Методы изучения почвенных грибов I
Почва или грунт – обязательный компонент всех наземных биоценозов РАСТЕНИЯ • Почва обеспечивает растения и и др. почвообитающие организмы питательными веществами ПОЧВА • Почва является продуктом жизнедеятельности живых организмов. • Это ключевой горизонт, где происходят процессы распада органического вещества и замыкаются все биогеохимические циклы • Она является основной средой обитания большинства групп грибов
Основная особенность почвы как среды обитания – это ее гетерогенность • Почва является трехфазной системой, состоящей из: – твердой поверхности почвенных частиц, – пленки жидкости на их поверхности, – газообразной фазы между ними • почва – это комплекс одновременно существующих совершенно различных микросред обитания
Пул микроорганизмов в почве • «Опыт показывает, что обычно в любой почвенной микрозоне оказываются микроорганизмы, способные использовать любой питательный субстрат, причем в различных условиях. … Это достигается благодаря наличию в почве колоссального запаса разнообразных почвенных организмов – микробного пула» (Д. Г. Звягинцев, 1980)
Доля отдельных групп организмов от общей биомассы в лесных почвах Корни растений 50 – 60% Грибы 30 – 40 % Животные 5– 7% Бактерии 3– 5% Водоросли 1– 3%
Какие грибы считать почвенными? «Почвенными грибами в строгом смысле слова считают только те виды, которые проходят в ней все стадии своего развития» (С. Н. Виноградский). – Это теоретическое довольно строгое определение, сильно ограничивающее изучаемую группу. «Почвенные грибы – это виды которые постоянно и закономерно выделяются как из почвы, так и из различных субстратов, находящихся в ней» Т. Г. Мирчинк (1988), – Это удобное практическое определение, он оно не учитывает огромную группу плохо растущих на средах грибов (макромицеты и др. ) Почвенные грибы – это виды вегетативное тело которых большую часть жизненного цикла находится в почве или на связанных с ней субстратах (Л. Л. Великанов).
Условное деление грибов Макромицеты Микромицеты
Оценки количества видов почвенных грибов W. Gams «Biodiversity of soil-inhabiting fungi» // Biodiversity and Conservation 2007. V. 16 P. 69 -72 – 3 300 мицелиальных культивируемых микромицетов (включая 150 гломусовых). P. Bridge, B. Spooner «Soil fungi: diversity and detection» // Plant and Soil 2001. V. 232 Р. 147 -154 - 80 000 почвообитающих грибов (включая некультивируемые виды). Принадлежность грибов, изолированных из почв, к различным таксонам. (Составлено по Domsch K. H. , Gams W. , Anderson T. H. Compendium of soil fungi. (sec. ed. ) London: Academic Press, 1993. 859 p. , цитируется по А. В. Куракову, 2001) Таксон Число родов (их доля в %) Число видов (их доля в %) Oomycetes 3 (1. 8 %) 13 (2. 8 %) Zygomycetes 12 (7 %) 46 (10%) Ascomycetes 56 (32. 6%) 111 (24. 1 %) Basidiomycetes 3 4 Несовершенные грибы анаморфы Ascomycetes 92 (53. 8 %) 282 (61. 2 %) анаморфы Basidiomycetes 2 (1. 2 %) 2 (0. 4 %) Дрожжи, образующие мицелий 3 (1. 8 %) 3 (0. 7 %) Итого 171 род (100 %) (1. 8 %) (0. 9 %) 461 вид (100%)
Эколого-трофические группы грибов в почвах • По типу питания – Сапротрофы – Факультативные паразиты – Облигатные паразиты (сохраняются в почве) – Симбиотрофы – Хищные • По основному субстрату – – – «Сахарные грибы» Целлюлозолитики Лигнинолитики Хитинолитики Кератинофилы – Децидуофилы (подстилочные) – Копрофилы – Микофилы – Энтомофилы и т. п.
