Лек 5 2014.ppt
- Количество слайдов: 43
Лекция 5 Система эндосом Экзосомы Структуры, связанные с плазматической мембраной
Эндоцитоз - интернализация клетками растворенных веществ и жидкости, макромолекул, компонентов плазмалеммы и всевозможных частиц путем формирования углубления плазмалеммы и отшнуровки мембранного пузырька. В клетках многоклеточных организмов эндоцитированный материал включает широкий спектр лиганд-рецепторных комплексов, жидкостей, липидов, мембранных белков, компонентов внеклеточного матрикса, «обломки» разрушенных клеток, бактерии, вирусы и многое другое. В «типичной» клетке млекопитающих путем эндоцитоза за час обновляется 50 -180% площади плазматической мембраны. Макрофаг интернализует ~ 30% своего объема за час, ~ 2/3 объема возвращается во внеклеточное пространство в течение 15 -20 минут. Лиганды, попадающие в клетку разными путями микроэндоцитоза, направляются в раннюю эндосому. ЭНДОСОМЫ осуществляют регуляцию различных процессов в клетке посредством «обработки» , сортировки, рециркуляции, активации, блокирования и деструкции захваченных веществ и рецепторов.
Ранняя эндосома – первая «станция» на пути потока эндоцитируемого материала и базовое звено системы эндосом Ранняя эндосома Лизосома о Рециркулирующая эндосома о о оо Поздняя (секреторная) эндосома Мультивезикулярное тельце о о оо Поздняя эндосома (мультивезикулярное тельце)
Рециркулирующая эндосома Ранняя эндосома Аппарат Гольджи Лизосома
Ранние эндосомы Везикулярная часть ранней эндосомы ( «тело» , мультивезикулярная часть (до 1 мкм в диаметре) и тубулярная часть (трубочки, около 60 нм в диаметре) Главная функция ранних эндосом: сортировка интернализованных молекул, происходит в течение 3 – 5 мин после интернализации эндоцитозного пузырька. «Тело» ранней эндосомы вовлечено в сортировку молекул для деградации Тубулярные элементы обеспечивают сортировку белков для рециркуляции В ранней эндосоме нет гидролаз!!! Многие вирусы «раздеваются» в ранней эндосоме, попав в клетку путем микроэндоцитоза
Ранние эндосомы Атитела к Rab 5 Иммуно-флуоресценция Ранние эндосомы Клетка культуры He. La. Метка: фактор роста эпидермиса и трансферрин. 5 мин. инкубации. Маркеры ранних эндосом: Early Endosome Associated Protein (EEA-1) - Rabaptin-5 - Rabaptin-4 р. Н = около 6 (6, 3 -6, 5)
Рециркулирующие эндосомы Система эндосом динамична, потоки мембран движутся в разных направлениях, трансформируются части ранней эндосомы, превращаясь в рециркулирующие и поздние эндосомы. Формирование рециркулирующих эндосом связано с накоплением в тубулярной части ранней эндосомы белков, предназначенных для возврата в плазмалемму. Рециркулирующие эндосомы представлены в основном тубулярными структурами диаметром около 60 нм, которые контактируют между собой и «общаются» с ранними эндосомами и аппаратом Гольджи посредством пузырькового транспорта. Маркер рециркулирующих эндосом - Rabaptin-11 Рециркулирующие эндосомы обеспечивают сортировку и эндоцитированного, и синтезированного в клетке материала, что особенно важно для поляризованных клеток (эпителий), в которых очень велика разница между белковым составом апикальной и базолатеральной плазмалеммы
Накопление пероксидазы хрена в рециркулирующих эндосомах р. Н в рециркулирующих эндосомах возрастает до 6, 5
Варианты рециркуляции: - молекулы возвращаются в ту же часть плазмалеммы, откуда были эндоцитированы, - молекулы направляются в другую часть плазмалеммы (базо-латеральная сортировка) Апикальная часть клетки кишечника сосунка крысы. В полость кишечника была введена соль лантана при фиксации. Лантан выявил развитую тубулярную систему и визуализировал взаимосвязь её элементов
Система эндосом ( «эндолизосомальная система» ) включает в себя взаимосвязанные мембранные органеллы: - эндоцитозные пузырьки - ранние эндосомы - рециркулирующие эндосомы - поздние эндосомы (МВТ) - лизосомы Ранняя эндосома Лизосома о Рециркулирующая эндосома о о оо Поздняя (секреторная) эндосома Мультивезикулярное тельце о о оо Поздняя эндосома (мультивезикулярное тельце)
Трансформация ранних эндосом в «разрушающие» МВТ происходит постепенно, по мере накопления в полости эндосом кислых гидролаз, которые доставляются из аппарата Гольджи посредством «опушенных» (клатриновых) пузырьков. Ретроградный транспорт из эндосом в аппарат Гольджи обеспечивает возврат мембран и рецептора маннозо-6 -фосфата в аппарат Гольджи. Ретроградный транспорт необходим для «нормальной» жизни клетки. В мембране МВТ есть специальные молекулярные структуры, обеспечивающие формирование пузырьков, направляющихся обратно в АГ. Топология этих пузырьков аналогична эндоцитозу – внутрь цитоплазмы. Формирование пузырьков этого типа обеспечивается клатрином.
