Лабораторная диагностика при гельминтозах Выполнила: Студентка 304 группы «Лечебное дело» Артюшенко Оксана Г. Сургут, 2010 год
Основные методы лабораторной диагностики гельминтозов: Макроскопические методы: • Осмотр испражнений • Отстаивание испражнений Микроскопические методы: • Нативный мазок • Толстый мазок по Като • Метод П. П. Горячева • Метод Фюллеборна • Метод Е. В. Калантарян • Соскоб с перианальных складок тампоном • Метод Грэхема • Исследование дуоденального содержимого и желчи Серологические методы: • Реакция связывания комплемента (РСК) • Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) • Реакция латексагглютинации (РЛА) • Иммуноферментный анализ (ИФА)
Используемые материалы: • • Кал Кровь Мокрота Дуоденальное содержимое и желчь Ректальная слизь Моча Биоптат мышц и кист
Принципы диагностики гельминтозов: • Нельзя каким-либо одним методом выявить всех гельминтов, обитающих в пищеварительной системе человека • При флотации не всплывают тяжелые по удельному весу яйца трематод, а также неоплодотворенные яйца аскарид • В растворе фекалий редко всплывают яйца остриц и тениид • В фекалиях могут быть обнаружены и транзитные яйца, которые искажают картину пораженности • Если кал попал в лабораторию, он должен быть обязательно исследован на яйца гельминтов • Если человек попал в стационар, он должен быть обследован на гельминтозы
Возможные ошибки при микроскопии испражнений: При микроскопии испражнений встречаются образования, напоминающие яйца и личинки гельминтов: • • • Пузырьки воздуха и жировые капли Растительные клетки (рис. 1) Споры растений (рис. 2) Пыльца растений (рис. 3) Пищевые частицы (рис. 4) Растительные волоски (рис. 5) Рис. 1 Рис. 2 Рис. 3 Во всех сомнительных случая необходимо учитывать размер, строение оболочек, цвет и морфологию обнаруженных образований, повторно проводить анализы. Рис. 4 Рис. 5
Осмотр фекалий Можно обнаружить гельминтов, их головки, членики, обрывки стробилы, выделяющиеся самостоятельно или после дегельминтизации. Методика работы: 1. Небольшие порции кала перемешивают с водой в чашке Петри 2. Просматривают при хорошем освещении на темном фоне (при необходимости пользуясь лупой) 3. Гельминтов и все подозрительные образования белого цвета извлекают пинцетом или пипеткой 4. Переносят в чашку с водой или на предметное стекло в каплю глицерина или изотонического раствора хлорида натрия для дальнейшего изучения.
Метод отстаивания Методика работы: • Всю исследуемую порцию размешивают с водой в стеклянном цилиндре • Осторожно после некоторого отстаивания слить верхний слой воды • Повторить п. 1 и п. 2 до того как жидкость станет прозрачной • Затем полученную прозрачную жидкость сливают • Осадок просматривают в чашке Петри небольшими порциями на темном фоне при хорошем освещении.
Нативный мазок Плюсы: • наиболее технически доступный метод исследования фекалий • можно обнаружить крупные яйца и личинки гельминтов всех видов. Минусы: • при небольшом числе яиц в фекалиях их не всегда удается найти. По этому должно дополняться методами обогащения. Методика работы: 1. Взять необходимое количество предметных стекол в соответствии с числом исследуемых проб кала (2 предметных стекла на 1 пробу кала) 2. На эти предметные стекла нанести в двух местах пипеткой по 2 капли 50% водного раствора глицерина (для его приготовления смешивают равные части глицерина и воды) 3. Деревянной палочкой взять кусочек кала размером со спичечную головку (30 -50 мг) и растереть в капле глицерина на предметном стекле до получения равномерной суспензии. Таким образом на каждом предметном стекле готовят по два нативных мазка. Для приготовления каждого из четырех препаратов палочкой набирают свежий кусочек кала из другой части пробы 4. Полученные препараты, не накрывая покровными стеклами, исследуют под малым увеличением микроскопа (x 10, x 8) 5. По окончании исследования стекла погрузить в дезинфицирующий раствор, а деревянные палочки сжечь.
