Скачать презентацию Лекция 5 Репликация у эукариот Геном S c Скачать презентацию Лекция 5 Репликация у эукариот Геном S c

Lection 5.ppt

  • Количество слайдов: 37

Лекция 5. Репликация у эукариот Геном S. c. 1. 5 x 107 bp человека Лекция 5. Репликация у эукариот Геном S. c. 1. 5 x 107 bp человека 3. 3 х109 bp средняя хр. 1. 5 х108 bp Скорость 50 -100 bp/сек Sчеловека 8 час S дрожжи 20 мин Saccharomyces cerevisiae Полирепликонная организация хромосом

1. ori активируются группами по 20 -80 сайтов (репликационная единица). 2. В S-фазе ori 1. ori активируются группами по 20 -80 сайтов (репликационная единица). 2. В S-фазе ori активируются в определенном порядке. 3. Внутри репликационной единицы у человека ori располагаются на расстоянии 30 000 – 300 000 bp (на одну петлю хроматина приходится 1 ori). 4. Пара вилок репликации (двунаправленная, скорость движения разная). 5. Остановка происходит при встрече с противоположно-двигающейся вилкой или при достижении конца хромосомы.

ori – ARS (autonomously replicating sequence) у S. cerevisiae открыты в 1980 г. Р. ori – ARS (autonomously replicating sequence) у S. cerevisiae открыты в 1980 г. Р. Дэйвисом и Дж. Карбоном

Структура ARS У S. cerevisiae ~ 400 ARS 1 ARS / 40 000 bp Структура ARS У S. cerevisiae ~ 400 ARS 1 ARS / 40 000 bp ARS 100 -200 bp Consensus (элемент А) 5’ – A/T TTTAT A/G TTT A/T – 3’ (11 нуклеотидов) Состоит из двух коровых элементов (А и ВI) – сайт связывания с ORC. DUE (DNA unwinding element) содержит охарактеризованный участок ВII, АТ-богатый, место расплетания ДНК. Некоторые ori имеют домен BIII, сайт связывания с транскрипционным фактором Abf 1 (ARS-binding factor 1) и ВIV, функция которого неизвестна. Некоторые ARS имеют левее А стимулирующий домен С, сайт связывания транскрипционного фактора Rap 1. Характерные элементы эукаритических ori: - ДНК-расплетающие элементы; - участки прикрепления к ядерному матриксу; - канонические последовательности, взаимодействующие с белками репликативного комплекса; - АТ-богатые последовательности; - участки изгибов ДНК. У высших эукариот ori и ARS плохо изучены. По-видимому, существует много потенциальных оri, но эффект положения нуклеосомы, структуры ДНК более высокого порядка и локализация хромосомы в ядре супрессируют инициацию с большинства ori, и обеспечивают инициацию только в специальных сайтах, которые и служат ori-репликации. Обнаружены протяженные коровые последовательности (2. 6 тпн) фланкированные факультативными последовательностями, необходимые для функционирования ori (Aladjem et al. , 1998).

Инициация репликации у дрожжей ARS – служит местом связывания с комплексом ORC (origin recognition Инициация репликации у дрожжей ARS – служит местом связывания с комплексом ORC (origin recognition complex). ORC остается связанным с ori на протяжении всего клеточного цикла и служит кором для связывания других факторов. ORC взаимодействует с одной из нитей ДНК, для этого необходимы все субъединицы кроме Orc 6. ORC взаимодействует с белком Cdc 6 p, синтезируемым в конце М и обеспечивающим вместе с белком Tah 11 p (Cdt 1) загрузку Mcm/P 1 (minichromosome maintenance) – белков, которые делают ori готовыми к активации, обладают геликазной активностью. Этот ДНК-белковый комплекс называется пререпликативным (pre-RC). С этим комплексом на ранних ori в G 1 ассоциируют также белки Sld 3 и Cdc 45. Для активации необходимы две киназы - Cdc 28/Clb (CDK) и Cdc 7/Dbf 4 (DDK), которые обеспечивают загрузку многих репликативных белков в том числе GINS и ДНКполимеразы на pre-RC. Впоследствии образуется активная ДНК–геликаза, Cdc 45 -Mcm. GINS (CMG), ДНК раскручивается и образуется репликативная вилка, подготовленная для синтеза ДНК. Cdc 6 р заменяется на Cdc 45 p образуется преинициирующий (pre-IC) комплекс. Cdc 6 р остается на ori, а Cdc 45 двигается вместе с репликативной вилкой. Для загрузки Cdc 45 на хроматин необходима киназа Cdc 28, а для удерживания на хроматине киназа Cdc 7. Процесс репликации активируется перед началом S-фазы в результате связывания с белком активатором Cdc 7/Dbf 4. Cdc 7 -киназный комплекс доставляется к ori посредством взаимодействия Dbf 4 с ori, где, по-видимому, фосфорилирует участников пререпликативного комплекса Mcm, обеспечивая его взаимодействие с другими репликативными белками, например Cdc 45. Cdc 7 p взаимодействует также с Orc 2 p. Cdc 28/Clb привлекается к ori белком Cdc 45, где фосфорилирует участников репликации, например, Sld 2 и Sld 3, которые связываются с белком Dpb 11, а также гистон Н 1, что приводит к деконденсации хроматина.