Мультивезикулярные тельца (поздние эндосомы) Размеры МВТ – до 1 мкм, обычно – около 500 нм Везикулы (пузырьки) имеют размер 40 -100 нм Пузырьки называют “intralumenal vesicles” ( «пузырьки в просвете» ).
Образование внутренних пузырьков в МВТ Деформация мембраны происходит в противоположном эндоцитозу направлении – «из цитоплазмы»
Деформацию мембраны и отщепление пузырька обеспечивает молекулярный комплекс в мембране ранних эндосом – «Сортировочный комплекс эндосом, необходимый для транспорта» ESCRT (endosomal sorting complex required for transport) Состоит из 4 молекулярных комплексов (0–III), которые взаимодействуют между собой и с молекулами цитоплазмы, в том числе - с убиквитином. Формирование внутреннего пузырька МВТ требует деформации и разделения мембран. Топология этого процесса «противоположна» эндоцитозу, когда пузырек поступает внутрь клетки. Сортировочный комплекс ESCRT также участвует в финальных стадиях разделения мембран при расхождении делящихся клеток, почковании вирусов. Механизм формирования пузырьков окончательно не установлен.
Модели отшнуровки внутреннего пузырька МВТ Сортировочный комплекс ESCRT играет важную роль в системе деградации немембранных белков клетки: он обеспечивает их поступление в полость МВТ при формировании внутренних пузырьков, а МВТ, в свою очередь, либо сливаются с лизосомой, где происходит деградация молекул, либо сами превращаются в лизосому.
Мультивезикулярные тельца, экзосомы Электронно-микроскопическая томография
«Разрушающие» МВТ К. Г-зы наиболее удаленная транс-цистерна аппарата Гольджи, «клатриновые» пузырьки Рецептор маннозо-6 -фосфата К. Г-зы р. Н 5, 0 – 6, 0 р. Н=5, 9 -6 Ранняя эндосома Кислые гидролазы Поздняя эндосома ( «разрушающее» МВТ)
Поздняя эндосома (МВТ) Комплекс Гольджи Рецептор маннозо-6 -фосфата К. Г-зы Разрушение белков и липидов Маркеры поздних эндосом: 1. Rabaptin-7 и Rabaptin-9 2. Lysobisphosphatidic acid (LBPA) 3. MPR+ Рецептор маннозо-6 -фосфата В поздней эндосоме присутствуют специфичные мембранные белки - Residual heavily glycosylated lysosomal associated membrane proteins (LAMPs). Их углеводные части защищают мембрану от действия гидролаз.
Функции поздней эндосомы исчерпываются, когда она возвращает все рецепторы маннозо-6 -фосфата в АГ Возврат всех рецепторов М-6 -Ф в АГ – сигнал о превращении поздней эндосомы в лизосому. Поздняя эндосома лизосома К. Г-зы Лизосомы – конечная стадия эндоцитоза и фагоцитоза, место деградации захваченных клеткой молекул, и предназначенных для деградации молекул цитоплазмы, поступивших в МВТ при формировании внутренних пузырьков
Лизосомы и поздние эндосомы (лизосомы? ) Культура клеток MDCK Связывание с убиквитином – главный сигнал о направлении молекулы белка на деградацию!
