Скачать презентацию Использование нанотехнологических подходов для разработки нового поколения вакцин Скачать презентацию Использование нанотехнологических подходов для разработки нового поколения вакцин

99b729abc6996ce4aa5fa56c54af3c26.ppt

  • Количество слайдов: 24

Использование нанотехнологических подходов для разработки нового поколения вакцин и терапевтических препаратов А. Л. Гинцбург Использование нанотехнологических подходов для разработки нового поколения вакцин и терапевтических препаратов А. Л. Гинцбург ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи РАМН 1

Оптимистические прогнозы середины прошлого столетия в отношении борьбы с инфекциями не оправдались. По данным Оптимистические прогнозы середины прошлого столетия в отношении борьбы с инфекциями не оправдались. По данным воз ежегодно в мире от инфекционных болезней умирает 16 млн человек. За последние десятилетия человечество столкнулось с десятком новых инфекционных заболеваний. В основе многих тяжелых хронических заболеваний, которые ранее считались соматическими, лежит инфицирование определенным патогенным микроорганизмом. 2

В то же время, как показали два прошедших столетия, самым надежным способом защиты человеческой В то же время, как показали два прошедших столетия, самым надежным способом защиты человеческой популяции от инфекций это вакцинация. Вакцины созданы против 34 возбудителей инфекционных заболеваний, а человечество поражает более 400 инфекций. Последние достижения иммунологии и микробиологии с конструктивными возможностями био и нанотехнологий дают возможность приступить к созданию вакцин против тех возбудителей инфекционных заболеваний, для которых они еще не созданы и к принципиальному улучшению качества существующих вакцин. 3

Структурная организация аденовирусной частицы Ген чужеродного антигена 7 0 - 9 0 нм Фибер Структурная организация аденовирусной частицы Ген чужеродного антигена 7 0 - 9 0 нм Фибер ДНК - Содержит делетированный геном, неспособен к размножению in vitro и in vivo. - Представляет собой физическую самособирающуюся частицу. - Обеспечивает доставку и экспрессию чужеродного генетического материала в клетке. Гексон Для решения этих проблем в НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи РАМН разработан ряд технологий. Сегодня остановимся на одной, которая дала к настоящему времени наиболее значимые результаты, позволяющие в ряде случаев приступить к клиническим испытаниям. Для этого генноинженерными методами на основе аденовирусов были сконструированы частицы способные доставлять нужные гены (определяющие синтез полезных белков) в строго определенные клетки и ткани организма человека. 4

Выявление участка белка оболочки нановирусной частицы позволяющий проведение различных модификаций белок оболочки нановирусной частицы Выявление участка белка оболочки нановирусной частицы позволяющий проведение различных модификаций белок оболочки нановирусной частицы Суперкомпьютер участок молекулы белка оболочки нановирусной частицы, в котором возможно проведение модификаций Сотрудниками нашего института были проведены биоинформационные исследования с использованием российского суперкомпьютера и уникального программного обеспечения для выявления участка оболочки вирусной частицы, позволяющего проводить модификации без нарушения общей структуры частицы. В результате математически рассчитанной модификации была изменена специфичность проникновения. Если исходный вирус проникал в эпителиальные клетки, то созданный нами - в клетки мышцы (фибробласты). Полученные результаты опубликованы в журнале: Journal of Virology, 2007. v. -81, pp. -9641– 9652 Logunov D. Y. , Zubkova O. V. , Karyagina-Zhulina A. S. , Shmarov M. M. , Naroditsky B. S. , Gintsburg A. L. Identification of HI-like loop in celo adenovirus fiber for incorporation of receptor binding motifs. 5

На основе сконструированного носителя созданы терапевтические и профилактические препараты ген фактора роста эндотелия 1 На основе сконструированного носителя созданы терапевтические и профилактические препараты ген фактора роста эндотелия 1 ген гликопротеина ген Н 5 2 3 6

Препараты для генной терапии, разработанные в ГУ НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи РАМН Аденовирусные Препараты для генной терапии, разработанные в ГУ НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи РАМН Аденовирусные частицы содержат гены ангиогенина и фактора роста эндотелия сосудов для лечения хронических облитерирующих заболеваний артерий нижних конечностей человека • Препарат создан совместно с Российским научным центром хирургии РАМН; • Начаты клинические испытания препарата на базе Российского научного центра хирургии РАМН; • Результаты работ опубликованы и запатентованы. Вестник Российской АМН, 2006, № 9 -10, С. 6 -10. Н. П. Бочков, Б. А. Константинов, А. В. Гавриленко, В. З. Тарантул, Е. Д. Свердлов, Б. С. Народицкий, А. Л. Гинцбург. Генно-инженерные технологии в лечении хронической ишемии нижних конечностей. 7