Модель сборки белков в ori перед инициацией репликации ДНК (а) Белок Cdc 6 (ATPаза) Модель сборки белков в ori перед инициацией репликации ДНК (а) Белок Cdc 6 (ATPаза) образует комплекс с нуклеотидом АТР (b) Комплекс Cdc 6 -ATP ассоциирует с ДНК-связанным ORC комплексом. (с) АТРазная активность хроматин-связанного белка Cdc 6 необходима для сборки МСМ/Р 1 белков (М) в сайте начала репликации. (d) После активации киназой Cdk в поздней G 1 белок Cdc 45 ассоциирует с ori. Это событие может сопровождаться удалением или деградацией Cdc 6 имеет два мотива “Walker box”, классические сайты связывания ATP/GTP. Сdс6 в качестве АТР-азы гидролизует эти нуклеотиды. Комплекс Cdc 6 -ATP необходим для ассоциации с ORC, а гидролиз существен для последующей загрузки геликазы Mcm/P 1.

Образование pre-LC Для активации репликации ДНК отдельно образуется комплекс – pre-LC (preloading complex) – Образование pre-LC Для активации репликации ДНК отдельно образуется комплекс – pre-LC (preloading complex) – состоящий из ДНК-полимеразы ε, GINS (Sld 5 р-Psf 1 р-Psf 2 р-Psf 3 р), Sld 2 р, и Dpb 11 р. GINS (named for Go, Ichi, Nii, and San for five, one, two, and three in Japanese) образует кольцевую структуру. Electron micrographs of the GINS complex

Репликация хромосомной ДНК у дрожжей Pre-LC комплекс начинает образовываться до посадки на ori и Репликация хромосомной ДНК у дрожжей Pre-LC комплекс начинает образовываться до посадки на ori и связывания с pre-RC. Polε образует нестабильный коротко-живущий комплекс с GINS. Cdc 28 фосфорилирует Sld 2 p и Sld 3 p, которые затем связываются с Dpb 11 p. Dpb 11 р-Sld 2 р связываются с C-концом Polε, связанной с GINS. Образуется комплекс Sld 2 р - Dpb 11 р - GINS - Pol ε (pre-LC). Фосфорилированный белок Sld 3 ассоциирован с ARS и киназой Cdc 7/Dbf 4; Sld 3 p связан с Cdc 45 p, локализованным в ARS. Взаимодействие фосфорилированного Sld 3 с Dpb 11 обеспечивает посадку pre-LC на pre-RC. Белок-белковые взаимодействия между субъединицами комплексов pre-RC, GINS и Polε стабилизируют комплексы pre-LC и pre-RC на ori. Продемонстрировано взаимодействия: Psf 1 (GINS) - Sld 3, Sld 3 - Mcm (pre-RC), Dpb 2 (Polε) – Orc 1 -Orc 2 (ORC). Роль pre-LC – доставка комплекса GINS к pre-RC и образование комплекса CMG (Cdc 45 -Mcm-GINS). После того как репликация инициируется происходит диссоциация CMG, Dpb 1, Sld 2, Sld 3 в ori и CMG двигается как компонент репликативной вилки. Cdt 1 и Cdc 6 на стадиях загрузки Mcm (ii, iii) и RFC, PCNA и RPA на стадиях раскручивания ori ДНК (vi) и запуска полимеразы (vii and viii) не отображены на рисунке.

