Грайфер Дмитрий Маратович д. х. н. ,

Скачать презентацию Грайфер  Дмитрий Маратович д. х. н. , Скачать презентацию Грайфер Дмитрий Маратович д. х. н. ,

lekciya_biosintez_belka_dlya_4-5-go_kursa.ppt

  • Размер: 12.8 Мб
  • Автор:
  • Количество слайдов: 57

Описание презентации Грайфер Дмитрий Маратович д. х. н. , по слайдам

Грайфер  Дмитрий Маратович д. х. н. , в. н. с. Лаборатории структуры иГрайфер Дмитрий Маратович д. х. н. , в. н. с. Лаборатории структуры и функции рибосом БИОСИНТЕЗ БЕЛКА

Рибосома - сложнейшая молекулярная машина клетки, ее функция состоит в том, чтобы переводить (транслировать)Рибосома — сложнейшая молекулярная машина клетки, ее функция состоит в том, чтобы переводить (транслировать) генетическую информацию, скопированную с ДНК в качестве матричной РНК, в полипептидные цепи белков. Эта функция одинакова во всех организмах от бактерий до человека. DNAДНК м. РНК Полипептидная цепь рибосома

м. РНК Общие черты строения: односпиральность,  направление чтения и написания 5 ’-3’, м. РНК Общие черты строения: односпиральность, направление чтения и написания 5 ’-3’, НТП, старт-кодон, кодирующая последовательность, стоп-кодон, 3 ’- НТП м. РНК прокариот: ШД-послед-ти расположены за 3 -10 нт перед стар-кодоном. Они богаты пуринами и частично комплементарны пиримидин-богатым 3′-концевым послед-тям р. РНК малых субчастиц

Особенности м. РНК эукариот : 1. Одноцистронные 2. Нет ШД-послед-тей. 3. Кэп на 5Особенности м. РНК эукариот : 1. Одноцистронные 2. Нет ШД-послед-тей. 3. Кэп на 5 ’- конце. 4. 4. Поли(А) – послед-ть на 3 ’- конце. Полицистронными являются также геномные РНК некоторых вирусов (например, вируса гепатита С.

Структура кэпа Структура кэпа

т. РНК – сходство у всех организмов  Инициаторные т. РНК аминоацилируются только остаткамит. РНК – сходство у всех организмов Инициаторные т. РНК аминоацилируются только остатками Met и «работают» только на стадии инициации: остатки Met для встраивания в синтезируемую полипептидную цепь (кроме самого первого) переносит «обычная» метиониновая т. РНК. Отличительная особенность прокариотической инициаторной т. РНК состоит в том, что она формилируется по N-концевой аминогруппе остатка Met специальными ферментами.

Факторы трансляции - одно- или многосубъединичные белки, подразделяющиеся на факторы инициации (IF),  факторыФакторы трансляции — одно- или многосубъединичные белки, подразделяющиеся на факторы инициации (IF), факторы элонгации (EF) и факторы терминации (RF от англ. releasing factor – «фактор освобождения синтезированного полипептида из рибосомы» ). Внутри групп каждый фактор дополнительно обозначается цифрами или буквами, следующими после сокращения IF, EF или RF. Перед названиями соответствующих факторов эукариот ставят букву «е» (eukaryotic), например, e. IF 2.

Инициация – процесс, приводящий к образованию комплекса, в котором старт-кодон AUG находится в пептидильномИнициация – процесс, приводящий к образованию комплекса, в котором старт-кодон AUG находится в пептидильном (Р) – участке рибосомы. Принципиальные отличия инициации на рибосомах эукариот. 1. Инициаторная метиониновая т. РНК НЕ формилирована. 2. Отличия в устройстве м. РНК – кэп на 5 ’- конце, наличие поли(А)-хвоста на 3 ’- хвосте, отсутствие последовательностей Шайна – Далгарно. 3. Значительно усложненный механизм инициации с участием намного большего числа факторов. 4. Зачем нужен настолько усложненный путь инициации у эукариот?