Толстый мазок по Като Метод по Като более эффективен, чем изучение нативного мазка, но также требует сочетания с методами обогащения. Выявляются яйца всех видов гельминтов, но с целью обнаружения прозрачных яиц карликового цепня или мелких яиц описторха лаборант должен быть особо внимателен. Основан метод на обнаружении яиц гельминтов в толстом мазке кала, просветленном глицерином и подкрашенном малахитовым зеленым. Реактивы и оборудование: • Глицерин • Раствор фенола 6% - 100 мл (100 мл дистилированной воды, 6 гр фенола) • Малахитовый зеленый 3% (75 мл дистилированной воды, 2, 5 гр малахитовой зелени) • Гидрофильный целлофан • Предметные стекла • Деревянные палочки • Валик или резиновая пробка • Микроскоп
Толстый мазок по Като Для приготовление рабочего раствора смешать в банке с темным стеклом и притертой крышкой: • 100 мл 6% раствор фенола • 100 мл глицерина • 1 -2 мл 3% раствора малахитового зеленого Приготовление целлофановых полосок: • Нарезают полоски гидрофильного целлофана соответствующих размеру предметного стекла (22 x 40 мм) • Помещают их в готовый рабочий раствор Като не менее чем на 24 часа • В 200 мл рабочего раствора можно обработать до 5 тысяч новых целлофановых полосок
Толстый мазок по Като Методика работы: 1. На предметное стекло наносят 30 -50 мг фекалий 2. Растерают индивидуальной палочкой 3. Накрывают целлофановой полоской, обработанной по Като 4. Целлофан сверху притирают резиновой пробкой до получения тонкого равномерного прозрачного слоя 5. Препарат выдерживают при комнатной температуре или в термостате в течении 1 часа 6. Микроскопируют при увеличении объектива x 8 или x 10, увеличении окуляра x 7 или x 10 7. После исследования предметные стекла подвергают дезинфекции, а палочки сжигают.
Метод П. П. Горячева Метод основан на принципе осаждения яиц. Мазок получается светлый, что облегчает обнаружение мелких яиц трематод. Приготовление насыщенного раствора хлорида натрия: • 1 кг хлорида натрия растворяют в 1 л воды • Кипятят до образования кристаллической пленочки • Охлаждают • Хранят готовый раствор в закрытой бутылке Методика работы: 1. В пробирку наливают 2 -4 мл насыщенного раствора хлорида натрия 2. Осторожно сверху наслаивают размешанные в 3 -4 мл воды фекалии так, чтобы образовалось два четко разграниченных слоя 3. Пробирку ставят в штатив на 15 -20 часов 4. По истечении времени жидкость осторожно сливают или отсасывают пипеткой, а осадок переносят пипеткой на предметное стекло 5. Микроскопируют 6. Все использованное оборудование подвергают дезинфекции
Метод Фюллеборна Этот метод обогащения основан на всплывании яиц гельминтов в насыщенном растворе хлорида натрия. Плюсы: • Дешевизна и доступность • Раствор имеет высокую относительную плотность, что дает возможность выявления яиц при небольшом их количестве Минусы: • Яйца трематод, тениид и неоплодотворенные яйца аскарид не всплывают в данном растворе • Замедленное всплывание яиц ряда гельминтов (например яйца власоглава всплывают через 2 -3 часа) Приготовление насыщенного раствора хлорида натрия: • 400 г хлорида натрия растворяют в 1 л воды при кипении • Фильтруют полученный раствор через слой ваты или марли • Охлаждают • Хранят готовый раствор в закрытой бутылке
Метод Фюллеборна Методика работы: 1. В эмалированной кювете расставить стеклянные банки или стаканы, под них положить номерки 2. В каждую банку деревянной палочкой внести 2, 5 -5 г фекалий 3. Постепенно приливая насыщенный раствор хлорида натрия, тщательно размешивать фекалии той же палочкой. Налить раствор почти доверху 4. Бумажной полоской, согнутой в виде совка, быстро снять всплывшие крупные частицы и поместить в банку с дезинфицирующим раствором 5. Отстаивать содержимое баночек 45 минут 6. Взять предметные стекла (для каждой пробы по 3 стекла) и нанести на них по 2 капли 50% водного раствора глицерина 7. Спустя 45 минут проволочной петлей прикасаются к поверхности раствора в банке и стряхивают ее в каплю глицерина 8. Оставшуюся жидкость в банке слить и 4 -8 капель осадка пипеткой перенести на оставшееся предметное стекло 9. Все использованное оборудование подвергают дезинфекции, а деревянные палочки сжигают.