Инициация репликации хромосом у дрожжей Геликаза MCM 2– 7 доставляется к origins в процессе Инициация репликации хромосом у дрожжей Геликаза MCM 2– 7 доставляется к origins в процессе фазы G 1 клеточного цикла и нагружается вокруг двунитевой ДНК белками Cdc 6 и Сdt 1 рядом с ORC. Изучение реакции загрузки в условиях in vitro показало, что геликаза МСМ 2 -7 загружается в виде двойного гексамера, в отличие от единичного гексамера обнаруживаемого в растворе, и многочисленные двойные гексамеры загружаются, вероятно, на каждый ori. В результате образуется prereplicative complex (pre-RC) в origins, аналогичный этап у Xenopus соответствует “licensing reaction. ” Белок Sld 3 доставляется в слабо связанном виде вместе с Cdc 45 на самые ранние origins у дрожжей, возможно посредством прямого взаимодействия с комплексом MCM 2– 7. Геликаза MCM 2– 7 остается инактивированной до тех пор, пока клетка не вступит в фазу S и активируется киназами DDK и CDK. Киназа Cdc 7 фосфорилирует N-концевые хвосты Mcm 2/4/6 и вероятно индуцирует структурные изменения в комплексе MCM 2– 7. Повидимому, киназа СDK также фосфорилирует MCM 2– 7, но ее главными мишенями служат Sld 2 и Sld 3, фосфорилированные формы которых связываются с Dpb 11 (N-концевая пара BRCTповторов белка Dpb 11 связывается с Sld 3, в то время как Cконцевая пара BRCT-повторов связывается с Sld 2), позволяя рекрутировать GINS и ДНК-полимеразу к origins. Это приводит к стабильной ассоциации CMG и различных факторов (для простоты не показаны на рис. ) и образованию RPC. Активация геликазы MCM 2– 7 приводит к раскручиванию origin и позволяет ДНК-полимеразе α синтезировать праймеры на ведущей и запаздывающей нитях. ДНК-полимераза ε продолжает синтез лидирующей нити в каждой репликативной вилке, а ДНКполимераза δ продолжает синтезировать каждый фрагмент Оказаки на запаздывающей нити. Аналогичные события происходят и на поздних origins, к которым различные факторы инициации, включая Sld 3 и Sld 2, рекрутируются, но в строго определенное время для каждого origin. (Labib K. Genes Dev. 2010. 24: 1208 -19)

Инициация репликации на поздних ori Инициация репликации ДНК происходит с левого ori, затем запускаются Инициация репликации на поздних ori Инициация репликации ДНК происходит с левого ori, затем запускаются ori, расположенные правее. Комплекс Sld 3–Cdc 45 вначале ассоциирован с Ori 1. pre-LC загружает GINS на origins и таким образом запускается репликации ДНК. По мере раскрывания ori, Sld 3 отсоединяется от Cdc 45 и удаляется из origins. Свободный Sld 3 образует комплекс с новым белком Cdc 45 и затем ассоциирует со следующим Ori 2.

Регуляция репликации в результате химической модификации белков (фосфорилирование) Белковый комплекс Субъединицы, фосфо- Функция рилируемые Регуляция репликации в результате химической модификации белков (фосфорилирование) Белковый комплекс Субъединицы, фосфо- Функция рилируемые киназой ORC 6 cубъединиц Orc 1, 2, 6 – Cdc 28 Сdс6 58 k. D Cdc 28 Tah 11 Сdc 28/Clb Cdc 45 Cdc 7 Dbf 4 Mcm 68 k. D RPA RFC PCNA Polα-праймаза 70, 32, 14 k. D 110, 42, 41, 37 k. D 36 k. D 180, 86, 58, 48 k. D Sld 2 Sld 3 Pol 32 Rad 30 52 k. D 77 k. D 40 k. D 71, 5 k. D 74 k. D 58 k. D 81 k. D 5 субъединиц Cdc 28, Cdc 7 Cdc 28 Mcm 2, 3, 4, 6, 7 - Сdc 7, Mcm 2, 3, 4, 6 – Cdc 28 Rfa 2 – Mec 1, Tel 1 Гиперфосфорилирование после Star, ингибирование реинициации Полиубиквитинирование и деградация, ингибирование реинициации Активация репликации Загрузка и удерживание на ДНК Активация репликации; удаление из ядра, ингибирование реинициации Pol 1, p 86 – Cdc 28/Clb, Ингибирует рекрутирование к pre-RC p 180 – Cdc 7/Dbf 4 Образование pre-RC Cdc 28 Образование рre-RC Cdc 28

