Иммунологические основы диагностики инфекционных заболеваний.

Иммунологические основы диагностики инфекционных заболеваний. Специфическая профилактика и терапия инфекционных заболеваний.

План лекции • Общие закономерности и характеристика иммунологичес- ких реакций. • Реакции, основанные на прямом взаимодействии антигена и антитела. • Реакции, основанные на опосредованном взаимодействии антигена и антитела. • Реакции с использованием меченых антигенов и антител. • Классификация препаратов для иммунопрофилактики и иммунотерапии. • Характеристика вакцин. • Характеристика иммунных сывороток. • Особенности применения иммунологических препаратов у отдельных категорий людей.

Общие закономерности иммунологических методов: 1. исследование проводится in vitro; 2. проявляются при гомологичности антитела и антигена; 3. проходят в 2 фазы: 1) невидимая – взаимодействие между антигеном и антителом; 2) видимая – образование крупных агрегатов, которые видны невооружённым глазом.

Условия протекания реакций иммунитета: • наличие антигена; • наличие антитела; • присутствие электролита.

Группы иммунологических методов: • методы, основанные на прямом взаимодействии антигена с антителом; • методы, основанные на опосредованном взаимодействии антигена с антителом • реакции с использованием меченых антигенов или антител.

Механизм реакции агглютинации: а) с Ig. M антителами; б) с Ig. G антителами.

Варианты реакции агглютинации: • реакция агглютинации на предметном стекле в капле сыворотки – ориентировочная; • развёрнутая реакция агглютинации.

Направления использования реакции агглютинации: 1. Определение возбудителя, выделенного от больного: используют как агглютинацию на стекле, так и развёрнутую реакцию. 2. Определение антител в сыворотке крови больного (развёрнутая реакция агглютинации) - к разведени- ям сыворотки больного добавляют диагностикум: • - агглютинация с 0 -диагностикумом (бактерии, убитые нагреванием, сохранившие 0 -антиген) происходит в виде мелкозернистой агглютинации; • - агглютинация с Н-диагностикумом (бактерии, убитые формалином, сохранившие жгутиковый Н-антиген) – в виде крупнохлопчатой, протекает быстрее. 3. Реакция агглютинации для определения групп крови.

Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА) - склеивание эритроцитов антителами за счёт антигенов, адсорбированных на поверхности эритроцитов.

Постановка и учёт РНГА Реакция положительна, если образуется фестончатый осадок ( «кружевной зонтик» ). Реакция отрицательна при образовании осадка в виде пуговки.

Реакция гемагглютинации (прямой) - склеивание эритроцитов гемагглютининами вирусов.

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) - основана на блокаде антигенов (гемагглютининов) вирусов антителами иммунной сыворотки, в результате чего вирусы теряют свойство агглютинировать эритроциты.

Реакция обратной непрямой гемагглютинации (РОНГА) - обнаружение токсинов и бактериальных антигенов в материале при помощи антительных эритроцитарных диагностикумов – эритроцитов, на которых адсорбированы антитела.

Реакция коагглютинации - определение антигенов с помощью антительного диагностикума - антител, адсорбированных на белке А клеток стафилококка.

Реакция Кумбса (антиглобулиновый тест)

Реакция преципитации (от лат. praecipito - осаждать) - это формирование и осаждение комплекса растворимого молекулярного антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом. В реакции преципитации антигеном являются молекулярно-дисперсные вещества, а в реакции агглютинации - корпускулярные. Преципитат образуется только тогда, когда количество антител эквивалентно количеству антигена.

Варианты реакции преципитации: • реакция кольцепреципитации; • реакция преципитации в агаровом геле: – реакция двойной иммунодиффузии (по Оухтер- лони); – реакция радиальной иммунодиффузии (по Ман- чини); • иммуноэлектрофорез.

Реакция кольцепреципитации Ставится в узких преципитационных пробирках: на иммунную сыворотку осторожно наслаивают растворимый антиген. При оптимальном соотношении антигена и антител на границе этих двух растворов образуется непрозрачное кольцо преципитата.