Схема инициации у прокариот Схема инициации у прокариот

Схема инициации у эукариот IF 1 IF 3 (функц. аналог) IF 2 e. IFСхема инициации у эукариот IF 1 IF 3 (функц. аналог) IF 2 e. IF 4 F – кэп-связывающий комплекс факторов e. IF 4 E – кэп-узнающий белок e. IF 4 A – АТР-зависимая хеликаза e. IF 4 G замыкает PABP и e. I

e. IF 4 A – АТР-завис. геликаза e. IF 4 B , Н –e. IF 4 A – АТР-завис. геликаза e. IF 4 B , Н – ассистируют ей E e. IF 4 E- Кэп-связывающий белок

Образование тройного комплекса и замена GDP на GTP  в e. IF 2 GDPОбразование тройного комплекса и замена GDP на GTP в e. IF 2 GDP

Активируется в стрессовых условиях (тепловой шок,  голодание и т. д. ) Образуется прочныйАктивируется в стрессовых условиях (тепловой шок, голодание и т. д. ) Образуется прочный комплекс, где оказывается связанным весь e. IF 2 B клетки, поэтому замена GDP на GTP в комплексе с e. IF 2 не происходит. 40 S 6 0 S пептид Пример регуляции трансляции на стадии инициации. Тотальная репрессия трансляции в результате фосфорилирования факторов инициации (в частности, e. IF 2) у эукариот.

Факторы инициации эукариот Фактор Гомологи Бакт  Археи Субъединицы Функции e. IF 1 1Факторы инициации эукариот Фактор Гомологи Бакт Археи Субъединицы Функции e. IF 1 1 (13 k. Da) Предотвращает инициацию на неправильном кодоне или в плохом контексте (функц. аналог IF 3) e. IF 1 A 1 (16 k. Da) IF 1 Помогает e. IF 1 в селекции старт-кодона и вовлекает e. IF 5 Bнет e. IF 2 нет (30 -50 k. Da ГТФаза образует 3 -ной комплекс с GTP и Met- т. РНК, играет ключ. роль в селекции старт-кодона e. IF 2 B нет (30 -50 k. Da Обменивает GDP на GTP в e. IF 2 и тем самым реактивирует его e. IF 3 нет 8 -11 ( 800 k. Da) Стимулирует связ- 3 -ного комплекса, участвует в сканировании, пре-пятствует раннему связыванию 60 S e. IF 4 А нет 1 (46 k. Da) АТФаза, расплетающая м. РНК с 5 ’- конца e. IF 4 B нет 1 (69 k. Da) Ассистирует e. IF 4 Aa. IF 1 A a. IF 2 B нет a. IF 4 А нет

Фактор Субъединицы Функции e. IF 4 E нет 1 ( 25 k. Da) СвязываетсяФактор Субъединицы Функции e. IF 4 E нет 1 ( 25 k. Da) Связывается с кэпом e. IF 4 F нет Комплекс e. IF 4 E, A и G Расплетает 5’-концевую часть м. РНК и обеспечивает посадку туда 43 S e. IF 4 G нет 1 (17 5 k. Da) Связывается с e. IF 4 E, e. IF 4 A, e. IF 3, PABP и m. RNA and усиливает геликазную активность of e. IF 4 A e. IF 5 нет 1 (50 k. Da) e. IF 5 B IF 2 1 (140 k. Da) ГТФаза, осуществляющая ассоциацию с 60 SАктивирует ГТФазную активность e. IF 2 предотвращает диссоциацию GDP c e. IF 2 DHX 29 нет Доп. Фактор — расплетает 5’-конц. часть м. РНК у высших эукариот e. IF 6 нет 1 1 Связывается с 60 S и не дает ей преждеврем. ассоциировать с 40 SГомологи Бакт Археи нет нет a. IF 5 B нет a. I

Цикл элонгации. e. EF 1 – EF-Tu e. EF 2 – EF-G Аналогичны поЦикл элонгации. e. EF 1 – EF-Tu e. EF 2 – EF-G Аналогичны по функции, но не работают в гетерологичных системах

2.  Цикл элонгации полипептидной цепи. 2. Цикл элонгации полипептидной цепи.