Модель функционального взаимодействия Mrc 1/Pol 2(ε) на лидирующей нити (A) Взаимодействие в процессе репликации Модель функционального взаимодействия Mrc 1/Pol 2(ε) на лидирующей нити (A) Взаимодействие в процессе репликации ДНК в нормальных условиях. (B) Взаимодействие Mrc 1/Pol 2 на лидирующей нити при репликативном стрессе. Pol ε/Mrc 1 чувствуют повреждение, фосфорилирование Mrc 1 приводит к высвобождению N-конца, но взаимодействие между Mrc 1 -P и C-концом Pol 2 сохраняется. Lou et al. , 2008

ДНК-полимеразы эукариот ДНК-pol Дополнительная активность α ДНК-праймаза β γ δ d. Rp-лиаза 3’-5’ экзонуклеаза ДНК-полимеразы эукариот ДНК-pol Дополнительная активность α ДНК-праймаза β γ δ d. Rp-лиаза 3’-5’ экзонуклеаза ε 3’-5’ экзонуклеаза ξ ζ Rev 1 3’-5’ экзонуклеаза Субъединица (к. Да) Локализация, функция 165 -180* 68 -70 48 -50* 55 -60 38 -68* 125 -140* 35 -50 125 -130* 48 -55 40 Ядро, репликация (инициация ori и фрагменты Оказаки) Транспорт полимеразы в ядро Праймаза Присоединение к полимразе, связывание d. NTP Ядро, репарация (эксцизионная, рекомбинационная) Митохондрии, репликация и репарация 230 -261* Ядро, репликация (элонгация лидирующей нити); Слабо зависит от PCNA, RPC, RPA 78 23 22 173* 29 173 29 112. 2 Ядро, репликация (элонгация запаздывающей нити); Связывание с PCNA Мутагенез, синтез ДНК на поврежденной матрице Мутаген. синтез ДНК через Т-Т cis-syn циклобутан. димер Вставляет d. CMP напротив повреждения * - каталитическая активность, d. Rp (дезоксирибофосфатлиазная)- или АР-лиазная активность – вырезание 5’-концевых апуриновых/апиримидиновых остатков (АР-сайты) в ходе репарации ДНК

GINS GINS

Только в 2005 -2008 годах было показано, что на лидирующей нити работает Polε, а Только в 2005 -2008 годах было показано, что на лидирующей нити работает Polε, а на запаздывающей Polδ (Garg, Burgers, 2005; Pursell et al. , 2007; Mc. Elhinny et al. , 2008) GINS Polε Polδ PCNA У Polα отсутствует экзонуклеазная активность. Polα синтезирует 5 н из ~250 н фрагмента Оказаки, т. о. она синтезирует 1% генома человека. Поскольку частота ошибочного включения оснований для Polα составляет 10 -4, то она будет генерировать 6000 мисмачей в процессе каждого цикла репликации. Показано, что Polδ выполняет корректорскую функцию для Polα (Pavlov et al. , 2006). Физически взаимодействуют субъединицы Polα (Pol 1) и Polδ (Pol 32).

