КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА КАФЕДРА АНАЛІТИЧНОЇ ХІМІЇ Сучасні методи визначення кокаїну Виконала: студентка групи ХАМАЛ І курсу ОКР магістр Мигловець Марина

Кокаїн - міститься в рослинах роду Erythroxylum, а саме Erythroxylum coca Вміст кокаїну в дикоростучих листях коки складає близько 1%. 1914 р. – офіційно оголошений наркотиком в США 1922 р. – поставлений поза законом 1963 р. – рішенням ООН внесений в список заборонених речовин Кокаїновий ринок в США в 2005 р. становив 50 млрд USD Частка споживання: Північна і Південна Америка – 70 % Європа – 22 % Україна та СНД – менше через високу ціну 2

Кокаїн – це метиловий естер бензоїлекгоніну , алкалоїд тропанового ряду, що діє як місцевий анестетик, стимулятор появи відчуття стану підвищеної уважності, сконцентрованості і ейфорії. Властивості: Т(пл) = 98 0 С – основа, Т(пл) = 200 -202 0 С – гідрохлорид р. Ка = 8, 41 ММ = 303, 353 г/моль log. P 2. 3 Форми випуску: 1. Паста коки – дешевий продукт, отримують первинною екстракцією із листя коки (вміст кокаїну 40 – 90 %); 2. Кокаїн гідрохлорид – для медичного використання, є добре очищеним продуктом (80 – 95 % кокаїну) 3. Крек – дешевша версія кокаїну, що використовується для куріння, є вільною основою 4. Спідбол – суміш креку і героїну, найбільш небезпечка форма розповсюджуваного кокаїну. 3

Шляхи перетворення кокаїну в організмі людини Рис. 1. Метаболіти, продукти піролізу кокаїну та аддукти з етанолом. СОС – кокаїн; NCOC – норкокаїн; BE – бензоїлекгонін; NBE – норбензолекгонін; HBE – м-гідроксибензоїлекгонін; EME – метиловий естер екгоніну; E – екгонін; CE – кокаетилен; EEE – етиловий естер екогніну; NCE – норкокаетилен; AEME – метиловий естер ангідроекгоніну; AE – ангідроекгонін. 4

Об’єкти для визначення кокаїну: 1. Біологічні рідини: 1. Сеча 2. Кров, плазма, сиворотка крові 3. Слина 2. Волосся 3. Банкноти 5

Рідин-рідинна Пряма інжекція: екстракція функції (дихлорметан) SPE-картриджу виконує передколонка для ВЕРХ Пробопідготовка сечі Твердофазна екстракція комерційно доступними SPE-картриджами 6

Пробопідготовка крові, плазми і сиворотки крові центрифугування - фібриноген Кров Плазма крові Сиворотка + буфер зливають органічний шар випарюють + РФ чи інший досуха розчинник азот 7

Пробопідготовка слини + буфер елюювання Слина + метанол SPE-картридж випарювання + РФ чи інший розчинник азот 8

Рідин-рідинна Лужне озолення екстракція розчином Na. OH (метанол) Пробопідготовка волосся 1. Нейтральне середовище 2. Помірна температура Ферментативний Надкритична флюїдна гідроліз екстракція (+ ультразвукова вуглекислим газом баня) 9

Вакуумна пробопідготовка: Пряма принцип порохотягу термодесорбція on-site (+ мас-спектроскопія) Пробопідготовка банкнот Екстракція органічними Очищення Екстракція розчинниками екстракту SPE розбавленими (хлороформ, -картриджем кислотами метанол, (хлоридна чи ацетонітрил, етанол) оцтова) 10

Рис. 2. Концентраційні межі знайдених на банкнотах слідів кокаїну 11

Для ідентифікації та кількісного визначення кокаїну та його метаболітів найпоширенішими є декілька методів: імуноаналіз , газова хроматографія (найчастіше з мас-спектрометричним детектуванням, іноді – детектор з електронним захватом), ВЕРХ та власне мас-спектроскопія, іноді - вольтамперометрія. Газова хроматографія • в поєднанні з мас-спектрометричним детектуванням, поряд із високоефективною рідинною хроматографією, є найпоширенішим методом визначення кокаїну в різноманітних матрицях. • ГХ-МС характеризується високою чутливістю та специфічністю. • вимагає дериватизації бензоїлекгоніну 12