Функции грибов в почвах I Участвуют в процессах разложения органического вещества II Играют важнейшую роль в процессах почвообразования III Регулируют видовой состав, структуру и функциональную активность других организмов
Значимость почвенных грибов для человека + Поиск новых биологически активных веществ + Переработка отходов + Биологический метод защиты растений от грибных болезней или насекомых + Стимуляция роста растений (микоризация) + Рекультивация нарушенных почв o Мониторинг состояния окружающей среды - Источник агентов биоповреждений - Источник токсичных, аллергенных и условно патогенных для человека видов
Методические трудности изучения почвенных грибов • Невозможно напрямую наблюдать развитие грибов в почве • Изучается только ограниченное количество наугад взятых образцов • Получаемые данные очень сильно зависят от используемых методов • Невозможно получать стабильно повторяемые результаты
Методы изучения грибов прямые и косвенные • Попытки прямого • Выделение грибов из почвы наблюдения грибов в на питательные среды почве + позволяет определять видовой + позволяет определять биомассу мицелия + показывает долю разных типов мицелия и спор в почве - не дает представления о видовом составе - плохо отражает активность и жизнеспособность мицелия и спор - дают завышенную оценку численности за счет подсчета нежизнеспособных пропагул состав грибов, растущих на используемых средах + дает количество их жизнеспособных пропагул (КОЕ) - не дает представления о происхождении колоний - не позволяет судить о реально развивающихся в почве видах - дают заниженную оценку численности за счет селективности сред
Молекулярно биологические и биохимические методы + Относительно меньшая трудоемкость + Возможность обрабатывать больше проб - Трудность интерпретации данных - Трудность разделения вклада разных групп почвенных организмов - Высокая вероятность получения артефактов
Цели и задачи изучения почвенных грибов • Флористические исследования • Экологические исследования с элементами полевого эксперимента • Выявить видовой смотав и структуру комплекса почвенных грибов (инвентаризация биоразнообразия) • Проследить сезонные изменения в комплекса видов • Сукцессии видов на различных субстратах • Определить количество и биомассу грибов • Выявить сезонную динамику биомассы и зависимость ее от условий среды • Изучить биохимические и физиологические особенности найденных видов • Влияние изменений в окружающей среде на почвенную биоту (антропогенное воздействие, смена растительности и т. п. ) • Изучить функциональную структуру комплекса почвенных грибов • Моделирование процессов происходящих в почве (деструкции субстратов, гумусообразования и т. п. ) • Попытка понять связи грибов друг с другом и с остальными обитателями почвы
Практические задачи • Поиск продуцентов биологически активных веществ (антибиотиков, витаминов, ферментов, органических кислот, токсинов и т. д. ) • Переработка отходов и производство удобрений • Интродукция грибов в целях защиты растений • Восстановление (рекультивация) поврежденных почв • Мониторинг состояния окружающей среды • Определение степени антропогенного загрязнения • Анализ биологической опасности для здоровья людей • Исследование почв на наличие патогенов растений
Планирование исследования – ключевой этап работы • Изучение литературы по данному вопросу • Формулирование цели и задач исследования • Выбор и описание места сбора материала • Планирование проводимых анализов и экспериментов • Расчет количества и объема собираемого материала, достаточного для всех анализов и статистической обработки (не менее 10 однородных образцов)
Методы сбора материала • Выбор трансектов • Выбор площадок Закладка почвенных разрезов 20 × 20 м 10 образцов • Сборный образец • Точечный образец • Образцы из ризосферы
Хранение и транспортировка образцов • Замороженные образцы – не переносят оттаивания и повторного замораживания, хранятся до 3 х лет • Высушенные образцы – не переносят намокания и хранения в полиэтиленовых пакетах, хранятся не более 1 ого года Голлербах М. М. , Штина Э. А. Почвенные водоросли. Л. : Наука, 1969. 228 с.
Прямые методы изучения грибов в почве • Микроскопирование почвы • Наблюдение растущего мицелия в почве • Анализ веществ входящих в мицелий и споры грибов (ДНК, хитин, эргостерол и др. ) • Анализ продуктов жизнедеятельности грибов в почвах (токсины, антибиотики, ферменты и др. ) • Оценка процессов, осуществляемых грибами в почвах (дыхание, деградация субстратов и др. )
Прямое микроскопирование почвы или почвенной суспензии • Световой микроскоп (Conn, 1922 показал наличие грибного мицелия в почве) • Сканирующий электронный микроскоп (Никитин, Макарьева, 1970) • Люминесцентная микроскопия (Strugger, 1949; (Кожевин, 1976; Звягинцев и др. , 1978) • Подсчет на стеклах по методу С. Н. Виноградского (1952) в модификации О. Г. Шульгиной • Прямой подсчет в счетных камерах • Метод агаровых пленок Джонсона (Jones, Mollison, 1948) • Подсчет на мембранных фильтрах (Hansen et al. , 1974) в модификации Т. С. Демкиной и Т. Г. Мирчинк (1977) • Метод флотации (Ledingham, Chinn, 1955)
Световой микроскоп
Сканирующий электронный микроскоп
Люминесцентная микроскопия на почвенных монолитах по Д. Г. Звягинцеву (1963) Флуоресцеин диацетат (FDA) – окрашивает только активно метаболизирующие клетки Калькофлуор белый - окрашивает преимущественно хитин Акридин оранжевый - окрашивает мёртвые клетки в красный, а живые в зеленый цвет
Подсчет на стеклах по методу С. Н. Виноградского (1953) Формула для расчета длины мицелия на 1 г воздушно сухого субстрата L= _a S c_ v s m a – средняя длина мицелия в поле зрения микроскопа или среднее число спор или клеток v – объем наносимой суспензии (мл) s – площадь поля зрения (в мкм 2) S – площадь препарата в (мкм 2; 8 см 2 = 160000 мкм 2) c – разведение почвенной суспензии (10 или 100) m – сухой вес 1 г исходной почвы, взятой для анализа
Наблюдение растущего мицелия в почве • Метод стекол обрастания Н. Г. Холодного-Росси (Rossi, Ricardo, 1927; Cholodny, 1930) «Микробный пейзаж» (модификации метода с добавлением питательных сред (Рыбалкина, Кононенко, 1953) • Специальные камеры для наблюдения растущего мицелия в почве (Метод почвенных камер Н. Г. Холодного (1933), капилляры и педоскопы Б. В. Перфильева и Д. Р. Габе (1961), стекла-ловушки Ля-Туш (1948), решетчатые пластинки Торнтона (1952) и др. ) • Метод погруженных трубок Честерса (Chesters, 1940)
Стекла обрастания Н. Г. Холодного Позволяет изучать микробные ассоциаций непосредственно в почве Холодный Н. Г. Методы непосредственного наблюдения в почвенной микробиологии // Микробиология. 1935. Т. 4. Вып. 1. № 4. С. 75– 79.