Метод Е. В. Калантарян Является методом обогащения. Применяется насыщенный раствор нитрата натрия. Плюсы: • Наиболее эффективнее и проще, чем метод Фюллеборна Минусы: • Дефицит нитрата натрия • Яйца трематод и онкосферы тениид не всплывают и остаются в осадке • При длительном выдерживании фекалий в растворе яйца некоторых гельминтов набухают и оседают Приготовление насыщенного раствора нитрата натрия: • 1 кг нитрата натрия заливают 1 л воды • Кипятят до образования кристаллической пленки и растворения нитрата натрия • Переливают в сухую бутыль
Метод Е. В. Калантарян Методика работы: 1. В стеклянную емкость объемом 100 мл деревянной палочкой вносят 5 гр фекалий 2. На емкости карандашом пишут номер и помещают ее в эмалированную кювету 3. Постепенно приливают 100 мл насыщенного раствора нитрата натрия, перемешивая палочкой фекалии и доводя уровень жидкости доверху 4. Бумажной полоской, согнутой в виде совка, быстро снять всплывшие крупные частицы и поместить в банку с дезинфицирующим раствором 5. На емкость с фекалиями накладывают предметное стекло так, чтобы оставалась узкая щель и в эту щель добавляют раствор нитрата натрия до тех пор, пока нижняя поверхность стекла не соприкоснется с жидкостью 6. Сдвигают стекло, чтобы оно полностью покрывало баночку и оставляют на 25 -35 минут 7. Затем осторожно и быстро снимают стекло, переворачивают кверху, добавляют 2 -3 капли глицерина и микроскопируют 8. Все использованное оборудование дезинфицируют, деревянные палочки сжигают
Соскоб с перианальных складок тампоном Метод используют для выявления яиц остриц, а также бычьего цепня. Проводят данную процедуру утром до дефекации (у женщин и до мочеиспускания). Метод очень удобен и прост в применении. Методика работы: 1. Ватный тампон, туго намотанный на деревянную палочку, смачивают в 50% водном растворе глицерина 2. Осторожно производят соскабливание с перианальных складок, захватывая границу слизистой оболочки в пределах ануса 3. Палочку с тампоном помещают в небольшую сухую пробирку и доставляют в лабораторию 4. В лаборатории тампон смывают поочередно в 1 -2 каплях 50% водного раствора глицерина 5. Готовят таким образом 4 препарата на двух предметных стеклах
Метод Грэхема Высокоэффективный метод выявления яиц остриц и онкосферы тениид. С этой целью используют прозрачные бесцветные ленты с липким слоем. Очень прост в применении. Но требует тщательного соблюдения личной гигиены. Методика работы: 1. Конец ленты в рулоне захватывают пинцетом и отрезают полоску длиной 10 см 2. Затем, придерживая ленту за один конец пинцетом, прикладывают липким слоем к коже перианальной области обследуемого поперечно продольной оси тела 3. Деревянным шпателем приглаживают полоску 4. Отделяют полоску ленты и прикладывают липкой стороной к предметному стеклу, свободные концы заворачивают на другую сторону стекла и разглаживают вновь шпателем 5. В лаборатории препарат микроскопируют 6. После все оборудование дезинфицируют, деревянные шпатели сжигают
Исследование дуоденального содержимого и желчи Яйца и личинки гельминтов, паразитирующих в печени, желчном пузыре, поджелудочной железе и двенадцатиперстной кишке, могут быть обнаружены в дуоденальном содержимом и желчи, полученных при дуоденальном зондировании. Методика работы: 1. На зонде отмечается расстояние от пупка до передних зубов и до мочки уха пациента в положении стоя. 2. Усадить пациента, дать ему в руки лоток с зондом. 3. Оливу кладут пациенту глубоко за корень языка, предлагают глубоко дышать и делать глотательные движения. Олива предположительно находится в желудке, если зонд дошел до первой метки. В случае появления позывов на рвоту — пациент должен зажать зонд губами и сделать несколько глубоких вздохов. 4. После попадания оливы в желудок пациента укладывают на правый бок, подложив валик (сверху которого — горячая грелка завернутая в полотенце) на уровень нижних ребер. 5. Пациент должен продолжать медленно заглатывать зонд. Одновременно необходимо аспирировать содержимое желудка, что должно способствовать открытию привратника и переходу оливы в двенадцатиперстную кишку.