Таблиця 1. Часи утримування та характеристичні іони досліджуваних сполук Характеристичні іони, Сполука Дериватизована форма Час виходу m/z AE PFP 270, 299, 271 3, 00 AEME - 152, 181, 166 3, 34 E PFP/PFPA 300, 463, 314 3, 71 d-EME - 185, 348, 317 4, 02 EME PFPA 182, 345, 314 4, 03 EEE PFPA 196, 359, 314 4, 53 d-BE - 303, 424, 319 7, 22 BE PFP 300, 421, 316 7, 23 NBE PFP/PFPA 312, 431, 214 7, 52 HBE PFP/PFPA 300, 583, 434 7, 80 d-COC - 185, 306, 275 7, 85 COC - 182, 303, 272 7, 86 d-CE - 199, 320, 275 8, 27 CE - 196, 317, 272 8, 28 NCOC PFPA 313, 435, 214 8, 33 NCE PFPA 327, 214, 105 8, 72 13

Умови хроматографування: ГХ Hewlett Packard (HP) 6890 series GC з детектором HP 5973 quadrupole MS; капілярна колонка HP-ULTRA-1 crosslinked 100% methyl siloxane (12 м х 0, 2 мм х 0, 33 мкм); газ-носій – гелій (швидкість потоку постійна, 1 мл /хв. ). Екстракт об'ємом 1 мкл вводили за допомогою автосамплеру HP 6890 в колонку. Режим без ділення потоку, температура порту 250 0 С. Температурна програма включала в себе декілька етапів: 70 – 130 0 С при 30 0 С/хв. ; 130 – 140 0 С при 5 0 С/хв. ; 140 – 210 0 С при 35 0 С/хв. ; 210 – 222 0 С при 4 0 С/хв. ; 222 – 290 0 С при 45 0 С/хв. Рис. 3. Хроматограма досліджуваної суміші кокаїну та його метаболітів за концентрації кожного 800 нг / мл. Ідентифікація піків: 1 – ангідроекгонін ; 2 - метиловий естер ангідроекгоніну; 3 – екгонін; 4 - метиловий естер екгоніну; 5 - етиловий естер екогніну ; 6 – бензоїлекгонін ; 7 – норбензолекгонін ; 8 - м- гідроксибензоїлекгонін ; 9 – кокаїн; 10 – кокаетилен ; 11 – норкокаїн ; 12 – норкокаетилен. 14

Таблиця 2. Межа виявлення, межа кількісного визначення, лінійний динамічний діапазон для кокаїну та його метаболітів; аліквота досліджуваного зразку – 3 мл крові; концентрації, менші за 0, 78 нг/мл, не досліджувались Сполука МВ, нг/мл МКВ, нг/мл ЛДД, нг/мл r 2 Кокаїн 0, 78 -3200 0, 999 Норкокаїн 0, 78 1, 56 -1600 0, 999 Бензоїлекгонін 0, 78 -3200 0, 999 Норбензилекгонін 3, 12 -800 0, 999 м-Гідроксибензоїлекгонін 1, 56 1, 56 -3200 0, 993 Метиловий естер екгоніну 1, 56 1, 56 -3200 0, 998 Екгонін 12, 5 25 -1600 0, 999 Кокаетилен 0, 78 -3200 0, 999 Норкокаетилен 0, 78 1, 56 -1600 0, 998 Етиловий естер екгоніну 0, 78 0, 78 -3200 0, 997 Метиловий естер 0, 78 -3200 0, 998 ангідроекгоніну Ангідроекгонін 12, 5 -3200 0, 999

Високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ) • ВЕРХ стає класичним методом успішного та ефективного визначення кокаїну та його метаболітів (в першу чергу бензоїлекгоніну) у найпоширеніших об’єктах – біологічних рідинах • ВЕРХ є найбільш привабливим і універсальним методом для визначення наркотиків в біологічних рідинах, оскільки він забезпечує можливість регулювання селективності і роздільної здатності в широкому діапазоні. • Завдяки м'яким умовам хроматографування (порівняно з ГХ), ВЕРХ є найкоректнішим методом для аналізу термічно лабільних сполук. • Не потребує додаткової стадії дериватизації полярних продуктів метаболізму кокаїну (в тому числі і бензоїлекгоніну, який фіксують в найбільших кількостях у біологічних рідинах). 16