Реакция преципитации в агаре для определения дифтерийного экзотоксина

Реакция радиальной иммунодиффузии (по Манчини) В геле, содержащем антитела, вырезают лунки и заполняют их раствором антигена. Молекулы антигена радиально диффундируют из лунки и, встретившись с антителами, образуют кольцо преципитации.

Иммуноэлектрофорез - сочетание метода электрофореза и иммунопреципи- тации.

Реакция флоккуляции (по Рамону) (от лат. floccus - хлопья шерсти) - появление опалесценции или хлопьевидной массы (иммунопреципитации) в пробирке при реакции токсин-антитоксин или анатоксин-антитоксин. Применяют для определения активности антитоксической сыворотки или анатоксина. Наиболее интенсивная и ранняя (инициальная) флоккуляция – в пробирке, где антиген и антитело содержатся в эквивалентных соотношениях.

Направления использования реакции преципитации: • в судебной медицине – для определения видовой принадлежности белка в кровяных пятнах, сперме и пр. ; • в санитарно-гигиенических исследованиях – для определения фальсификации пищевых продуктов; • реакция термопреципитации по Асколи (в качестве антигенов в реакции используют прокипячённые и профильтрованные экстракты тканей) - для определения антигена при диагностике сибирской язвы.

Реакция связывания комплемента (РСК) - реакция, основанная на взаимодействии антигена и антитела с последующей активацией (связыва- нием) комплемента. Если комплекс антиген-анти- тело не образуется, то комплемент остаётся свободным. РСК проводят в 2 фазы: 1 -ая – невидимая: инкубация смеси, содержащей антиген + антитело + комплемент в термостате 30 мин. или в холодильнике 18 -20 ч. 2 -ая – индикаторная: выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемолитической системы (эритроциты барана + гемолитическая сыворотка, содержащая антитела к эритроцитам).

РСК с сывороткой больного: • в 1 -й фазе реакции при образовании комплекса антиген-антитело происходит связывание им комплемента, и тогда во 2 -й фазе гемолиз сенсибилизированных антителами эритроцитов не произойдет (реакция положительная).

РСК с сывороткой здорового: • 1 -ая фаза: антиген и антитело не соответствуют другу (в исследуемом образце нет антигена или антитела), комплемент остается свободным и во 2 -й фазе присоединится к комплексу эритроцит - антиэритроцитарное антитело, вызывая гемолиз (реакция отрицательная).

Реакция иммунного прилипания Электронная микроскопия (по А. С. Быкову)

Реакция радиального гемолиза Радиальный гемолиз, вызванный антителами к вирусу краснухи: А - положительный контроль с низким титром антител (15 ME), Б - отрицательный контроль (без антител к вирусу)

Реакция нейтрализации (вирусов в культуре клеток) • А - цитопатогенный эффект (ЦПЭ) в результате размножения вирусов; • Б - ЦПЭ отсутствует в результате предварительной нейтрализации вирусов антителами.

Реакции с использованием меченых антигенов или антител: • реакция иммунофлюоресценции; • иммуноферментный анализ; • иммуноблоттинг; • радиоиммунный анализ; • иммуноэлектронная микроскопия.

Прямая РИФ • Микробные антигены связываются со специфическими флюоресцирующими антителами, в результате чего образуются светящиеся комплексы, наблюдаемые при люминесцентной микроскопии. • Недостаток метода: необходимость иметь большой набор сывороток против каждого антигена.

Непрямая РИФ Последовательность метода: 1. Обработка мазка из взвеси микробов антителами антимикробной кроличьей диагностической сыворотки. 2. Обработка мазка анти- глобулиновой (антикро- личьей) сывороткой, меченой флюорохромами. 3. Наблюдение в люминес- центный микроскоп светящегося комплекса (микроб + антимикробные кроличьи антитела + антикроличьи антитела, меченые флюорохромом).