Р-участок А-участок. Схема образования пептидной связи Р-участок А-участок. Схема образования пептидной связи

3.  Терминация трансляции наступает, когда в аминоацильном (А)-участке оказывается один из 3 -х3. Терминация трансляции наступает, когда в аминоацильном (А)-участке оказывается один из 3 -х стоп кодонов – UGA, UAG или UAA. RF от англ. Releasing factor RF 1 -го класса: У эукариот — e. RF 1 архей a. RF 1 У бактерий : RF 1 узнает кодоны UAA и UAG , а RF 2 – кодоны UAA и UGA. Функции RF 1 -го класса — запуск гидролиза сложноэфирной связи между пептидильным остатком и молекулой т. РНК в P-участке рибосомы (освобождение синтезированного полипептида).

Молекулярная мимикрия – сходство структуры RF и т. РНК.  Связываясь с рибосомой, Молекулярная мимикрия – сходство структуры RF и т. РНК. Связываясь с рибосомой, RF одним своим фрагментом, напоминающим антикодоновую шпильку т. РНК, узнает стоп-кодон, а другой его фрагмент, похожий на акцепторный конец, оказывается в пептидилтрансферазном центре. Отсутствие гомологии между бактериальными и эукариотическими факторами Факторы терминации 2 -го класса – активируемые рибосомой GTP азы. RF 3 e. R

100  Å anticodon CCA-3’end 76Å т. РНКe. RF 1 >100 Å anticodon CCA-3’end 76Å т. РНКe. R

Субчастицы готовы к реинициации на этой же м. РНК или к инициации трансляции новойСубчастицы готовы к реинициации на этой же м. РНК или к инициации трансляции новой м. РНК. Общая схема

Характерные особенности терминации у прокариот : 1) освобождение синтезированного полипептида происходит до гидролиза GTPХарактерные особенности терминации у прокариот : 1) освобождение синтезированного полипептида происходит до гидролиза GTP и без участия RF 3; 2) гидролиз GTP необходим для диссоциации RF 3 с рибосомы; 3) посттерминационный комплекс рибосом, содержащий RF 1/RF 2, выступает в роли фактора, обменивающего GDP на GTP в комплексе с RF 3. 4) RF 3 не требуется для гидролиза пептидил-т. РНК; вообще клетка может существовать и без этого фактора.

У эукариот оба фактора терминации действуют кооперативно и скоодинированно: 1) e. RF 1 имеетУ эукариот оба фактора терминации действуют кооперативно и скоодинированно: 1) e. RF 1 имеет высокое сродство к e. RF 3, и оба фактора образуют комплекс перед тем, как попасть на рибосому; 2) гидролиз GTP фактором e. RF 3 необходим для быстрого и эффективного гидролиза пептидил-т. РНК фактором e. RF 1.

Гидролиз GTP приводит к изменению конформации терминационного комплекса таким образом, что универсальная для всехГидролиз GTP приводит к изменению конформации терминационного комплекса таким образом, что универсальная для всех организмов последовательность GGQ фактора e. RF 1, отвечающая за индукцию гидролиза пептидил-т. РНК, оказывается в пептидилтрансферазном центре рибосомы.

Рециклинг -  диссоциация м. РНК и деацилированной т. РНК и последующая диссоциация рибосомРециклинг — диссоциация м. РНК и деацилированной т. РНК и последующая диссоциация рибосом на субчастицы, которые затем снова участвуют в процессе трансляции. У прокариот есть специальный RRF, который, действуя совместно с EF-G, диссоциирует рибосому на субчастицы. м. РНК, которая может оставаться связанной с 30 S субчастицей, удаляется из нее фактором инициации IF 3.