Суміш р. Н С, нг/мл Rкок, % Rбенз, % роз-ків СН 2 СІ2 6 300 66, 65 17, 18 Етилацетат 6 300 54, 27 1, 94 Таблиця 3. СН 2 СІ2 - ізопропанол- 6 300 57, 04 2, 74 Вилучення гексан кокаїну та СН 2 СІ2 - ізопропанол- 8, 4 300 57, 84 5, 00 бензоїлекгоніну із етилацетат плазми крові СН 2 СІ2 - людини ізопропанол- 8, 4 300 41, 59 5, 24 гексан сумішами розчинників та SPE-картридж р. Н С, нг/мл Rкок, % Rбенз, % SPE-картриджами Chroma-bond (метанол: аміак, 6 300 56, 03 80, 38 C 18 ec 19: 1 v/v) Sep. Pak C 18 6 300 61, 78 82, 38 Izolute 6 300 60, 38 84, 68 Oasis MCX 6 300 60, 08 91, 66 Oasis HLB 6 300 68, 65 91, 85 17

ВЕРХ HPLC 1100 (Agilent Technologies, Darmstadt, Germany) , автосамплер G 1329 A, a термостат колонок G 1316 A , детектор Agilent Ion Trap (1100 VL; Agilent Technologies). Хроматографування проводили при 45ºC на колонці Zorbax SB-C 18 (100 mm x 3. 0 mm, 3. 5 μm I. D) (Agilent Technologies) в ізократичному режимі. РФ суміш метанолу і 0, 1 % мурашиної кислоти 32: 68 (v/v) при швидкості потоку1 мл/хв. Сканування - в межах m/z 290 – 168, кокаїну – 304 – 182. Калібрувальні криві були лінійними в межах 20 – 2000 нг / мл для обох сполук (r > 0. 992), межа кількісного визначення 20 нг / мл. Часи виходу кокаїну та бензоїлекгоніну становили відповідно 1, 35 хв і 1, 15 хв при загальному часі розгонки Рис. 4. Хроматограма зразку плазми 1, 7 хв. крові із вмістом кокаїну (1) і бензоїлекгоніну (2) по 20 нг/мл. 18

Вольтамперометрія Рис. 6. Диференційна імпульсна вольтамперограма 1· 10 -5 моль/л розчину кокаїну у середовищі фосфатного буферу при р. Н 8, 5 (1). Концентрація бензоїлекгоніну , додана до розчину кокаїну, зростала у напрямку від 3, 5· 10 -6, Рис. 5. Диференційні імпульсні 6· 10 -6, 9· 10 -6, 1, 95· 10 -5, 3, 9· 10 -5 до 5, 1· 10 -5 вольтамперограми 3, 5· 10 -5 моль/л кокаїну у моль/л. Вольтамперограма (2) була фосфатному буфері при р. Н 7, 0 (1) і 8, 5 (2). отримана з розчину, що містив лише 8· 10 - Вольтамперограми (3) і (4) були отримані в 5 моль/л бензоїлекгоніну в аналогічному середовищі 0, 10 моль/л аміачного буферу буфері. при р. Н 10 та 0, 01 моль/л Na. OH відповідно. 19

Кількісне вольтамперометричне визначення: Ір (н. А) = 26, 827*Скок, моль/л + 20, 023 (R = 0. 9924). МВ (кокаїн) = 2· 10 -9 моль/л. Sr = 3 – 6 % Рис. 7. Залежність висоти вольтамперометричного піку від концентрації кокаїну у середовищі 0, 05 моль/л розчину Na. OH. Скокаїну, моль/л: 1 – 2, 5· 10 -8; 2 - 7, 5· 10 -8; 3 - 3, 0· 10 -7; 4 - 7, 0· 10 -7; 5 - 8, 0· 10 -7; 6 - 1, 0· 10 -6. Час накопичення 60 с при Е = -0, 500 В, частота зміни розгортки потенціалу 250 Гц, «висота» імпульсу 50 м. В та зміна скануючого потенціалу 1 м. В. Із кожної вольтамперограми був вирахуваний фон. 20