Кандидатные аденовирусные вакцины разработанные в ГУ НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи РАМН Кандидатная вирусная Кандидатные аденовирусные вакцины разработанные в ГУ НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи РАМН Кандидатная вирусная вакцина против вируса гриппа птиц H 5 N 1 • Разработана и испытывается совместно с ФГУ “Федеральный центр охраны здоровья животных”, г. Владимир; • Эффективность кандидатной нановирусной вакцины против вируса гриппа птиц H 5 N 1 в опытах на животных достигает 95%; • Разработанная технология получения вакцин позволяют, в случае появления нового эндемичного штамма вируса гриппа, создать адекватный вариант вакцины в течении 30 -45 дней; • Разработанная технология получения нановирусных вакцин запатентована. 8

Кандидатные аденовирусные вакцины разработанные в ГУ НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи РАМН Кандидатная вакцина Кандидатные аденовирусные вакцины разработанные в ГУ НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи РАМН Кандидатная вакцина против вируса бешенства • В лабораторных исследованиях эффективность вакцины для животных против вируса бешенства составила 95 -98%; • Кандидатная нановирусная вакцина подготовлена для полевых испытаний на базе ВНИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии РАСХН, г. Покров Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 2006, № 4, С. 69 -71. М. М. Шмаров, И. Л. Тутыхина, С. Ж. Цыбанов, Б. В. Новиков, Б. С. Народицкий, А. Л. Гинцбург Индукция проективного иммунного ответа у мышей, вакцинированных рекомбинантным аденовирусом птиц CELO, экспрессирующим гликопротеин G вируса бешенства. 9

Технологическая схема получения препаратов (терапевтических и профилактических) на основе аденовирусных частиц Получение нановирусного посевного Технологическая схема получения препаратов (терапевтических и профилактических) на основе аденовирусных частиц Получение нановирусного посевного материала Этап 1 Накопление нановирусных частиц в культуре клеток Этап 2 Очистка и Готовый терапевтический концентрирование или полученного препарата с Контроль профилактический помощью проточной качества препарат хроматографии препарата Этап 3 Этап 4 Этап 5 Максимальная производительность технологической линии, занимающей 300 м 2 составляет 2 000 доз препарата нановирусных частиц в год. 10

Требования к “идеальной” субъединичной вакцине Для полноценного иммунного ответа на субъединичный АГ (а только Требования к “идеальной” субъединичной вакцине Для полноценного иммунного ответа на субъединичный АГ (а только такие вакцины могут полностью гарантировать безопасность на фоне массовых иммунодефицитных состояний (разного генеза) необходимо выполнить ряд условий: 1) Вакцина должна содержать АГ взаимодействующий с Toll-подобными рецепторами (стимулирующими врожденный иммунитет). 2) Вакцина должна содержать АГ специфичный (стимулировать приобретенный иммунитет). для конкретного патогена 3) АГ должен быть определенным образом представлен в составе нанометрового носителя, чтобы гарантировать кластаризацию рецепторов АГ. Второй подход подразумевает создание идеальной субъединичной вакцины. Здесь перечислены требования к такой вакцине, исходя из уровня наших знаний по иммунологии и микробиологии. Препарат должен содержать два типа лигандов взаимодействующих с двумя типами рецепторов, находящихся на клетках иммунной системы. Взаимодействие с первым типом рецепторов активирует врожденный иммунитет (то, что в быту мы называем воспалением). Взаимодействие со вторым типом рецепторов активирует приобретенный иммунитет. 11

АГ Toll Лиганд Рецептор My. D 88 FADD p 65 p 50 NFKB Оба АГ Toll Лиганд Рецептор My. D 88 FADD p 65 p 50 NFKB Оба типа клеточных рецепторов обеспечивают запуск иммунного ответа только после их кластаризации, вызванной взаимодействием лиганда и рецептора. Лиганд является частью антигена. В связи с этим становится очевидным, что геометрия расположения лигандов для клеточных рецепторов является определяющим моментом для кластаризации и получения полноценного иммунного ответа. Активация генов 12