У эукариот и архей  специализированного фактора рециклинга нет. Диссоциация 80 S рибосом эукариотУ эукариот и архей специализированного фактора рециклинга нет. Диссоциация 80 S рибосом эукариот на субчастицы после завершения терминации трансляции просходит при участии факторов инициации e. IF 3 и e. IF 6; диссоциацию м. РНК с 40 S субчастицы вызывает фактор e. IF 3 j, а диссоциацию т. РНК – фактор e. IF 1. Недавно показано, что при [Mg 2+]>1 m. M диссоциацию 80 S на 40 S+60 S вызывает белок ABCE 1.

Отклонения от канонических правил 1. Неканоническая инициация – трансляционные энхансеры в м. РНК иОтклонения от канонических правил 1. Неканоническая инициация – трансляционные энхансеры в м. РНК и IRES – элементы некоторых вирусных и клеточных м. РНК. 2. Прочтение стоп-кодонов как смысловых: селенопротеиновые м. РНК и вариантный генетический код в силиатах ( инфузориях). Причины этого. Примеры – у Stilonichia Paramecium стоп кодон только UGA, а кодоны UAA и UAG кодируют глутамин.

 Аминокислота селеноцистеин - биологическая форма селена.  Ее кодирует триплет UGA , Аминокислота селеноцистеин — биологическая форма селена. Ее кодирует триплет UGA , являющийся обычно стоп-кодоном. Специальный механизм, благодаря которому происходит включение селеноцистеина в растущий полипептид, использует специфический структурный район в 3 ‘ -НТО м. РНК — SECIS ( от англ. Selenocysteine Insertion Sequence) и белковые факторы ( SBP 2 , EFSec и др. ). SECIS может быть расположен на расстоянии нескольких сотен нуклеотидов от UGA- кодона. AAAAAAA AUG EFSec. Sec SBP 2? stop. SECIS м. РНК 5 ‘ 3 ‘ Sec- т. РНК GUG UG

IRES- элемент РНК вируса гепатита С-  IRES (Internal Ribosome Entry Site) – оченьIRES- элемент РНК вируса гепатита С- IRES (Internal Ribosome Entry Site) – очень своеобразный высокоструктурированный элемент вирусной РНК перед старт-кодоном. Он отвечает за инициацию трансляции вирусной РНК «в обход» клеточных регуляторных механизмов 5’ 3’Внутренняя инициация трансляции – для некэпированных геномных РНК некоторых вирусов AUG попадает в Р-сайт прямо, без сканирования

  Последовательность событий при инициации трансляции РНК вируса гепатита С.  Бинарный комплекс Последовательность событий при инициации трансляции РНК вируса гепатита С. Бинарный комплекс Рибосома, готовая трансли- ровать РНК вируса

S 3 a G 263, A 275 (IIId)    Результаты, полученные сS 3 a G 263, A 275 (IIId) Результаты, полученные с помощью IRES -производных В связывании IRES участвуют рибосомные белки но не р. РНК.

Вход м. РНКВыход м. РНКУчастки связывания IRES и м. РНК на рибосоме S 3Вход м. РНКВыход м. РНКУчастки связывания IRES и м. РНК на рибосоме S 3 a

Выход синтезированного полипептида из рибосомы Сигнал-узнающая частица SRP распознает специальную сигнальную последовательность в синтезируемомВыход синтезированного полипептида из рибосомы Сигнал-узнающая частица SRP распознает специальную сигнальную последовательность в синтезируемом полипептиде, как только эта последовательность появляется на выходе из рибосомы. SRP — консервативный рибонуклеопротеид, состоящий из 7 S РНК (в прокариотах 4. 5 S р. РНК) и нескольких белков. Связываясь с этой последовательностью, SRP вызывает паузу в элонгации , во время которой рибосома закрепляется своей большой субчастицей на специальном рецепторе для SRP на мембране, после чего SRP способствует транслокации (перемещению) полипептида через мембрану.