Мас-спектроскопія Рис. 8. Повні мас- спектри кокаїну (а) та бензоїлекгоніну (в). Кокаїн [M+H]+ з m / z 304, 2; осколочний йон - m/z 182, 2. ЛДД 1 – 28 мкг/г (RSD 4 – 7 %) МВ 2, 1 нг/г МКВ 3, 5 нг/г Бензоїлекгонін [M+H]+ з m / z 290, 3; осколочний йон - m/z 168, 0. ЛДД 5 – 52 мкг/г (RSD 2 – 7 %) МВ 2, 2 нг/г МКВ 3, 7 нг/г 21

Біохімічні сенсори За нормальних умов тиск парів кокаїну складає близько 1, 9*10 -7 тор (чи 2, 5*10 -5 Па) Існує можливість визначення кокаїну в повітрі при прокачуванні кількох мл повітря через певну установку, в якій кокаїн із газової фази переходить в рідку (50 мкл), а при подальшому визначення межа виявлення складає кілька н. М Рис. 9. Схематичне зображення біосенсору фільтру мод (типів хвиль) на решітці у хвилеводі. 22

Прототип біосенсору, створений за розробленою методикою Рис. 10. Схема повністю укомплектованого біосенсору включаючи систему подачі рухомої фази, власне біосенсор та оптичну проточну та Z- подібну абсорбційну комірку; А – фото сенсору, В – схематичне зображення. 23

Схема конкурентного зв’язування Рис. 11. Схема конкурентного імуноаналізу при визначенні кокаїну із використанням моно канальних антитіл (А) та антитіл, конюгованих золотом (В). Мультивалентні антиген-протеїнові кон’югати іммобілізовані на хвилеводі за допомогою полісахариду Opto. Dex. 24

Результати та перспектива використання МВ (3σ) кокаїну становила 0, 2 нг / мл (0, 7 н. М ) для Au- m. Ab і 0, 26 мкг/мл (0, 85 мк. М) для m. Ab. Результати визначень показали, що в рідкій пробі кокаїн можна визначити аж від концентрації 0, 7 н. М протягом 1 хв. Рис. 12. Градуювальні графіки конкурентного імуноаналізу , проведеного за допомогою моноканальних антитіл m. Ab (вільні трикутники) і кон’югованих золотом Au-m. Ab (заповнені трикутники). 25

Таблиця 4 Порівняльна характеристика розглянутих сучасних методів визначення кокаїну Час аналізу Лінійний без МВ Sr, % Метод діапазон пробопідгото вки 0, 78 -3200 9 хв (всі ГХ-МС 0, 78 нг 4– 6 нг/мл метаболіти) 20 – 2000 ВЕРХ-МС/МС 3– 6 2 хв нг/мл Вольтампероме 0, 6 0, 9 – 8 – 300 нг/мл 3 – 5 хв трія нг/мл 3, 2 Мас- 2, 1 нг/г 1 – 28 мкг/г 4– 7 90 с спектроскопія Біосенсори 0, 2 1 порядок 5 1 хв (імуноаналіз) нг/мл 26

Висновки: • Імуноферментний аналіз є значно дешевшим, ніж ГХ-МС та ВЕРХ-МС, але при цьому він менш чутливий і селективний. Не потребують складної пробопідготовки і забезпечують швидкий аналіз автоматизовані біосенсори , що може проводитись і неспеціалістом. Їх недолік – працюють лише для певного об’єкту. • Покращити як чутливість, так і селективність можна використанням ВЕРХ-МС. ВЕРХ має деякі переваги перед ГХ, наприклад, аналіз без попередньої дериватизації. Але за рахунок складнішої техніки виконання та потреби у великій кількості високочистих розчинників, ВЕРХ є дорожчою за ГХ. • ГХ-МС характеризується високою чутливістю та специфічністю. ГХ для аналізу вищеназваних зразків з кокаїном потребує трудомісткої та складної пробопідготовки, що робить аналіз більш тривалим, дорожчим і створює труднощі при дослідженні великої кількості зразків. • Використання мас-спектроскопії окремо та як детектору у хроматографії має значну перевагу – відсутність потреби у стандартах для аналізу, оскільки ідентифікація здійснюється безпосередньо за мас-спектрами. Недолік – висока вартість обладнання, потреба у висококваліфікованих спеціалістах. • Вольтамперометричне визначення кокаїну значно залежить від умов спонтанного гідролізу, оскільки електроактивним є метаболіт кокаїну – бензилекгонін, утворення якого залеить від кислотності середовища, а не сам наркотик. Вартість обладнання значно нижча, ніж для ГХ і ВЕРХ, 27