Другой тип рецепторов, который возник, по-видимому, на более поздних стадиях эволюции предназначен для узнавания Другой тип рецепторов, который возник, по-видимому, на более поздних стадиях эволюции предназначен для узнавания уникальных (неконсервативных) особенностей микроба – это антигенные рецепторы Т и В клеток, обеспечивающих весь комплекс приобретенных иммунных реакций. mlg. M L H H VH Cm 1 L VL α β CL Cm 2 Vα Cβ Cm 3 Cm 4 антигенраспознающий рецептор В-лимфоциты антигенраспознающий рецептор CD 4+ Т-лимфоциты 13

Специфичность Толл-подобных рецепторов (TLRs) Бактериальные компоненты Липопротеины Липоарабидоманнан Липотейхоевые кислоты Зимозан (дрожжи) Вирусные компоненты Специфичность Толл-подобных рецепторов (TLRs) Бактериальные компоненты Липопротеины Липоарабидоманнан Липотейхоевые кислоты Зимозан (дрожжи) Вирусные компоненты T. gondi Профилин ЛПС Флагеллин Неметилированная Cp. G ДНК дц. РНК оц. РНК Неизвестные компоненты ? ? TLR 1 CD 14 TLR 6 TLR 2 TLR 4 TLR 5 TLR 11 TLR 9 TLR 3 TLR 7 TLR 8 TLR 10 Решая задачу распознавания и защиты от патогенов, эволюция многоклеточных создала молекулырецепторы, способные узнавать консервативные признаки всех классов микроорганизмов. Эти рецепторы, о существовании которых стало известно лишь 10 лет назад, называются Toll-подобными. С помощью 11 типов Toll рецепторов клетки иммунной системы, в первую очередь, профессиональные фагоциты узнают консервативные компоненты практически всех микроорганизмов, в более общей форме полимеры органического происхождения чужеродные для многоклеточного организма. Лиганд-рецепторное 14 взаимодействие запускает весь комплекс реакций врожденного иммунитета.

Реализация основного принципа нанотехнологии самосборка биологически активных наноструктур с заданными свойствами Как можно в Реализация основного принципа нанотехнологии самосборка биологически активных наноструктур с заданными свойствами Как можно в настоящее время выполнить эти требования. Их можно выполнить, реализуя основной принцип наноконструирования, позаимствованный у эволюции – принцип комплементарности, позволяющий осуществлять самосборку, причем в промышленных масштабах. 15

Для реализации этого принципа в НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи РАМН в лаборатории биологически Для реализации этого принципа в НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи РАМН в лаборатории биологически активных наноструктур был разработан метод, позволяющий совмещать в одной частице все компоненты, определяющие оптимальные свойства нановакцин. Каждый компонент наделяется способностью к самосборке на биосовместимом (а в дальнейшем на биодеградируемом) носителе, за счет введения в его состав карбогидрат-связывающего домена из гликолитических гидролаз, которые имеются у многих сапрофитных бактерий, способных утилизировать хитин, целлюлозу, липополисахариды. 16

Исследование ферментативного аппарата, ответственного за деградацию этих полимеров показало, что он высокоорганизован и представлен Исследование ферментативного аппарата, ответственного за деградацию этих полимеров показало, что он высокоорганизован и представлен структурами, получившими название целлюлозосомы. В состав целлюлозосомы в первую очередь входит высокомолекулярный белок, выполняющий структурные функции. Структурный белок имеет сайт связывания для белков с ферментативными активностями, которые способны образовывать на поверхности бактериальной клетки ферментативный конвейер, состоящий из различных ферментов, осуществляющих деградацию полимера. Причем, в состав одной целлюлозосомы могут входить ферменты, синтезируемые разными видами бактерий, живущих в одной многокомпонентной природной нише. Это прекрасный пример социального поведения бактерий на протеомном уровне, а также пример того, как можно получать глюкозу или низкоатомные спирты (энергетически ценные продукты) используя нанатехнологии. Но сегодня нас в первую очередь будет интересовать другая структурная особенность целлюлозосом, а именно их домены, способные высокоспецифично связывать целлюлозу. 17

Трехмерная структура ЦСД и ГСД 5’ 3’ N C В настоящее время генетическая организация Трехмерная структура ЦСД и ГСД 5’ 3’ N C В настоящее время генетическая организация ряда белков, содержащих целлюло- и гликанозосвязывающие домены известна. Фактически сама природа в процессе эволюции сделала все необходимое для того, чтобы была возможность использовать эти домены в составе гибридных белков. На 5’ и 3’ концах ДНК-фрагмента, кодирующего домен, имеются спейсерные последовательности, соответствующие С- и N-концевой частям белкового фрагмента, присоединение к которым, как было показано нами, не влияет на целлюлозо- и гликаносвязывающую способность. 18