Raft-depended endocytosis
«Секретирующие» мультивезикулярные тельца ЭКЗОСОМЫ Пузырьки (везикулы) Д = 40 -100 нм Секретируются всеми изученными клетками in vitro Присутствуют во всех клетках in vivo Выявлены в биологических жидкостях (кровь, слюна, молоко и др. ) Функции точно не установлены, но есть много данных об участии во всевозможных регуляторных и транспортных механизмах
Выделение пузырьков из МВТ, сливающихся с плазмалеммой (экзоцитоз), было описано впервые в 1983 г. Термин «экзосомы» был предложен в 1987 г. Экзосомы осаждаются при 100 000 g Имеют плавучую плотность в градиенте сахарозы 1. 10– 1. 21 g/m. L Три основных метода выделения экзосом: ультрацентрифугирование, ультрафильтрация и иммунопреципитация с использованием антител, связанных с магнитными шариками. На 2010 г. : в разных экзосомах обнаружено 143 вида биологически активных молекул, включая микро. РНК и м. РНК Экзосомы имеют уникальный механизм адресной доставки молекул Расшифровка этого механизма – одна из приоритетных задач современной науки
Выделение экзосом опухолевой клеткой Экзосомы. Негативное контрастирование
Экзосомы в препаратах плазмы человека (ГКБ ИХБФМ СО РАН) 200 nm 200 nm 100 nm 200 nm Экзосомы, полученные на культуре клеток Hep. G-2 (ЛБНК ИХБФМ СО РАН) 200 nm
Слияние МВТ с плазмалеммой, выделение экзосом во внеклеточное пространство
Внеклеточные органеллы 1. Экзосомы 2. «Сбрасываемые» микропузырьки (shedding microvesicles) – размером 100 - 1000 нм, полиморфны «Отпочковываются» от клетки 3. Апоптозные пузырьки (apoptotic blebs) - 50 -500 нм. Являются «останками» гибнущих путем апоптоза клеток
Формирование микропузырьков Микропузырьки, выделенные из мочи здорового донора (А, В) и больного раком простаты (С, Д). Микропузырьки полиморфны, размером более 100 нм (до 1 мкм) Образуются путем «почкования» на поверхности клеток Обнаружены во всех исследованных биологических жидкостях
Апоптозные «пузырьки» (апоптозные тельца? ) формируются на плазматической мембране клеток, претерпевающих апоптоз. Фактически – это «останки» конденсированных разрушающихся клеток. В процессе апоптоза образуются и микропузырьки, но на его ранних стадиях. Апоптозные «пузырьки» (50 -500 нм) формируются на поздних стадиях апоптоза. Апоптозные «пузырьки» гетерогенны по размерам и форме, в отличие от экзосом, имеющих одинаковую форму.
Формирование апоптозных «пузырьков»
Внеклеточные органоиды Экзосомы Микровезикулы (микропузырьки) Апоптозные «пузырьки» (тельца? ) Существует множество названий этих структур, в первую очередь – в зависимости от источника выделения (типа клеток, опухоли и т. д. ) Нет единой номенклатуры При анализе публикаций нужно в первую очередь основываться на механизме формирования структуры
Структуры, связанные с плазмалеммой Плазмалемма (плазматическая мембрана)
Гликокаликс образован углеводными частями молекул плазмалеммы Выявляется при соответствующей обработке, хотя есть всегда Гликолипиды Гликопротеины Функции гликокаликса: - защита клеточной поверхности - межклеточные взаимодействия Гликокаликс заполняет пространство между клетками в тканях, соответственно, принимает участие во всех процессах на поверхности клеток. Лейкоциты и эндотелий – пример работы молекул гликокаликса.
гликокаликс Микроворсинки кишечника «Щёточная кайма» Около 1000 микроворсинок на одной клетке
Внеклеточный матрикс слой молекул, тесно прилежащих к клетке в основном – белки и полисахариды Интегрины – трансмембранные белки – обеспечивают взаимодействие клетки с внеклеточным матриксом Базальная мембрана – пример структурно организованного внеклеточного матрикса Матрикс рыхлой соединительной ткани Внеклеточный матрикс играет важную роль в нормальном функционировании тканей и органов
Базальная мембрана
Внеклеточный матрикс. Рыхлая соединительная ткань. Хрящ.
Оболочка бактериальной клетки Грам+ и грам- бактерии – в зависимости от способности окрашиваться по Граму
Клеточная стенка бактерий Капсула в световом микроскопе Пептидогликаны Линейные полисахариды + Пептидные мостики Локализуется клеточная стенка на внешней поверхности мембраны. В основном образована углеводами, часто имеет вид рыхлой слизистой капсулы
Клеточная стенка клеток низших грибов Клеточная стенка есть у растений (целлюлоза), грибов (хитин) и бактерий (полисахариды). У животных нет клеточной стенки
Клеточная стенка низших грибов и кутикула нематоды