрагме оптического микроскопа, непрозрачная преграда с регулируемой величиной пропускающего отверстия • Исследуемый образец, сквозь который проходят электронные лучи. • Линза объектива. Еще одна конструкция электрических катушек, создающих электромагнитное поле такой конфигурации, чтобы его отклоняющее действие обеспечивало фокусировку электронных лучей, подобно тому, как линза стеклянная фокусирует лучи световые.
Конструкция электронного микроскопа • Диафрагма объектива. Диафрагма пропускает только сфокусированные лучи, отсекая рассеянные, что позволяет улучшить разборчивость изображения. • Флуоресцентный экран. Покрытый люминофором стеклянный экран, подобный экрану телевизора или электронно-лучевого монитора, но состоящий не из привычных крупных «пикселей» , а из микроскопических частиц люминофора, которые светятся под воздействием электронных потоков. Чем менее вещество исследуемого образца задерживает электроны, тем более светлым оно выглядит на экране, и наоборот. Изображение на флуоресцентном экране необходимо рассматривать либо в обычный оптический микроскоп, либо с помощью цифровой телекамеры передавать его для обработки в компьютер.
Цифровой микроскоп • точная передача формы, границы и цвета объекта, • возможность выполнения разнообразных тонких работ, • сохранение результатов исследования (как промежуточных, так и конечных), • возможность производить наблюдения с экрана монитора, • возможность передачи результатов на расстояния, • возможность редактирования изображения, а также применения компьютерных методов анализа результата
Цифровой микроскоп Для того чтобы передать изображение с микроскопа в компьютер, могут использоваться следующие приборы: • Цифровые камеры • Цифровые фотокамеры • Аналоговые системы ввода
Требования к цифровым камерам • Качество изображения, передаваемого аналоговой камерой, сильно зависит от используемой платы ввода, - фрейм-граббера – который может различаться типом телевизионного сигнала, точностью, разрешением, пропускной способностью, встроенными средствами обработки изображений (цена здесь варьируется от 30 до 3000 долларов). • Но фрейм-граббер способен дать изображение на экране компьютера не более чем из 400 тысяч пикселей. • В то же время цифровые камеры и фотоаппараты способны передать изображение из 16 млн. пикселей. • В свою очередь, цифровые фотоаппараты отличаются от цифровых камер скоростью ввода (у камер она гораздо больше)
Биологический микроскоп • Термин «биологический микроскоп» в русском языке обычно применяется для обозначения самых распространенных оптических микроскопов проходящего света плоского поля, то есть таких, в которых плоский полупрозрачный образец рассматривается на просвет
Металлографические микроскопы • – это оптические приборы, предназначенные для наблюдения непрозрачных и полупрозрачных объектов. Современные металлографические микроскопы дают возможность использовать различные методы исследования: наблюдение и измерение интересующих объектов как в отраженном, так и в проходящем свете, в светлом поле и поляризованном свете. • Приборы достаточно универсальны и обладают целым спектром возможностей, благодаря чему имеют широкую сферу применения: они используются в металлургии, металлографии, микроэлектронике, петрографии, минералогии, кристаллографии и других областях. С помощью металлографических микроскопов можно проводить исследования любой степени сложности в машиностроении и электронной промышленности. Этот тип оптической техники используют для исследования микроструктуры готовых деталей, шлифов, металлов, специальных композиционных материалов, пород, шлаков, сплавов.
Микроскоп люминесцентный • Предназначен для наблюдения изображения объектов в свете видимой люминесценции, а также в проходящем свете в светлом поле. • Используется для проведения диагностики различных заболеваний иммунофлюоресцентным методом, микроскоп позволяет работать с объектами, окрашенными такими красителями как: акридиновый оранжевый, FITC, Ромадин, DAPI и др. • Устройство регулировки жесткости подъема столика, люминесцентным осветителем и защитным фильтром. • Цветовая волна - голубая, зеленая • Фильтры - ЕХ 490 (голубой), ЕХ 545 (зеленый) • Объективы - флюорисцентные 4 Х, 10 Х, 40 Х, 100 Х • Цветовое избирающее зеркало - DM 510(голубое), DM 580 (зеленое) • Ртутная лампа - НВО • Вспомогательный фильтр - ЕХ 450 -490 • Источник света - галогенная лампа 6 В/30 Вт • Параметры сети, В/Гц - 220/50 • Мощность - 35 Вт • Предметный столик - прямоугольный, координатный, со съемным препаратоводителем
Микроскоп люминесцентный
Поляризационные микроскопы • Применяется микроскоп, например, Биомед 5 П, Биомед 6 ПО, в медикобиологических исследованиях при изучении препаратов крови, шлифов зубов, костей, в минералогии, металлографии, химии, криминалистики, различных областях медицины. Позволяют выявлять неоднородности (анизотропию) структуры при изучении строения тканей и образований в организме в поляризационном свете
Стереоскопические микроскопы • предназначены для наблюдения мелких объектов и выполнения разнообразных тонких работ: препарирования в биологии, изучения образцов горных пород - в минералогии. • Его отличие от биологического микроскопа в том, что у него небольшое, до 100 х увеличение, и микроскоп дает объемное изображение, т. к. имеет раздельные оптические системы для каждого глаза. • С помощью стереомикроскопа можно рассматривать кристаллы, ювелирные изделия, мелкие механизмы, например часовые, насекомых. • Также с помощью стереомикроскопов можно оценивать пайку и качество печатных плат и мелких радиодеталей, выполнять различные технологических операций в полупроводниковой промышленности, а также в других областях науки и техники. • Стереоскопические микроскопы дают прямое и объемное изображение, рассматриваемых объектов.