Схема конструирования рекомбинантной плазмиды GBD-D 5. GBD D-5 GBDD-5 Это позволило клонировать фрагменты ДНК, Схема конструирования рекомбинантной плазмиды GBD-D 5. GBD D-5 GBDD-5 Это позволило клонировать фрагменты ДНК, содержащие ЦСД и ГСД и получить слитные генетические конструкции, детерминирующие синтез ЦСД или ГСД и протективных АГ в качестве которых в одном случае выступал белок ESA-6 туберкулеза, в другом трансмембранный белок туляремии tyl-4, и мембраносвязанный поверхностный белок адгезии возбудителя лептоспирозов. GBP антиген 19

Гибридный белок ЦСД Tul-4 можно получить электрофоретически чистым в одну стадию на колонке с Гибридный белок ЦСД Tul-4 можно получить электрофоретически чистым в одну стадию на колонке с целлюлозой. При этом он сохраняет свои антигенные свойства по результатам иммуноблотинга лизат 1 2 3 Ошаренная целлюлоза 1 – лизат В настоящее 1 – лизат F. tularensis время Электрофоре. PACYCFNL 2 – лизат проводится тически чистый Tul-4 F. tularensis работа по гибридный PACYFNL белок ЦСД Tul-4 2 – белок изучению Tul-4 ЦСД Tul-4 протективных 3 – белок ЦСД Tul-4 свойств гибридного белка. Далее была проведена работа по очистке рекомбинантного белка, содержащего tyl-4 ЦСД на колонке с ошаренной целлюлозой. Как видно из данных, представленных на этом слайде, гибридный белок tyl-4 -ЦСД можно получить электрофоретически чистым в одну стадию на колонке с целлюлозой. При этом он сохраняет свои антигенные свойства по результатам иммуноблотинга. 20

Схема иммобилизации химерного белка GBD-D 5 на полисахариде. гликан химерный белок Такие гибридные белки Схема иммобилизации химерного белка GBD-D 5 на полисахариде. гликан химерный белок Такие гибридные белки были использованы для сборки субъединичных конструкций, приближающих нас к созданию "идеальной вакцины". Для этого на носителе наноразмером ( ), представляющего собой гликан, полученный из дрожжей (в отдельных опытах было показано, что гликан активируюет Toll рецепторы) был иммобилизован с помощью гликаносвязывающего домена антиген лептоспир. 21

Иммуногенные свойства такой конструкции изучали, исследуя циокиновый профиль, иммунизированных животных с помощью жидких биочипов Иммуногенные свойства такой конструкции изучали, исследуя циокиновый профиль, иммунизированных животных с помощью жидких биочипов в варианте биоплекса и, определяя уровень АТ к лептоспирозному АГ. Полученные результаты сравнивали с такими же характеристиками, полученными при иммунизации лептоспирозной инактивированной вакциной и в результате лептоспирозной инфекции. Нановакцина значительно усиливает (в 5 -6 раз) синтез ИЛ-1 альфа в первые 2 -3 суток, что говорит об усилении функциональной активности моноцитов и макрофагов. Резкое увеличение количества ИЛ-4 и 10 говорит об увеличении активности Тхелперов 2 -го типа. Многократно увеличивается количество антител к лептоспирозному АГ. вакцины. 22

Таким образом, в настоящее время мы располагаем рядом технологий, аналогичных тем, что заложены в Таким образом, в настоящее время мы располагаем рядом технологий, аналогичных тем, что заложены в конструкторе "Лего", позволяющим создавать различные комбинации наноконструкций, пригодных для поиска наиболее эффективной на пути создания субъединичной вакцины. 23

Сдерживающим моментом здесь, как и в большинстве наноразработок, имеющих отношение к медицине является отсутствие Сдерживающим моментом здесь, как и в большинстве наноразработок, имеющих отношение к медицине является отсутствие биосовестимых и биодеградируемых наноматериалов, как для создания иммунобиологических препаратов, так и мишень-ориентированной доставки лекарства, всех видов протезирования и т. п. Эту проблему нанобиологического материаловедения с нашей точки зрения необходимо выделить в отдельную подпрограмму в рамках нанотехнологического проекта в стране. 24