Элонгация репликации В присутствии активных киназ Mcm-белки могут открывать ori-последовательности и облегчать загрузку белка Элонгация репликации В присутствии активных киназ Mcm-белки могут открывать ori-последовательности и облегчать загрузку белка RPA (replication protein A). Белок RPA (аналог ssb) гетеротример с субъединицами 70, 32 -34 и 11 -14 к. ДА, стимулирует полимеразную активность и увеличивает процессивность ДНК-polα, а также стимулирует мобилизацию ДНК-праймазы. ДНК-polα в комплексе с ДНК-праймазой называется ДНК-репликаза или ДНК-cинтетаза. Домены связывания с ДНК локализованы в двух субъединицах – Rfa 1 и Rfa 2. ДНК-polα + ДНК-праймаза = репликаза

Комплекс ДНК-polα-ДНК-праймаза осуществляет синтез РНК-затравки. На богатых пиримидином участках матрицы праймаза синтезирует РНК-затравки длиной Комплекс ДНК-polα-ДНК-праймаза осуществляет синтез РНК-затравки. На богатых пиримидином участках матрицы праймаза синтезирует РНК-затравки длиной ~ 8 -12 н, которые затем элонгируются ДНК-polα без диссоциации комплекса от матрицы (~20 н). При связывании с праймер-матричным комплексом ДНК-polα закрывает участок праймера (9 н), дуплексный участок матрицы (13 н) и однонитевой участок матрицы (14 н). ДНК-polα добавляет к РНК несколько нуклеотидов (~20 н). Fe-S-домен ДНК-праймазы дрожжей, PDB: 3 LGB

Затравка – РНК-праймер+несколько нукл. (~30 н) Фрагмент Оказаки ~ 150 н Основные ДНК-полимеразы – Затравка – РНК-праймер+несколько нукл. (~30 н) Фрагмент Оказаки ~ 150 н Основные ДНК-полимеразы – pol δ и ε PCNA (proliferating cell nuclear antigen) служит скрепкой для pol δ, увеличивая его процессивность (аналог β-субъединицы Pol III E. coli). PCNA загружается на ДНК с помощью белков RFC (replication factor C), 5 субъединиц, аналог γ– субъединицы Pol III E. coli. Холофермент ДНК-polδ собирается на праймер-матричном комплексе в следующем порядке: - сначала RFC cвязывается с 3’-ОН-концом затравки на он. ДНК-матрице, «покрытой» белком RPA, - затем RFC в присутствии АТР формирует на ДНК-дуплексе, прилегающем к 3’-концу затравки, кольцевую структуру из 3 -х молекул PCNA, - PCNA обеспечивает присоединение ДНК-polδ к 3’-концу затравки. Полимераза осуществляет синтез фрагмента Оказаки (~150 н) вплоть до встречи с предыдущим фрагментом Оказаки. Поскольку праймер синтезируется с ошибками, он полностью удаляется в процессе замещающего синтеза DNA-polδ. - Образуется болтающийся хвост (flap) ДНК-РНК-праймер предыдущего фрагмента, который удаляется комбинированным действием 5’-3’-экзонуклеазы FEN 1 (MF 1) и РНКазы. Н 1. - ДНК-лигаза I соединяет фрагменты запаздывающей нити. Удаление хвоста праймера и сшивание фрагментов называется процессингом фрагмента Оказаки.

Модель взаимодействия RPA/Dna 2 в процессинге фрагмента Оказаки Замещение нити в процессе синтеза Рol Модель взаимодействия RPA/Dna 2 в процессинге фрагмента Оказаки Замещение нити в процессе синтеза Рol δ создает промежуточный продукт в виде болтающегося хвоста, который удлиняется и может образовывать вторичные структуры ДНК. Эти структуры ингибируют расщепляющую активность нуклеаз Dna 2 или FEN 1. RPA использует свою способность плавить нити для удаления таких структур и связывает болтающийся хвост, когда он достигнет размеров ~20 н. Затем Dna 2 удаляет с хвоста RPA и отщепляет хвост. И наконец оставшийся хвост ~ 5 н свободный от RPA удаляется нуклеазой FEN 1, создавая ник для последующего лигирования ДНК-лигазой 1 (Stewart et al. , 2008).

