Скачать презентацию Лекция 5 Система эндосом Экзосомы Структуры связанные с Скачать презентацию Лекция 5 Система эндосом Экзосомы Структуры связанные с

Лек 5 2014.ppt

  • Количество слайдов: 43

Лекция 5 Система эндосом Экзосомы Структуры, связанные с плазматической мембраной Лекция 5 Система эндосом Экзосомы Структуры, связанные с плазматической мембраной

Эндоцитоз - интернализация клетками растворенных веществ и жидкости, макромолекул, компонентов плазмалеммы и всевозможных частиц Эндоцитоз - интернализация клетками растворенных веществ и жидкости, макромолекул, компонентов плазмалеммы и всевозможных частиц путем формирования углубления плазмалеммы и отшнуровки мембранного пузырька. В клетках многоклеточных организмов эндоцитированный материал включает широкий спектр лиганд-рецепторных комплексов, жидкостей, липидов, мембранных белков, компонентов внеклеточного матрикса, «обломки» разрушенных клеток, бактерии, вирусы и многое другое. В «типичной» клетке млекопитающих путем эндоцитоза за час обновляется 50 -180% площади плазматической мембраны. Макрофаг интернализует ~ 30% своего объема за час, ~ 2/3 объема возвращается во внеклеточное пространство в течение 15 -20 минут. Лиганды, попадающие в клетку разными путями микроэндоцитоза, направляются в раннюю эндосому. ЭНДОСОМЫ осуществляют регуляцию различных процессов в клетке посредством «обработки» , сортировки, рециркуляции, активации, блокирования и деструкции захваченных веществ и рецепторов.

Ранняя эндосома – первая «станция» на пути потока эндоцитируемого материала и базовое звено системы Ранняя эндосома – первая «станция» на пути потока эндоцитируемого материала и базовое звено системы эндосом Ранняя эндосома Лизосома о Рециркулирующая эндосома о о оо Поздняя (секреторная) эндосома Мультивезикулярное тельце о о оо Поздняя эндосома (мультивезикулярное тельце)

Рециркулирующая эндосома Ранняя эндосома Аппарат Гольджи Лизосома Рециркулирующая эндосома Ранняя эндосома Аппарат Гольджи Лизосома

Ранние эндосомы Везикулярная часть ранней эндосомы ( «тело» , мультивезикулярная часть (до 1 мкм Ранние эндосомы Везикулярная часть ранней эндосомы ( «тело» , мультивезикулярная часть (до 1 мкм в диаметре) и тубулярная часть (трубочки, около 60 нм в диаметре) Главная функция ранних эндосом: сортировка интернализованных молекул, происходит в течение 3 – 5 мин после интернализации эндоцитозного пузырька. «Тело» ранней эндосомы вовлечено в сортировку молекул для деградации Тубулярные элементы обеспечивают сортировку белков для рециркуляции В ранней эндосоме нет гидролаз!!! Многие вирусы «раздеваются» в ранней эндосоме, попав в клетку путем микроэндоцитоза

Ранние эндосомы Атитела к Rab 5 Иммуно-флуоресценция Ранние эндосомы Клетка культуры He. La. Метка: Ранние эндосомы Атитела к Rab 5 Иммуно-флуоресценция Ранние эндосомы Клетка культуры He. La. Метка: фактор роста эпидермиса и трансферрин. 5 мин. инкубации. Маркеры ранних эндосом: Early Endosome Associated Protein (EEA-1) - Rabaptin-5 - Rabaptin-4 р. Н = около 6 (6, 3 -6, 5)

Рециркулирующие эндосомы Система эндосом динамична, потоки мембран движутся в разных направлениях, трансформируются части ранней Рециркулирующие эндосомы Система эндосом динамична, потоки мембран движутся в разных направлениях, трансформируются части ранней эндосомы, превращаясь в рециркулирующие и поздние эндосомы. Формирование рециркулирующих эндосом связано с накоплением в тубулярной части ранней эндосомы белков, предназначенных для возврата в плазмалемму. Рециркулирующие эндосомы представлены в основном тубулярными структурами диаметром около 60 нм, которые контактируют между собой и «общаются» с ранними эндосомами и аппаратом Гольджи посредством пузырькового транспорта. Маркер рециркулирующих эндосом - Rabaptin-11 Рециркулирующие эндосомы обеспечивают сортировку и эндоцитированного, и синтезированного в клетке материала, что особенно важно для поляризованных клеток (эпителий), в которых очень велика разница между белковым составом апикальной и базолатеральной плазмалеммы

