Скачать презентацию МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ ВИРУСНЫХ ЧАСТИЦ Электронная микроскопия Скачать презентацию МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ ВИРУСНЫХ ЧАСТИЦ Электронная микроскопия

Lect2_meth2_struct.ppt

  • Количество слайдов: 58

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ ВИРУСНЫХ ЧАСТИЦ • Электронная микроскопия (негативный контраст; крио-ЭМ) • Рентгено-структурный анализ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ ВИРУСНЫХ ЧАСТИЦ • Электронная микроскопия (негативный контраст; крио-ЭМ) • Рентгено-структурный анализ • Атомная силовая микроскопия, сканирующая туннельная микроскопия • Ядерный магнитный резонанс

Сравнительные размеры вирусов и других объектов Сравнительные размеры вирусов и других объектов

Негативное окрашивание Папилломавирусы Преимущества: простая процедура; короткое время обработки образца; высокий контраст Недостатки: дегидратация; Негативное окрашивание Папилломавирусы Преимущества: простая процедура; короткое время обработки образца; высокий контраст Недостатки: дегидратация; соли тяжелых металлов плоское изображение 3 -D структуры; артефакты (эффект муара)

Крио-электронная микроскопия A B Анализируемые образцы: 200 k. Da – 400 MDa Крио-электронная микроскопия A B Анализируемые образцы: 200 k. Da – 400 MDa

Реконструкция 3 D изображения Реконструкция 3 D изображения

Электронная томография Электронная томография

Преимущества : нативный, гидратированный образец с исходной 3 D-структурой; достаточно 1000 молекул образца; возможность Преимущества : нативный, гидратированный образец с исходной 3 D-структурой; достаточно 1000 молекул образца; возможность изучения 3 D-структуры крупных комплексов; низкая температура предупреждает радиационные повреждения от электронных пучков. Недостатки: сложная экспериментальная процедура; низкий контраст; разрешение хуже, чем РСА и ЯМР; высокий шум (необходимость в большом количестве измерений)

Рентгено-структурный анализ Нобелевская премия по физике, 1915 (совместно с отцом, Sir William Н. Bragg) Рентгено-структурный анализ Нобелевская премия по физике, 1915 (совместно с отцом, Sir William Н. Bragg) «За достижения в анализе кристаллической структуры с использованием рентгеновских лучей и важный вклад в развитие рентгеновской кристаллографии» Sir William Lawrence Bragg (1890 – 1971) Вывел уравнение, связывающее угол отражения рентгеновских лучей от системы параллельных кристаллографических плоскостей с расстоянием между этими плоскостями (условие Брэгга – Вульфа)

Схема рентгено-структурного анализа Схема рентгено-структурного анализа

Установка для рентгено-структурного анализа Установка для рентгено-структурного анализа

Кристалл 0, 2 мкм и лаограмма энтеровируса быка Кристалл 0, 2 мкм и лаограмма энтеровируса быка

Кристаллы вируса желтой мозаики турнепса (TYMV), выращеные в присутствии высокой концентрации соли (1) и Кристаллы вируса желтой мозаики турнепса (TYMV), выращеные в присутствии высокой концентрации соли (1) и ПЭГ (2) 1 2

Рамановская микроскопия (на основе спектроскопии комбинационного рассеяния (Raman scattering spectroscopy) Рамановская микроскопия (на основе спектроскопии комбинационного рассеяния (Raman scattering spectroscopy)

Атомная силовая микроскопия Атомная силовая микроскопия

Структура диска ВТМ (а) – реконструкция по результатам ЭМ с разрешением 2, 5 нм; Структура диска ВТМ (а) – реконструкция по результатам ЭМ с разрешением 2, 5 нм; (b) - реконструкция по результатам РСА с разрешением 0, 5 нм; (с) - реконструкция по результатам РСА с разрешением 0, 28 нм