PCNA, S. cerevisiae: 3 GPM PCNA (гомотример) в форме «бублика» с отверстием для дн. PCNA, S. cerevisiae: 3 GPM PCNA (гомотример) в форме «бублика» с отверстием для дн. ДНК в центральной части является «скользящей по ДНК скрепкой» (sliding clamp), удерживающей ДНК-polδ в ходе полимеризации на матрице и обеспечивая высоко-процессивный синтез ДНК (увеличивая процессивность в 100 раз). Химические модификации PCNA (Lys 164): - cвязывание с убиквитином (Ubi 4 p – 381 aa, 42. 8 k. D); - cвязывание с SUMO (Smt 3 p – 101 aa, 11, 6 k. D). Контролируют: -моноубиквитинирование белками Rad 6/Rad 18 ошибочную репарацию (TLS) Polθ (RAD 30) и Polζ (REV 3, REV 7); - полиубиквитинирование белками Rad 5, Mms 2/ Ubc 13 инициирует безошибочную пост-репликативную репарацию; - сумойлирование (sumoylation) белками Ubc 9, Siz 1 ингибирует убиквитинирование, рекрутирует геликазу Hpr 5 для предотвращения гомологичной репарации. PCNAU: 3 LOW При повреждении ДНК репликативные полимеразы замещаются на неклассические полимеразы. Для этого необходим PCNA и его убиквитинизация. Приведена кристаллическая решетка убиквитинированного PCNA. Убиквитин локализован на внешней стороне PCNA и взаимодействует с ним за счет гидрофобных взаимодействий, при этом структура PCNA не изменяется. Предполагается, что взаимодействие с неканоническими полимеразами происходит за счет образования новой связывающей поверхности.

Схема главных компонентов репликативной вилки у эукариот GINS ε Праймаза синтезирует короткий РНК-праймер, а Схема главных компонентов репликативной вилки у эукариот GINS ε Праймаза синтезирует короткий РНК-праймер, а Polα добавляет несколько нуклеотидов. Комплекс Polα-праймаза вытесняется комплексом PCNA-Polδ, синтезируется фрагмент Оказаки (~ 150 н). РНК-ДНК-праймер удаляется комбинированным действием нуклеаз – Dna 2, FEN 1 и RNase. H 1. Фрагменты сшиваются ДНК-лигазой 1.

ДНК-полимеразы дрожжей Saccharomyces cerevisiae ДНК-полимеразы дрожжей Saccharomyces cerevisiae

Polα: POL 1 – 167 POL 12 – 79 PRI 2 - 62 PRI Polα: POL 1 – 167 POL 12 – 79 PRI 2 - 62 PRI 1 - 48 Polε: POL 2 – 256 DPB 2 – 78 DPB 3 – 23 DPB 4 – 22 Polδ: POL 3 - 125 POL 31 - 55 POL 32 - 40 PCNA: POL 30 – 28, 9 RPA: RFA 1 – 70, 3 RFA 2 – 29, 9 RFA 3 – 13, 8

Некоторые белки, необходимые для репликации E. coli эукариоты функция Dna. A Гираза Dna. B Некоторые белки, необходимые для репликации E. coli эукариоты функция Dna. A Гираза Dna. B Dna. C ssb γ-комплекс pol. III core β-субъединица праймаза ДНК-лигаза pol. I RNase. H 1 ORC белки Топоизомеразы I/II Mcm Cdc 6 RPA RFC Polε/δ PCNA Праймаза Polα ДНК-лигаза 1 FEN-1 (=MF 1) RNase. H 1 Узнают ori Снимают позит. сверхвитки перед репликативной вилкой ДНК-геликаза, расплетает дуплекс Нагружает геликазу на ДНК Поддерживают ДНК в однонитевом состоянии Субъединица ДНК-pol, нагружает скрепку на ДНК Репликативный фермент, синтез лидир. нити и фраг. Оказаки Кольцевая субъед. ДНК-pol, сцепляет фермент и ДНК Синтезирует РНК-праймер Синтезирует короткие фрагменты ДНК, как часть праймера Сшивает фрагменты Оказаки в непрерывную нить Удаляет РНК-праймеры Второй механизм удаления РНК-праймера

Кристаллические структуры белковых комплексов 1 YNX: ДНК-связывающий домен с фрагментом он. ДНК S. cerevisiae Кристаллические структуры белковых комплексов 1 YNX: ДНК-связывающий домен с фрагментом он. ДНК S. cerevisiae и human Rpa 70 p 1 SXJ: кристаллическая структура эукариотического clamp loader (RFC) связанного с DNA sliding clamp (PCNA) S. cerevisiae RFC – гетеромер (95, 37, 40, 41, 40 k. Da) PCNA – гомотример (28. 9 k. Da)