Накопление пероксидазы хрена в рециркулирующих эндосомах р. Н в рециркулирующих эндосомах возрастает до 6, Накопление пероксидазы хрена в рециркулирующих эндосомах р. Н в рециркулирующих эндосомах возрастает до 6, 5

Варианты рециркуляции: - молекулы возвращаются в ту же часть плазмалеммы, откуда были эндоцитированы, - Варианты рециркуляции: - молекулы возвращаются в ту же часть плазмалеммы, откуда были эндоцитированы, - молекулы направляются в другую часть плазмалеммы (базо-латеральная сортировка) Апикальная часть клетки кишечника сосунка крысы. В полость кишечника была введена соль лантана при фиксации. Лантан выявил развитую тубулярную систему и визуализировал взаимосвязь её элементов

Система эндосом ( «эндолизосомальная система» ) включает в себя взаимосвязанные мембранные органеллы: - эндоцитозные Система эндосом ( «эндолизосомальная система» ) включает в себя взаимосвязанные мембранные органеллы: - эндоцитозные пузырьки - ранние эндосомы - рециркулирующие эндосомы - поздние эндосомы (МВТ) - лизосомы Ранняя эндосома Лизосома о Рециркулирующая эндосома о о оо Поздняя (секреторная) эндосома Мультивезикулярное тельце о о оо Поздняя эндосома (мультивезикулярное тельце)

Трансформация ранних эндосом в «разрушающие» МВТ происходит постепенно, по мере накопления в полости эндосом Трансформация ранних эндосом в «разрушающие» МВТ происходит постепенно, по мере накопления в полости эндосом кислых гидролаз, которые доставляются из аппарата Гольджи посредством «опушенных» (клатриновых) пузырьков. Ретроградный транспорт из эндосом в аппарат Гольджи обеспечивает возврат мембран и рецептора маннозо-6 -фосфата в аппарат Гольджи. Ретроградный транспорт необходим для «нормальной» жизни клетки. В мембране МВТ есть специальные молекулярные структуры, обеспечивающие формирование пузырьков, направляющихся обратно в АГ. Топология этих пузырьков аналогична эндоцитозу – внутрь цитоплазмы. Формирование пузырьков этого типа обеспечивается клатрином.

Мультивезикулярные тельца (поздние эндосомы) Размеры МВТ – до 1 мкм, обычно – около 500 Мультивезикулярные тельца (поздние эндосомы) Размеры МВТ – до 1 мкм, обычно – около 500 нм Везикулы (пузырьки) имеют размер 40 -100 нм Пузырьки называют “intralumenal vesicles” ( «пузырьки в просвете» ).

Образование внутренних пузырьков в МВТ Деформация мембраны происходит в противоположном эндоцитозу направлении – «из Образование внутренних пузырьков в МВТ Деформация мембраны происходит в противоположном эндоцитозу направлении – «из цитоплазмы»

Деформацию мембраны и отщепление пузырька обеспечивает молекулярный комплекс в мембране ранних эндосом – «Сортировочный Деформацию мембраны и отщепление пузырька обеспечивает молекулярный комплекс в мембране ранних эндосом – «Сортировочный комплекс эндосом, необходимый для транспорта» ESCRT (endosomal sorting complex required for transport) Состоит из 4 молекулярных комплексов (0–III), которые взаимодействуют между собой и с молекулами цитоплазмы, в том числе - с убиквитином. Формирование внутреннего пузырька МВТ требует деформации и разделения мембран. Топология этого процесса «противоположна» эндоцитозу, когда пузырек поступает внутрь клетки. Сортировочный комплекс ESCRT также участвует в финальных стадиях разделения мембран при расхождении делящихся клеток, почковании вирусов. Механизм формирования пузырьков окончательно не установлен.

Модели отшнуровки внутреннего пузырька МВТ Сортировочный комплекс ESCRT играет важную роль в системе деградации Модели отшнуровки внутреннего пузырька МВТ Сортировочный комплекс ESCRT играет важную роль в системе деградации немембранных белков клетки: он обеспечивает их поступление в полость МВТ при формировании внутренних пузырьков, а МВТ, в свою очередь, либо сливаются с лизосомой, где происходит деградация молекул, либо сами превращаются в лизосому.