Конфокальная микроскопия • Термин “конфокальный” означает “софокусный” – в плоскости, оптически сопряженной с фокальной плоскостью объектива, находится конфокальная диафрагма. • В отличие от классического оптического микроскопа, создающего плоское изображение чаще всего трехмерного образца, конфокальный микроскоп в каждый определенный момент времени регистрирует изображение только одного горизонтального сечения объекта.
Конфокальная микроскопия • Выстраивание полноценного изображения достигается путем последовательного сканирования (движения образца или оптической системы) по всему объему образца. • Возможность регистрирования света только из одной плоскости получена с помощью диафрагмы с малым отверстием, расположенным в плоскости, сопряженной фокальной плоскости объектива.
Конфокальная микроскопия • В качестве специального фильтра в конфокальных микроскопах фирмы Nanafocus AG используется вращающийся диск с тысячами отверстий. • Его прототипом стало датируемое ещё 1884 годом изобретение германского учёного Paul Nipkow, обеспечивающее передачу изображений на расстояние. • Диск Нипкова имеет множество отверстий, которые формируют множество точек света для создания конфокального изображения. • Диск вращается и получается конфокальное изображение поверхности над полем зрения. Любая ошибка волнового фронта корректируется измерением оптически плоской поверхности.
Конфокальная микроскопия • Применение принципа конфокальности приводит к значительному увеличению контрастности изображения. • Именно высокая контрастность изображений, полученных на конфокальном микроскопе, позволила значительно расширить круг задач, изучаемых оптическими методами. • Несмотря на то, что увеличение разрешения в смысле критерия Релея, а следовательно и максимальное эффективное увеличение в конфокальном микроскопе возрастает менее чем в 1, 5 раза по сравнению с аналогичным по качеству широкопольным микроскопом, возможности в разрешении мелких структур возрастают многократно.
Конфокальная микроскопия • Например, тусклый объект не представляется возможным обнаружить возле объекта гораздо более яркого, даже если они явно разделимы, однако при использовании конфокального микроскопа это становится возможным. • Если в обычных микроскопах в качестве источника света, используется ртутная или ксеноновая лампа, то в современных конфокальных микроскопах – это лазер (или светодиод). • Преимущество светодиодных источников света по сравнению с ламповыми – это монохроматичность генерируемого света (ширина линии генерации значительно меньше 1 нм) и малая расходимость (т. е. высокая параллельность) пучка света. Малая расходимость пучка света способствует более эффективной работе оптической системы микроскопа, уменьшает число бликов, связанных с отклонением света от расчета. • На конфокальном микроскопе изображение Вы увидите на экране компьютера. Результаты сканирования поверхности передаются в компьютер, который формирует изображение и выводит его на экран монитора. Мощное программное обеспечение позволяет не только оцифровать объект в системе x-y-z координат, но сразу же визуализировать его как 3 D-объект. При этом цифровая модель объекта может быть сохранена и сохранена на компьютере и в дальнейшем вызвана для обработки или сравнения. Скорость получения информации об объекте составляет несколько секунд.
Конфокальная микроскопия • Таким образом, свет, исходящий из регистрируемого сечения, проходит через диафрагму, а свет от остальных точек образца будет отсечен диафрагмой. В конфокальных микроскопах объект также сканируется в плоскости XY освещающим лучом. • При этом в каждый момент времени освещена будет либо конкретная исследуемая точка, либо линия, но не все поле зрения целиком. • Конфокальная микроскопия отличается от обычной микроскопии, в первую очередь, улучшенным разрешением вдоль оптической оси объектива (ось Z), которое достигается за счет использования принципа конфокальной фильтрации отраженных от образца лучей. Только свет, отраженный от образца в фокусной плоскости линзы объектива может пройти обратно сквозь линзу и отверстие, и влиять на построение изображения поверхности.
Скачать презентацию Микроскопы Микроскоп — это оптический прибор, позволяющий
микроскопы.ppt