Крио-электронное изображение комплекса транслирующей эукариотической рибосомы с SRP . Обозначены субчастицы,  т. РНККрио-электронное изображение комплекса транслирующей эукариотической рибосомы с SRP . Обозначены субчастицы, т. РНК ( t. RNA ), SRP и белок-рецептор SR , способствующий переносу рибосомы на транслокон. Сигнальная последовательность синтезированного полипептида на этом изображении закрыта центральной частью S -домена SRP

Трансмембранный канал для транслокации полипептида в ЭР Образован кольцеобразной олигомерной белковой структурой,  состоящейТрансмембранный канал для транслокации полипептида в ЭР Образован кольцеобразной олигомерной белковой структурой, состоящей из трех или четырех частиц так называемого «Sec 61 p-комплекса» , содержащего a-субъединицу с десятью трансмембранными (ТМ)-доменами и две меньшие b- и g-субъединицы, в каждую из которых входит по одному трансмембранному домену. Эта кольцеобразная структура, которую иногда называют «транслоконом» , эволюционно консервативна (в прокариотах соответствующий комплекс называется Sec. YEG или Sec. Y).

Сравнительная характеристика рибосом про- и эукариот Субчастицы :  малая – 40 S (1.Сравнительная характеристика рибосом про- и эукариот Субчастицы : малая – 40 S (1. 4 м. Да) большая — 60 S (ок. 3 м. Да) Компоненты субчастиц : белки, р. РНК, полиамины (спермин, спермидин, путресцин) и ионы К+ и М g 2+. Все рибосомы эукариот содержат одинаковый набор р. РНК и белков. Содержание и количественный состав полиаминов зависит от природы организма и типа ткани. Обратимая диссоциация рибосом на субчастицы. Рибосома : эукариоты – 80 S мол. масса 4 – 4. 5 м. Да, примерно в 1. 5 раза больше, чем 70 S рибосома прокариот

Рибосома высших организмов Рибосома бактерий 28 S р. РНК  3500 -5000 нт ,Рибосома высших организмов Рибосома бактерий 28 S р. РНК 3500 -5000 нт , 5. 8 S р. РНК , 5 S р. РНК , 4 7 белков 18 S р. РНК 1800 нт , 3 3 белка 23 S р. РНК 3000 нт, 5 S р. РНК , 34 белка 16 S р. РНК 1500 нт , 23 белка 24 нм 20 нм. Сравнительная характеристика рибосом про- и эукариот

Гомология между структурными элементами 7 0 S и 80 S рибосом Гомология между р.Гомология между структурными элементами 7 0 S и 80 S рибосом Гомология между р. РНК прокариот и эукариот Степень гомологии первичных и вторичных структур 5. 8 S р. РНК – гомолог 5 ’- концевого района 23 S р. РНК Консервативный «кор» вторичной структуры р. РНК Роль р. РНК в оганизации декодирующего центра и. ПТЦ.

Консервативные положения и сегменты экспансии во вторичной стуктуре р. РНК, изображенные на структуре 16Консервативные положения и сегменты экспансии во вторичной стуктуре р. РНК, изображенные на структуре 16 S E. coli. Большие кружки – положения, всегда присутствующие в универсальном коре вторичной структуры. Сегменты экспансии нумерованы и обведены прямоугольниками.

Гомологичные рибосомные белки : Невысокая степень гомологии аминокислотных последовательностей  и большое сходство пространственныхГомологичные рибосомные белки : Невысокая степень гомологии аминокислотных последовательностей и большое сходство пространственных структур гомологичных белков в рибосомах про- эукариот. Высокая степень сходства последовательностей между гомологичными рибосомными белками эукариот.

Качественные различия между рибосомами про- и эукариот 1. Рибосомы эукариот невозможно собрать in vitroКачественные различия между рибосомами про- и эукариот 1. Рибосомы эукариот невозможно собрать in vitro из набора рибосомных белков и р. РНК. 2. Рибосомы эукариот на сегодняшний день не удалось закристаллизовать для рентгеноструктурного анализа.

Сборка субчастиц прокариот Сборка субчастиц прокариот

Методы изучения строения рибосомы и ее функциональных центров Строение малой субчастицы рибосом  ThermusМетоды изучения строения рибосомы и ее функциональных центров Строение малой субчастицы рибосом Thermus thermophilus по данным РСА. Полипептидные цепи белков и полинуклеотидные цепи р. РНК изображены ленточками. Рибосомные белки (в которых видны участки α -спиралей) выделены разными цветами и подписаны, р. РНК отмечена серым цветом.