Мультивезикулярные тельца, экзосомы Электронно-микроскопическая томография Мультивезикулярные тельца, экзосомы Электронно-микроскопическая томография

 «Разрушающие» МВТ К. Г-зы наиболее удаленная транс-цистерна аппарата Гольджи, «клатриновые» пузырьки Рецептор маннозо-6 «Разрушающие» МВТ К. Г-зы наиболее удаленная транс-цистерна аппарата Гольджи, «клатриновые» пузырьки Рецептор маннозо-6 -фосфата К. Г-зы р. Н 5, 0 – 6, 0 р. Н=5, 9 -6 Ранняя эндосома Кислые гидролазы Поздняя эндосома ( «разрушающее» МВТ)

Поздняя эндосома (МВТ) Комплекс Гольджи Рецептор маннозо-6 -фосфата К. Г-зы Разрушение белков и липидов Поздняя эндосома (МВТ) Комплекс Гольджи Рецептор маннозо-6 -фосфата К. Г-зы Разрушение белков и липидов Маркеры поздних эндосом: 1. Rabaptin-7 и Rabaptin-9 2. Lysobisphosphatidic acid (LBPA) 3. MPR+ Рецептор маннозо-6 -фосфата В поздней эндосоме присутствуют специфичные мембранные белки - Residual heavily glycosylated lysosomal associated membrane proteins (LAMPs). Их углеводные части защищают мембрану от действия гидролаз.

Функции поздней эндосомы исчерпываются, когда она возвращает все рецепторы маннозо-6 -фосфата в АГ Возврат Функции поздней эндосомы исчерпываются, когда она возвращает все рецепторы маннозо-6 -фосфата в АГ Возврат всех рецепторов М-6 -Ф в АГ – сигнал о превращении поздней эндосомы в лизосому. Поздняя эндосома лизосома К. Г-зы Лизосомы – конечная стадия эндоцитоза и фагоцитоза, место деградации захваченных клеткой молекул, и предназначенных для деградации молекул цитоплазмы, поступивших в МВТ при формировании внутренних пузырьков

Лизосомы и поздние эндосомы (лизосомы? ) Культура клеток MDCK Связывание с убиквитином – главный Лизосомы и поздние эндосомы (лизосомы? ) Культура клеток MDCK Связывание с убиквитином – главный сигнал о направлении молекулы белка на деградацию!

Raft-depended endocytosis Raft-depended endocytosis

 «Секретирующие» мультивезикулярные тельца ЭКЗОСОМЫ Пузырьки (везикулы) Д = 40 -100 нм Секретируются всеми «Секретирующие» мультивезикулярные тельца ЭКЗОСОМЫ Пузырьки (везикулы) Д = 40 -100 нм Секретируются всеми изученными клетками in vitro Присутствуют во всех клетках in vivo Выявлены в биологических жидкостях (кровь, слюна, молоко и др. ) Функции точно не установлены, но есть много данных об участии во всевозможных регуляторных и транспортных механизмах

Выделение пузырьков из МВТ, сливающихся с плазмалеммой (экзоцитоз), было описано впервые в 1983 г. Выделение пузырьков из МВТ, сливающихся с плазмалеммой (экзоцитоз), было описано впервые в 1983 г. Термин «экзосомы» был предложен в 1987 г. Экзосомы осаждаются при 100 000 g Имеют плавучую плотность в градиенте сахарозы 1. 10– 1. 21 g/m. L Три основных метода выделения экзосом: ультрацентрифугирование, ультрафильтрация и иммунопреципитация с использованием антител, связанных с магнитными шариками. На 2010 г. : в разных экзосомах обнаружено 143 вида биологически активных молекул, включая микро. РНК и м. РНК Экзосомы имеют уникальный механизм адресной доставки молекул Расшифровка этого механизма – одна из приоритетных задач современной науки

Выделение экзосом опухолевой клеткой Экзосомы. Негативное контрастирование Выделение экзосом опухолевой клеткой Экзосомы. Негативное контрастирование

Экзосомы в препаратах плазмы человека (ГКБ ИХБФМ СО РАН) 200 nm 200 nm 100 Экзосомы в препаратах плазмы человека (ГКБ ИХБФМ СО РАН) 200 nm 200 nm 100 nm 200 nm Экзосомы, полученные на культуре клеток Hep. G-2 (ЛБНК ИХБФМ СО РАН) 200 nm

Слияние МВТ с плазмалеммой, выделение экзосом во внеклеточное пространство Слияние МВТ с плазмалеммой, выделение экзосом во внеклеточное пространство

Внеклеточные органеллы 1. Экзосомы 2. «Сбрасываемые» микропузырьки (shedding microvesicles) – размером 100 - 1000 Внеклеточные органеллы 1. Экзосомы 2. «Сбрасываемые» микропузырьки (shedding microvesicles) – размером 100 - 1000 нм, полиморфны «Отпочковываются» от клетки 3. Апоптозные пузырьки (apoptotic blebs) - 50 -500 нм. Являются «останками» гибнущих путем апоптоза клеток