Техники сканирования проб STM: scanning tunneling microscope AFM (SFM): atomic (scanning) force microscope MFM: Техники сканирования проб STM: scanning tunneling microscope AFM (SFM): atomic (scanning) force microscope MFM: magnetic force microscope SNOM: scanning near-field optical microscope

Схема сканирования (AFM, SFM) Схема сканирования (AFM, SFM)

AFM-изображение вируса лейкемии мышей AFM-изображение вируса лейкемии мышей

ЯМР Варианты: СOSY/NOESY (13 C 15 N 1 H; 3 D-str) TROSY TOCSY HSQC ЯМР Варианты: СOSY/NOESY (13 C 15 N 1 H; 3 D-str) TROSY TOCSY HSQC

Варианты • HSQC – heteronuclear single quantum coherence • NOESY – nuclear Overhauser effect Варианты • HSQC – heteronuclear single quantum coherence • NOESY – nuclear Overhauser effect spectroscopy • (13 C 15 N 1 H; 3 D-str) • TROSY – transverse relaxation optimized spectroscopy • TOCSY – total correlation spectroscopy

Структура fusion-домена гемагглютинина вируса гриппа в мицелле по результатам NOESY и. TOCSY экспериментов (600 Структура fusion-домена гемагглютинина вируса гриппа в мицелле по результатам NOESY и. TOCSY экспериментов (600 MHz) Докинг этой же структуры к липидному бислою с использованием данных по ЭПР-спектроскопии

ПРИНЦИПЫ СТРУКТУРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ВИРУСНОЙ ЧАСТИЦЫ ПРИНЦИПЫ СТРУКТУРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ВИРУСНОЙ ЧАСТИЦЫ

Структурная организация вириона ДНК или РНК 60% Структурные [Ферменты и белки, + связывающиеся с Структурная организация вириона ДНК или РНК 60% Структурные [Ферменты и белки, + связывающиеся с белки + НК ] (капсомеры) Оболочечный вирус → → 40% Нуклеокапсид (безоболочечный вирус) + мембрана с гликопротеинами Функции капсида: DNA: 1, 2 x 106 – 2 x 108 Da -Защита генома RNA: 1, 2 x 106 – 7 x 106 Da -Доставка генома в клетку -Взаимодействие с клеткой-хозяином

Спиральная симметрия капсидов Спиральная симметрия капсидов

Параметры спирали ВТМ P=μxρ Параметры спирали ВТМ P=μxρ

Реконструкция ВТМ Реконструкция ВТМ

Пространственная модель капсомера ВТМ Пространственная модель капсомера ВТМ

Структура филаментного фага fd fiber X-ray diffraction Структура филаментного фага fd fiber X-ray diffraction

Данные по структуре fd, полученные с помощью cryo-EM Данные по структуре fd, полученные с помощью cryo-EM

Данные по структуре fd, полученные с помощью твердотельного ЯМР Данные по структуре fd, полученные с помощью твердотельного ЯМР

Икосаэдрическая симметрия капсидов (Caspar, D. L. D. , and A Klug. Икосаэдрическая симметрия капсидов (Caspar, D. L. D. , and A Klug. "Physical Principles in the Construction of Regular Viruses. " Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 27 (1962): 1 -24) 10 6 15

Т – триангуляционное число, описывает симметрию частиц в икосаэдре T = h 2+hk+k 2 Т – триангуляционное число, описывает симметрию частиц в икосаэдре T = h 2+hk+k 2

Структура полиовируса Структура полиовируса

Структура капсидного белка VP 1 полиовируса Структура капсидного белка VP 1 полиовируса

Реконструкция вириона аденовируса Реконструкция вириона аденовируса

Схема капсомера вириона аденовируса Схема капсомера вириона аденовируса

Оболочечные вирусы Реконструкция альфа-вируса Реконструкция и ЭМ (негативный контраст) вируса гриппа Оболочечные вирусы Реконструкция альфа-вируса Реконструкция и ЭМ (негативный контраст) вируса гриппа

Структура вириона HSV-1 Структура вириона HSV-1

Структура вириона реовируса (φ12) Структура вириона реовируса (φ12)