Обнаружение антигена при помощи ИФА 1. Адсорбция специфических антител на твёрдой фазе. 2. Добавление исследуемого материала, в котором предполагается наличие антигена (напр. , сыворотки больного). Промывание луночек планшета. 3. Добавление специфической сыворотки, содержащей антитела против данного антигена 4. Добавление вторичных антител (против диагностической сыворотки), меченых ферментом. 5. Добавление субстрата, по изменению цвета которого оценивают результат.

Обнаружение антител при помощи ИФА 1. Адсорбция специфических антиге- нов на твёрдой фазе. 2. Добавление исследуемого материа- ла, в котором предполагается нали- чие антител (напр. , сыворотки больного). Промывание лунок планшета. 3. Добавление специфической сыво- ротки, содержащей антитела против Ig человека, меченых ферментом. 4. Добавление субстрата, по измене- нию цвета которого оценивают результат.

Радиоиммунный анализ - высокочувствительный метод, основанный на реакции антиген-антитело с применением антигенов или антител, меченых радионуклидом (125 J, 14 C, 3 Н, 51 Сr и др. ). После их взаимодей- ствия отделяют образовавшийся радиоактив- ный иммунный комплекс и определяют его радиоактивность в соответствующем счётчике (бета- или гамма-излучение): интенсивность излучения прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител.

Иммуноблоттинг (схема)

Иммунная электронная микроскопия - это электронная мик- роскопия микроорга- низмов (чаще вирусов), обработанных специ- фическими антителами, мечеными электрон- ноплотным веществом. Вокруг вирионов, обработанных иммун- Вирионы вируса оспы. ной сывороткой, обра- Иммуноэлектронная зуется «венчик» из микроскопия. Негативное меченых антител. контрастирование.

Основные группы биологических препаратов, применяемых для профилактики и терапии инфекционных заболеваний: • вакцины; • иммунные сыворотки и иммуноглобулины; • бактериофаги; • цитокины и другие биологические стимуляторы.

ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРЕПАРАТЫ ЛЕЧЕБНО-ПРОФИЛАКТИЧЕСКИЕ ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ВАКЦИНЫ СЫВОРОТКИ СОДЕРЖАТ АНТИГЕНЫ СОДЕРЖАТ АНТИТЕЛА Д А С И Л Ы А Л В Г Е ОР Ж У Х А А А А А Н Р О И Б И Н С Н Н Н О Г ТК В И М А С Т Т Т С Е И Ы Т И Т О И И И Т Н Е Ы Ч О Ц М Т В И Ы Е Е К И И О И К С С И К К Р У К И Р Р С У М И Н О О И С Ы Е Ы В Б Ч Н ОПРЕДЕЛЯЮТ А Н Е Ы Н Ы С Е А ГЗ А Н Е К Н Т Н Ы И Т И Е Т Г Е СОЗДАЮТ ПАССИВНЫЙ Л Н СОЗДАЮТ АКТИВНЫЙ ИММУНИТЕТ А Ы

Поколения вакцин 1. Живые и убитые. 2. Химические и анатоксины. 3. Рекомбинантные векторные. 4. Пептидные синтетические, антиидиотипические, ДНК-вакцины, содержащие продукты генов главного комплекса гистосовместимости, растительные.

Живые вакцины представляют собой взвесь вакцинных штаммов микроорганизмов, выращенных на различных питательных субстратах. Виды Инфекции, для профилактики которых вакцин применяются вакцины Живые Бруцеллёз, грипп, корь, лихорадка Ку, вакцины жёлтая лихорадка, эпидемический па- ротит, полиомиелит, сибирская язва, туберкулёз, сыпной тиф, туляремия, чума.