ДНК-полимераза δ CTD Pol 3 Polα N-ter Pol 31 C-ter Pol 32 PCNA 3 ДНК-полимераза δ CTD Pol 3 Polα N-ter Pol 31 C-ter Pol 32 PCNA 3 IAY: каталитическая субъединица ДНК-полимеразы δ дрожжей, праймер и нуклеотид

ДНК-полимераза ζ 3 MFH: ДНК-полимераза ζ на неповрежденной ДНК 3 MFI: ДНК-полимераза ζ с ДНК-полимераза ζ 3 MFH: ДНК-полимераза ζ на неповрежденной ДНК 3 MFI: ДНК-полимераза ζ с cis-syn T-T димером

Терминация репликации Продвижение репликативной вилки прекращается только при столкновении с другой репликативной вилкой, движущейся Терминация репликации Продвижение репликативной вилки прекращается только при столкновении с другой репликативной вилкой, движущейся в противоположном направлении, или по достижении конца хромосомы. Размер реликона - 30 -300 тпн.

Клеточный цикл Клеточный цикл

Циклин зависимая киназа CDC 28 дрожжей Циклин зависимая киназа CDC 28 дрожжей

Предотвращение реинициации репликации ДНК в G 2 и М (Nguyen et al. , Nature. Предотвращение реинициации репликации ДНК в G 2 и М (Nguyen et al. , Nature. 2001. 411: 1068 -1073) Инициацию репликации можно разбить на две стадии: сборка пререпликативного комплекса (pre-RC) и запуск синтеза ДНК. Сборка pre-RC осуществляется вскоре после митоза и делает ori компетентными к инициации синтеза ДНК. В процессе сборки к комплексу ORC, который связан с ori на протяжении всего клеточного цикла, дополнительно присоединияются инициирующие белки, включая Cdc 6 и комплекс Mcm 2 -7. При прохождении через G 1 в контрольной точке Start активируются киназы Cdc 7/Dbf 4 и Cdc 28/Clb, которые запускают репликацию ori, сборку репликационной машины в репликативной вилке, инициируют синтез дочерней нити и разрушение pre-RC. Кроме запуска инициации репликации, Cdc 28/Clb предотвращает реинициацию, блокируя новую сборку pre-RC. Этот блок сохраняется до тех пор пока киназа не инактивируется в конце митоза. Тем самым обеспечивается инициация ori только один раз за клеточный цикл. При этом используется 3 механизма: 1) Cdc 28/Clb снижает уровень Cdc 6, фосфорилируя Cdc 6 и облегчая его полиубиквитинизацию и последующую деградацию; фосфорилирование транскрипционного активатора Swi 5, который предотвращает его поступление в ядро и индукцию экспрессии; 2) Удаление Mcm-белков из ядра, по-видимому, в результате фосфорилирования Mcm-белков. 3) Ингибирование функционирования ORC в результате фосфорилирования. 3 из 6 субъединиц ORC (Orc 1, 2, 6) имеют консенсусы фосфорилирования СDK ((S/T)-P-X-(K/R)). Гиперфосфорилирование происходит после Start. Каждый механизм достаточен для поддержания блока, только одновременное нарушение 3 -х механизмов приводит к реинициации репликации ДНК. Для регуляции используются следующие базовые механические стратегии, как разрушение, релокализация или модификация инициирующих белков.