Электронная микроскопия Футпринтинг Аффинная модификация Электронная микроскопия Футпринтинг Аффинная модификация

Типы аналогов м. РНК Типы аналогов м. РНК

Функциональные центры рибосомы и принципы их организации 1) участки связывания каждого из участников процессаФункциональные центры рибосомы и принципы их организации 1) участки связывания каждого из участников процесса трансляции (для молекул т. РНК – их три – А-, Р- и Е-участки); 2) декодирующий центр, где рибосома распознает «правильный» комплементарный комплекс кодона м. РНК с антикодоном аа-т. РНК в А-участке; 3) пептидилтрансферазный центр (ПТЦ), где происходит катализ образования пептидной связи при элонгации и гидролиз сложноэфирной связи между синтезированным пептидом и т. РНК при терминации; 4) так называемый GTPаза-активирующий центр (ГАЦ), который отвечает за стимуляцию GTP азной активности факторов трансляции; 5) участки связывания факторов трансляции.

Строение ПТЦ у прокариот Строение ПТЦ у прокариот

Динамичность структуры рибосомы При узнавании правильного кодон-антикодонового дуплекса аа-т. РНК с кодоном м. РНКДинамичность структуры рибосомы При узнавании правильного кодон-антикодонового дуплекса аа-т. РНК с кодоном м. РНК в А-участке малая субчастица принимает «закрытую» конформацию, в которой «голова» малой субчастицы наклоняется к телу и к большой субчастице, что и запускает цепь конформационных перестроек, приводящих, в конечном счете, к активации GTP азной активности фактора EF — Tu. При связывании EF — G голова малой субчастицы поворачивается определенным образом относительно тела, а после транслокации и ухода деацилированной т. РНК – возвращается в исходное положение. Движения регулярно повторяются в каждом цикле элонгации, поэтому их и назвали «шестеренкоподобными» ,

Алкалоид рицин расщепляет одну-единственную фосфодиэфирную связь в 23 S р. РНК в так называемойАлкалоид рицин расщепляет одну-единственную фосфодиэфирную связь в 23 S р. РНК в так называемой «сарцин-рициновой» петле (район GTP аза-активирующего центра), что лишает р. РНК конформационной подвижности и в результате приводит к полной инактивации всей огромной рибосомы.

Рибосома и антибиотики Аминогликозиды узнают с высокой специфичностью структуру декодирующего центра 16 S р.Рибосома и антибиотики Аминогликозиды узнают с высокой специфичностью структуру декодирующего центра 16 S р. РНК (по принципу «ключ-замок» ), в результате чего рибосома перестает распознавать «правильную» аминоацил-т. РНК и резко возрастает частота включения «неправильных» аминокислотных остатков в синтезируемый белок.

Структуры аминогликозидных антибиотиков неомицина (А), канамицина (В) и стрептомицина (С) Структуры аминогликозидных антибиотиков неомицина (А), канамицина (В) и стрептомицина (С)

Макролиды, содержащие 14 -16 -членное лактоновое кольцо,  остатки сахара и боковые заместители, взаимодействуютМакролиды, содержащие 14 -16 -членное лактоновое кольцо, остатки сахара и боковые заместители, взаимодействуют с нуклеотидами 23 S р. РНК, образующими ближайшую к ПТЦ часть «пептидного канала» , и тем самым останавливают синтез белка

Структуры некоторых антибиотиков,  наложенные на их участки связывания во фрагменте 50 S Структуры некоторых антибиотиков, наложенные на их участки связывания во фрагменте 50 S субчастицы в районе ПТЦ. Срез субчастицы, обращенный к малой субчастице, окрашен в серый цвет. Оранжевым цветом показан модельный 3’-концевой фрагмент пептидил-т. РНК в Р-участке.