Убитые вакцины готовятся из инактивированных вирулентных штаммов бактерий и вирусов, обладающих полным набором необходимых антигенов. Виды Инфекции, для профилактики которых вакцин применяются вакцины Убитые Бешенство, брюшной тиф, грипп, кле- (инактиви- щевой энцефалит, коклюш, холера, рованные) и лептоспироз, гепатит А, сыпной тиф, субъеди- герпес. ничные вакцины

Химические вакцины состоят из антигенов, полученных из микроорганизмов различными способами, преимущественно химическими методами. Вакцины с искусственным адъювантом создаются на основе композиции естественных антигенов и синтетических носителей. Виды вакцин Инфекции, для профилактики которых применяются вакцины Химические Менингококковая инфекция, холера, вакцины брюшной тиф. Вакцины с Грипп (гриппозная вакцина с искусствен- полиоксидонием - Гриппол). ным адъю- вантом

Преимущества живых вакцин перед убитыми и химическими. • Создают прочный и длительный иммуни- тет, по напряжённости приближающийся к постинфекционному иммунитету. • Во многих случаях достаточно одной инъекции вакцины. • Могут вводиться в организм достаточно простым методом (например, скарифика- ционным).

Получение рекомбинантных вакцин Первый путь • Клонирование генов, обеспечивающих синтез необходимых антигенов. • Введение этих генов в вектор. • Введение векторов в клетки-продуценты (вирусы, бактерии, грибы и пр. ). • Культивирование клеток in vitro. • Отделение антигена и его очистка. Второй путь • Применение клеток продуцентов в качестве вакцины.

Анатоксины готовятся из экзотоксинов различных видов микроорганизмов путём их обезвреживания формалином. Виды Инфекции, для профилактики которых вакцин применяются вакцины Рекомби- Гепатит В. нантные вакцины Анатокси- Дифтерия, столбняк, гангрена, боту- ны лизм, холера, стафилококковые и синегнойные инфекции.

Вакцины, выпускаемые в Российской Федерации Виды Инфекции, для профилактики которых вакцин применяются вакцины Комплек- АКДС, гриппозная вакцина из 3 цирку- сные лирующих штаммов вируса гриппа, трёх- вакцины валентная полиомиелитная, пневмокок- ковая (включает 23 серотипа пневмокок- ка), менингококковая (включает антиге- ны 4 серотипов менингококка), комплек- сная вакцина из условно-патогенных микробов, для профилактики кори, паро- тита и краснухи.

Вакцина должна удовлетворять следующим требованиям • Должна активировать вспомогательные клетки, участвующие в процессинге и презентации антигена. • Должна содержать эпитопы для Т- и В-клеток, обес- печивающие необходимое соотношение клеточного и гуморального иммунитета. • Должна легко подвергаться процессированию, её эпитопы должны обладать способностью взаимодей- ствовать с антигенами МНС I и (или) II класса. • Должна индуцировать образование регуляторных, эффекторных клеток иммуннологической памяти.

Способы повышения иммуногенности вакцин • Очистка от низкомолекулярных веществ, способных вызывать специфическую или неспецифическую супрессию иммунного ответа. • Агрегация антигена с помощью ковалентного связывания и других методов комплексообразования. • Включение в вакцину максимального количества эпитопов антигена. • Сорбция на веществах, создающих депо антигена (гидроокись алюминия, фосфат кальция и пр. ). • Смешивание с маслом (водно-масляные эмульсии). • Добавка микробных растительных и других видов адъювантов. • Усиление иммуногенных свойств вакцины с помощью искусственных носителей-адъювантов (полиоксидоний и др. ). • Включение антигена в микрокапсулы, обладающие адъювантными свойствами и обеспечивающие выброс антигена через заданный промежуток времени. • Улучшение условий процессинга и презентации антигена. Использование антигенов МНС I или II класса или антител к этим антигенам.

Побочные реакции после иммунизации • Побочные реакции, вызванные вакциной. • Побочные реакции, спровоцированные вакциной. • Побочные реакции, связанные с ошибками при вакцинации. • Побочные реакции, возникающие при случайном совпадении с вакцинацией.