Особенности структуры Papova вирусов Liddington et al. показали в 1991 г. , что структура Особенности структуры Papova вирусов Liddington et al. показали в 1991 г. , что структура капсида полиомовируса не укладывается в теорию Каспара - Клуга

Viral tiling theory - теория Reidun Twarock A tiling approach to virus capsid assembly Viral tiling theory - теория Reidun Twarock A tiling approach to virus capsid assembly explaining a structural puzzle in virology. J Theor Biol. 226, 477 -482 (2004). Подход основан на теории групп (Coxetergroups) и приводит к сферическому тайлингу, полностью охватывающему поверхность вируса

С помощью VTT можно описать процесс сборки капсида С помощью VTT можно описать процесс сборки капсида

Электронная микрофотография и схема структуры бактериофага Т 4 Электронная микрофотография и схема структуры бактериофага Т 4

Структура головок бактериофагов по результатам крио-ЭМ Структура головок бактериофагов по результатам крио-ЭМ

Реконструкция отдельных компонентов бактериофага Т 4 Реконструкция отдельных компонентов бактериофага Т 4

Вирусные геномы >100 000 генов 6 600 генов 4 гена 4 288 генов 900 Вирусные геномы >100 000 генов 6 600 генов 4 гена 4 288 генов 900 генов 25 000 генов

Морфология вирусных геномов Морфология вирусных геномов

Организация нуклеиновых кислот в вирионе Комплекс белок-РНК вируса цитоплазматического полиэдроза (крио-ЭМ реконструкция). Диаметр вириона Организация нуклеиновых кислот в вирионе Комплекс белок-РНК вируса цитоплазматического полиэдроза (крио-ЭМ реконструкция). Диаметр вириона – 60 нм; ТЕС – транскрипционный комплекс Белки шипов Белки капсида ds. RNA

Упаковка ds. DNA в вирионах Упаковка ds. DNA в вирионах

Модели упаковки ds. DNA в вирионах a – спираль b – шпулька c – Модели упаковки ds. DNA в вирионах a – спираль b – шпулька c – тороид d – свернутый тороид

Жизненный цикл ДНК-содержащего бактериофага Вирион ДНК Белковая оболочка остается снаружи Вирусная ДНК входит 3. Жизненный цикл ДНК-содержащего бактериофага Вирион ДНК Белковая оболочка остается снаружи Вирусная ДНК входит 3. Синтез нуклеиновых кислот и белков 1. Прикрепление (адсорбция) 4. Сборка и упаковка 2. Проникновение (инъекция) 5. Выход вирионов (лизис) 3. Синтез нуклеиновых кислот и белков Вирионы

Литический и лизогенный циклы Литический цикл Литзогенный цикл Литический и лизогенный циклы Литический цикл Литзогенный цикл

Жизненный цикл вируса животных Жизненный цикл вируса животных

ПРОНИКНОВЕНИЕ ВИРУСА В КЛЕТКУ (VIRYS ENTRY) ПРОНИКНОВЕНИЕ ВИРУСА В КЛЕТКУ (VIRYS ENTRY)

Этапы проникновения вируса в клетку • Обратимая адсорбция: на этом этапе вирусная частица может Этапы проникновения вируса в клетку • Обратимая адсорбция: на этом этапе вирусная частица может диссоциировать • Необратимая адсорбция: специфическое взаимодействие вирусного рецептора клетки с антирецептором вируса • Проникновение вируса в клетку и развитие вирусной инфекции

Природа взаимодействия вирусного рецептора и антирецептора • • Электростатические Водородные Ван-дер-Ваальсовы Стерическое соответствие Аденовирус/эритроциты: Природа взаимодействия вирусного рецептора и антирецептора • • Электростатические Водородные Ван-дер-Ваальсовы Стерическое соответствие Аденовирус/эритроциты: р. Н 5, 5 – 8, 7 Вирус Коксаки/Hela р. Н 3, 0 – 3, 5 Т 4/E/coli 0, 5% Na. Cl