Камеры для наблюдения растущего мицелия в почве Великанов Л. Л. , Сидорова И. И. , Успенская Г. Д. Полевая практика по экологии грибов и лишайников. М. : МГУ, 1980. 110 с. Методы почвенной микробиологии и биохимии. (ред. Звягинцев Д. Г. ). Москва: Издательство МГУ, 1991. 304 с.
Биохимические и молекулярно биологические методы • Методы анализа ДНК в почве • Определение общего хитина в почве • Определение общего эргостерина в почве • Определение состава жирных кислот (Phospholipid Fatty Acid Analysis (PLFA) • Определение ферментов (лакказ, целлюлаз и др. ) • Иммунологический анализ • Определение почвенного дыхания (для грибов измеряется субстрат-индуцированное дыхание после добавления целлюлозы) • Изучение скорости деградации определенных субстратов
Методы анализа ДНК в почве Экология микроорганизмов. Под. ред. А. И. Нетрусова. М. : Издательский центр «Академия» . 2004. 272 с.
Иммунологический анализ Используется для изучения отдельных видов и даже отдельных штаммов в почве Кожевин П. А. Микробные популяции в природе. М. : Издательство МГУ. 1989. 175 стр.
Прямые методы дают нам представление: ü о длине мицелия в исследуемой почве ü о числе спор ü о биоморфологической структуре грибного компонента почвенной биоты ü о биомассе грибов ü о ферментативной активности грибов ü о соотношении в почвах определенных групп грибов – морфологических, физиологических, трофических Прямые методы не дают нам представление: ü о видовом составе грибов в почвах
Главный недостаток визуальных методов – субъективность исследователя Недостаток биохимических методов – непредсказуемость протекания реакций в гетерогенной среде почвы и сложность интерпретации получаемых данных
Литература Великанов Л. Л. , Сидорова И. И. , Успенская Г. Д. Полевая практика по экологии грибов и лишайников. М. : МГУ, 1980. 110 с. Кураков А. В. Методы выделения и характеристики комплексов микроскопических грибов наземных экосистем. М. : МАКС Пресс. 2001. 91 стр. Литвинов М. А. Методы изучения почвенных микроскопических грибов. Л. : Наука, 1969. 120 с. Мегарран Э. Экологическое разнообразие и его измерение. М. : Мир, 1992. 181 с. Методы почвенной микробиологии и биохимии. (ред. Звягинцев Д. Г. ). Москва: Издательство МГУ, 1991. 304 с. Методы экспериментальной микологии. Киев: Наукова Думка, 1978. 239 с. Методы экспериментальной микологии. Справочник. Киев: Наукова Думка, Билай В. И. (ред. ) 1982. 550 с. Мирчинк Т. Г. Почвенная микология. Москва: Издательство МГУ, 1988. 220 с. Мирчинк Т. Г. , Озерская С. М. , Марфенина О. Е. Выявление комплексов микроскопических грибов по их структуре // Научные доклады высшей школы. Биологические науки. 1982. № 11. С. 61 -66. Мирчинк Т. Г. , Пнников Н. С. Современные подходы к оценке биомассы и продуктивности грибов и бактерий в почве. // Успехи микробиол. , -1985, - Т. 20, - С. 198 -226 Разумовская З. Г. , Чижик Г. Я. , Громов Б. В. Лабораторные занятия по почвенной микробиологии. Л. : Изд-во ЛГУ, 1960. С. 138– 140. Струнникова О. К. , Шахназарова В. Ю. , Вишневская Н. А. , Муромцев Г. С. Применение мембранных фильтров и иммунофлюоресцентного окрашивания для наблюдения за развитием почвообитающих микромицетов. // Микология и фитопатология. 1998. Т. 32, вып. 2. Стр. 65 -72. Сэги Й. Методы почвенной микробиологии. М. : Колос. 296 с. Холодный Н. Г. Методы непосредственного наблюдения в почвенной микробиологии // Микробиология. 1935. Т. 4. Вып. 1. № 4. С. 75– 79. Gams W. et al. , ed. CBS course of mycology, fourth edition. 1998. 165 pp. ,
Скачать презентацию Методы изучения почвенных грибов I Почва или
01Методы изучения почвенных грибов.ppt