Побочное действие вакцин – способность вакцин вызывать функциональные и морфологические изменения в организме, не связанные с формированием иммунитета.

Виды побочного действия вакцин • Фармакологическое действие вакцин. • Поствакцинальный инфекционный процесс. • Туморогенное действие. • Образование антител к непротективным антигенам вакцин. • Аллергия: – к антигенам вакцин; – к примесям и добавкам вакцин; – к экзоаллергенам, не связанным с вакциной. • Иммуномодулирующее действие вакцин: – действие антигенов вакцин; – действие сорбентов, носителей и пр. ; – действие цитокинов, присутствующих в вакцинах. • Аутоиммунные состояния. • Иммунодефицитные состояния. • Психогенное действие вакцин.

Поствакцинальные реакции – клинические и лабораторные признаки нестойких патологических изменений в организме, связанные с вакцинацией.

Поствакцинальные осложнения – клинические проявления стойких патологических изменений в организме, связанные с вакцинацией. Наиболее частые поствакцинальные осложнения: токсические, аллергические реакции, поражение нервной системы.

Медицинские противопоказания к вакцинации • Абсолютные (первичный иммунодефицит, ВИЧ-инфекция, злокачественные болезни, тя- жёлые реакции на предыдущую прививку, тя- жёлые формы аллергических заболеваний, постгредиентная неврологическая патология). • Временные (острые проявления заболевания и обострение хронических заболеваний). • Ложные.

Вакцины будущего • Мукозальные вакцины. • Генноинженерные вакцины. • Синтетические пептидные вакцины. • ДНК-вакцины. • Антиидиотипические вакцины. • Вакцины, содержащие продукты генов гистосовместимости. • Растительные вакцины. • Новые комплексные вакцины. • Микрокапсулированные вакцины.

Разрабатывается концепция экстренной защиты от патогенов (часы) основана на предположении, что стимуляция созревания дендритных клеток с помощью носителей PAMPs (иммуномодуляторов бактериального происхождения) приведёт к активации эффекторных механизмов врождённого иммунитета (24 часа) и формированию протективного иммунитета против конкретного патогена (7 -14 дней).

Иммунотерапия – стимуляция, восстановление или исправление иммунных структур, временное замещение или подавление иммунного ответа и т. п.

Вакцинотерапия • Для лечения вирусных, бактериальных и парази- тарных заболеваний (бруцеллёзная, герпетическая, гонококковая, поликомпонентная из антигенов условно-патогенных микробов, протейная, стафилококковый анатоксин, стафилококквый антифагин, стафилококковые вакцины). • Для лечения соматических заболеваний различной этиологии (рассеянный склероз, диабет, наркомания и др. ). • Для лечения онкологических заболеваний (БЦЖ ( «Имурон» ) – для лечения рака мочевого пузыря). • Аллерговакцины (лечебные аллергены, аллерго- иды).

Серотерапия – использование иммунных сывороток или препаратов иммуноглобулинов. Сывороточные препараты, применяемые для профилактики и лечения инфекционных заболеваний • Гетерологичные (применяются в основном для экстренной профилактики и лечения токсинемичес- ких и некоторых вирусных (бешенство, клещевой энцефалит, японский энцефалит, лихорадка Эбола) и бактериальных (сибирская язва, лептоспироз) ин- фекций). • Гомологичные плазма противопротейная, антистафилококковая и плазма против синегнойной палочки; иммуноглобулин нормальный; специфические иммуноглобулины.

Применение медицинских биологических препаратов у беременных женщин • Бактериофаги. • Пробиотики. • Гомологичные иммуноглобулины. • Гетерологичные иммуноглобулины – по жизненным показаниям. • Вакцины: антирабическая культуральная, против жёлтой лихорадки, АДС-М, АД-М и АС анатоксины.

Методы введения вакцин и сывороток • Внутрикожный. • Подкожный. • Накожный. • Внутримышечный. • Внутривенный. • Безыгольный. • Аэрозольный. • Энтеральный.