Модельный механизм CDK-зависимого ингибирования загрузки Mcm 2 -7 В середине рисунка иллюстрируются события рекрутирования Модельный механизм CDK-зависимого ингибирования загрузки Mcm 2 -7 В середине рисунка иллюстрируются события рекрутирования Cdt 1/Mcm 2– 7 и загрузки геликазы. Предполагается, что два неидентичных Cdt 1 -связывающих сайта на Orc 6 облегчают ассоциацию комплексов Cdt 1/Mcm 2– 7 в противоположной ориентации. Мотив RXL белка Orc 6 стимулирует первоначальную доставку Cdt 1/Mcm 2– 7. Этот интермедиат образуют двойной гексамер Mcm 2– 7, хотя возможно что два комплекса Mcm 2– 7 не взаимодействуют на этой стадии. Загрузка геликазы приводит к высвобождению Cdt 1 и сборке двойного гексамера Mcm 2– 7 вокруг ДНК. Справа. Фосфорилирование Orc 2 и Orc 6 киназой CDK ингибирует связывание Cdt 1/Mcm 2– 7 с Nконцевым Cdt 1 -связывающим доменом Orc 6, но связывание с C-концевым доменом сохраняется. Образующийся комплекс не способен загрузить Mcm 2– 7 на origin ДНК. Возможно, это обусловлено неспособностью образовать интермедиат двойного гексамерного комплекса Mcm 2– 7 или неспособностью загрузить Mcm 2– 7 в обоих ориентациях. Слева. Связывание Clb 5 -Cdk 1 с RXL-мотивом (циклин-связывающий сайт) Orc 6 также ингибирует первоначальную доставку Cdt 1–Mcm 2– 7 к ORC. Близость RXL-мотива к N-концевому Cdt 1 -связывающему домену Orc 6 предполагает, что связывание Clb 5 с Orc 6 RXL-мотивом ингибирует связывание Cdt 1 с N-концевым доменом Orc 6. Возможно, что Orc 6, связанный с Clb 5 Cdk 1, также ингибирует Cdt 1 связывание с C-концевым Cdt 1 -свзывающим доменом. В результате, снижение доставки Cdt 1/Mcm 2– 7 будет ингибировать последующую загрузку Mcm 2– 7.

Включение различных ori в процессе S 1. Белки, ассоциированные с репликативной вилкой, связаны со Включение различных ori в процессе S 1. Белки, ассоциированные с репликативной вилкой, связаны со структурами ядра, такими как ламина. Повидимому, в клетках млекопитающих на время репликации влияют ядерные субструктуры, так как области «поздних» ori локализуются вблизи ядерной периферии (кортекс). У дрожжей S. cerevisiae поздно реплицирующиеся теломерные последовательности кластеризуются около оболочки ядра. 2. У S. cerevisiae время включения ori, по-видимому, определяется в конце М или G 1 фазах в ответ на контекст хромосомы (Raghuraman MK, Brewer BJ, Fangman WL. 1997). 3. Показано, что Cdc 28/Clb 5 может включать как «ранние» , так и «поздние» ori, в то время как Cdc 28/Clb 6 – только ранние (Donaldson et al. , 1998). Это обусловлено различием в профиле экспрессии этих циклинов. 4. Программа включения ori является объектом чекпойнт -контроля. У диких штаммов повреждения ДНК вызывают задержку открывания поздних ori. У мутанта rad 53 нарушена остановка репликации в ответ на повреждения ДНК, и открываются как «ранние» , так и «поздние» ori. Координация ранних и поздних ori. а) в норме для инициации ранних ori нужна Сlb 5 - и Сlb 6 ассоциированная активность Cdk, а также Cdc 7 киназа. Для инициации поздних ori необходимы только Clb 5/Cdk и Cdc 7. b) Если в клетках отсутсвует Clb 5, ранние ori запускаются киназами Clb 6/Cdk и Cdc 7, поздние ori не открываются, а реплицируются пассивно, когда их достигнет репликативная вилка.

Checkpoint – контроль включения ori с) В случае если репликативная вилка застопорилась (повреждение, нехватка Checkpoint – контроль включения ori с) В случае если репликативная вилка застопорилась (повреждение, нехватка d. NTP), поздние ori блокируются. Для блокировки необходима киназа Rad 53. Повреждение ДНК или блокированная репликативная вилка активируют чекпойнт-киназу. Киназа Rad 53 ингибирует оба CDK- и DDK-зависимые пути, которые блокируют дальнейшее открывание ori (Zegerman, Diffley, 2010). Rad 53 p действует на DDK напрямую фосфорилируя Dbf 4 p, в то время как CDK-зависимый путь блокируется Rad 53 p-опосредованным фосфорилированием субстрата CDK, Sld 3 p. Это позволяет CDK оставаться активной в процессе S фазы в присутствии повреждения ДНК, что важно для предотвращения перезагрузки Mcm 2 -7 p на уже открытые ori.