Формирование микропузырьков Микропузырьки, выделенные из мочи здорового донора (А, В) и больного раком простаты Формирование микропузырьков Микропузырьки, выделенные из мочи здорового донора (А, В) и больного раком простаты (С, Д). Микропузырьки полиморфны, размером более 100 нм (до 1 мкм) Образуются путем «почкования» на поверхности клеток Обнаружены во всех исследованных биологических жидкостях

Апоптозные «пузырьки» (апоптозные тельца? ) формируются на плазматической мембране клеток, претерпевающих апоптоз. Фактически – Апоптозные «пузырьки» (апоптозные тельца? ) формируются на плазматической мембране клеток, претерпевающих апоптоз. Фактически – это «останки» конденсированных разрушающихся клеток. В процессе апоптоза образуются и микропузырьки, но на его ранних стадиях. Апоптозные «пузырьки» (50 -500 нм) формируются на поздних стадиях апоптоза. Апоптозные «пузырьки» гетерогенны по размерам и форме, в отличие от экзосом, имеющих одинаковую форму.

Формирование апоптозных «пузырьков» Формирование апоптозных «пузырьков»

Внеклеточные органоиды Экзосомы Микровезикулы (микропузырьки) Апоптозные «пузырьки» (тельца? ) Существует множество названий этих структур, Внеклеточные органоиды Экзосомы Микровезикулы (микропузырьки) Апоптозные «пузырьки» (тельца? ) Существует множество названий этих структур, в первую очередь – в зависимости от источника выделения (типа клеток, опухоли и т. д. ) Нет единой номенклатуры При анализе публикаций нужно в первую очередь основываться на механизме формирования структуры

Структуры, связанные с плазмалеммой Плазмалемма (плазматическая мембрана) Структуры, связанные с плазмалеммой Плазмалемма (плазматическая мембрана)

Гликокаликс образован углеводными частями молекул плазмалеммы Выявляется при соответствующей обработке, хотя есть всегда Гликолипиды Гликокаликс образован углеводными частями молекул плазмалеммы Выявляется при соответствующей обработке, хотя есть всегда Гликолипиды Гликопротеины Функции гликокаликса: - защита клеточной поверхности - межклеточные взаимодействия Гликокаликс заполняет пространство между клетками в тканях, соответственно, принимает участие во всех процессах на поверхности клеток. Лейкоциты и эндотелий – пример работы молекул гликокаликса.

гликокаликс Микроворсинки кишечника «Щёточная кайма» Около 1000 микроворсинок на одной клетке гликокаликс Микроворсинки кишечника «Щёточная кайма» Около 1000 микроворсинок на одной клетке

Внеклеточный матрикс слой молекул, тесно прилежащих к клетке в основном – белки и полисахариды Внеклеточный матрикс слой молекул, тесно прилежащих к клетке в основном – белки и полисахариды Интегрины – трансмембранные белки – обеспечивают взаимодействие клетки с внеклеточным матриксом Базальная мембрана – пример структурно организованного внеклеточного матрикса Матрикс рыхлой соединительной ткани Внеклеточный матрикс играет важную роль в нормальном функционировании тканей и органов

Базальная мембрана Базальная мембрана

Внеклеточный матрикс. Рыхлая соединительная ткань. Хрящ. Внеклеточный матрикс. Рыхлая соединительная ткань. Хрящ.

Оболочка бактериальной клетки Грам+ и грам- бактерии – в зависимости от способности окрашиваться по Оболочка бактериальной клетки Грам+ и грам- бактерии – в зависимости от способности окрашиваться по Граму

Клеточная стенка бактерий Капсула в световом микроскопе Пептидогликаны Линейные полисахариды + Пептидные мостики Локализуется Клеточная стенка бактерий Капсула в световом микроскопе Пептидогликаны Линейные полисахариды + Пептидные мостики Локализуется клеточная стенка на внешней поверхности мембраны. В основном образована углеводами, часто имеет вид рыхлой слизистой капсулы

Клеточная стенка клеток низших грибов Клеточная стенка есть у растений (целлюлоза), грибов (хитин) и Клеточная стенка клеток низших грибов Клеточная стенка есть у растений (целлюлоза), грибов (хитин) и бактерий (полисахариды). У животных нет клеточной стенки

Клеточная стенка низших грибов и кутикула нематоды Клеточная стенка низших грибов и кутикула нематоды