Исследование дуоденального содержимого и желчи 6. Чаще всего олива проходит в двенадцатиперстную кишку через 1 -2 часа во время периодического открытия привратника. В случае, если зонд свернулся в желудке — исследуемый оттягивает его до первой отметки, после чего опять медленно заглатывает. Для определения местоположения оливы можно использовать рентгеноскопию. Можно также применить такой метод: шприцем в зонд вводят воздух, если пациент ощущает клокотание — олива в желудке, если нет — в двенадцатиперстной кишке. 7. В случае задержки открытия привратника — ввести подкожно 1 мл 0, 1 % раствора атропина, 2 мл 2 % раствора папаверина или дать выпить 100— 200 мл 1 % раствора натрия гидрокарбоната, после чего на 10— 15 минут закрыть зонд зажимом. 8. Порция А. Выделяется из зонда после попадания оливы в кишку. Для анализа — берут пробирку с самым прозрачным содержимым.
Исследование дуоденального содержимого и желчи 9. Для сбора порции B вводят один из раздражителей, после чего закрывают зонд на 5 -10 минут, после чего выделяется тёмнооливковая желчь — концентрированное содержимое желчного пузыря. Если этого не происходит то через 15 -20 минут повторяют введение раздражителя. 10. Порция C — выделяется после полного опорожнения желчного пузыря. Жидкость прозрачная, без примесей — это смесь желчи из внутрипёченочных желчных путей и кишечного сока. 11. После получения порции C зонд извлекают. 12. Из исследуемой жидкости сначала выбирают и просматривают под микроскопом плавающие в ней хлопья, а затем смешивают ее с равным количеством серного эфира, тщательно взбалтывают и центрифугируют. 13. Надосадочную жидкость сливают, а весь остаток микроскопируют.
Иммунитет при паразитарных заболеваниях 1. Наиболее четким неспецифическим критерием паразитарного заболевания является эозинофиллия и увеличение уровня общего Ig. E. 2. Особую актуальность представляет определение специфических противопаразитарных Ig. E (к аскариде, эхиннококку, анизокидоз и т. д. ) для определения этиологии аллергических проявлений заболевания. Их синтез достигает максимального значения через 1, 5 -2 недели 3. Через 6 -8 недель начинает быстро падать - начинает вырабатываться иммуноглобулины класса G (Ig. G). Их максимальная концентрация достигается к 2 -3 месяцам от начала заражения и держится на таком уровне довольно долго. 4. Однако при длительных сроках (более 10 лет) заболевания у больных нередко наблюдается значительное снижение уровня специфических антител - ниже порогового из-за развития иммунодефицитного состояния пациента и адсорбции белков плазмы на кутикуле паразита. 5. Иммунная система при контакте с антигенами описторхисов первыми начинает вырабатывать специфические к ним иммуноглобулины класса М (Ig. M).
Выявление антител к отдельным паразитам 1. ИФА-тесты несут лишь косвенную информацию о наличии паразита в организме человека, поскольку являются лишь свидетелями ответной реакции организма на инвазию. 2. Индивидуальный иммунный ответ на гельминтоз может существенно различаться. 3. Безусловным преимуществом в диагностике обладают лабораторные тесты, непосредственно выявляющие паразитов либо их личинки, цисты, яйца (микроскопическое исследование кала, дуоденального содержимого и т. д. ). 4. Вместе с тем, непосредственное выявление паразита не всегда возможно в виду его тканевой локализации (трихинеллез, эхинококкоз, токсокароз) или в связи с малым числом паразитирующих особей и их концентрацией в исследуемом материале. 5. В этих случая чувствительность ИФА-тестов имеет однозначное и безусловное преимущество.
Скачать презентацию Лабораторная диагностика при гельминтозах Выполнила: Студентка 304 группы
Лабораторная диагностика при гельминтозах.ppt