ГЕНОМ ПРО- И ЭУКАРИОТ Новосибирск 2012 Регуляторные последовательности

Регуляторные последовательности и их роль Генетические заболевания связанные с нарушениями в регуляторной области генов

Регуляторные последовательности По расположению относительно старта транскрипции: 5’-концевые регуляторные последовательности 3’-концевые регуляторные последовательности Энхансеры, сайленсеры и инсуляторы…

Регуляторные последовательности Прокариоты: проксимальные элементы (промотор, оператор) дистальные элементы терминаторы Эукариоты Структура и функционирование прокариотического оперона. Структура и функционирование эукариотического гена.

Прокариоты – регуляторные элементы Промотор - это регуляторная последовательность, предшествующая кодирующей части гена, которую узнает фермент РНК-полимераза. Основной элемент промотора - место связывания РНК-полимеразы, которое она занимает перед началом синтеза РНК. В состав промоторов могут входить также участки связывания белков-регуляторов. Присутствует как у прокариот, так и у эукариот. Оператор – это регуляторная последовательность связывания белка–репрессора. Если репрессор присоединен к оператору, то РНК-полимераза не может двигаться вдоль молекулы ДНК и синтезировать мРНК.

Транскрипция Кодирующая цепь Сайт старта транскприпции +1 –35 послед-ть –10 послед-ть Промотор G T C A T A C G A T A T T A T A T A T A A T A T A T 3¢ 5¢ 5¢ 5¢ 3¢ 3¢ RNA A Прокариоты – базальный промотор

Прокариоты – базальный промотор Большинство базальных промоторов содержат -35 и -10 элементы, но существуют дополнительно UP элемент и промоторы которые c удлиненным -10 элементом. Консенсусная последовательность базального промотора в зависимости от типа сигма-фактора у E.coli

Прокариоты – базальный промотор –35 region –10 region lac operon Consensus lacI trp operon rrnX recA lexA tRNAtyr Transcribed +1 TTTACA TATGTT A N6 GCGCAA CATGAT A N7 TTGACA TTAACT A N7 TTGTCT TAATAT A N7 TTGATA TATAAT A TTCCAA TATACT A TATGAT TTGACA TATAAT A N16 TTTACA N16 N17 N16 N17 N17 N17 N7 N7 N6

Прокариоты – UP элемент UP элемент – АТ богатый район, представленный в сильных промоторах. Элемент взаимодействует с С – концевым доменом РНК полимеразы. Промоторы можно разделить на две группы: Конститутивные – промоторы генов, которые транскрибируются постоянно (рРНК, рибосомальных белков, РНК полимераз) Индуцируемые – промоторы генов, транскрибируемые при определенных условиях, на определенной стадии. Именно они подвергаются регуляции с различных регуляторных элементов.

Прокариоты - регуляция промоторов Различают несколько типов регуляции у бактерий: В первую очередь – позитивный и негативный контроль. При позитивном контроле транскрипция оперона включается, при негативном – выключается. Ключевым регулирующим элементом при данном типе регуляции является оператор. В отличие от промотора, оператор представляет собой уникальную последовательность для связывания либо с белком-активатором (позитивная регуляция), либо с белком-супрессором (негативная регуляция). Оператор arg оперона E. coli, известный так же как ‘arg Regulon’. Аргинин действует как ко-супрессор и связывается с белком-супрессором ArgR. Подавление транскрипции сильно зависит от концентрации аргинина в клетке.

Прокариоты - регуляция промоторов Негативный контроль на примере lac оперона

Прокариоты - регуляция промоторов Позитивный контроль на примере lac оперона

Прокариоты - регуляция промоторов Комплексная регуляция lac оперона

Прокариоты - регуляция промоторов Регуляторные последовательности lac оперона

Прокариоты – дистальные элементы Энхансер (ген-усилитель) – короткий сегмент ДНК, который влияет на уровень проявления (экспрессии) определённых генов, увеличивая частоту инициации и транскрипции. Энхансер-зависимая инициация транскрипции у прокариот. Энхансер-зависимые промоторы прокариот отличаются по составу последовательности от классических.

Прокариоты – дистальные элементы Энхансер-зависимая регуляция транскрипции – довольно распространенное явление в царстве прокариот.

Прокариоты – терминаторы Классические терминаторы - содержат GC-богатый участок, обладающий центральной симметрией, вслед за которым располагается последовательность нуклеотидов, состоящая из выстроенных подряд четырех-восьми остатков A, в матричной цепи ДНК. Rho -независимая терминация Эффективность терминации транскрипции на таком терминаторе зависит от стабильности терминаторной шпильки РНК

rho utilization site Rho protein is a helicase r-зависимая терминация Прокариоты – терминаторы

Прокариоты – терминаторы

Прокариоты – терминаторы (аттенюация) Аттенюация на примере trp оперона

Эукариоты – регуляторные элементы Цис - регуляторные элементы (cis-regulatory elements) - участки ДНК расположенные в непосредственной близости от структурной части гена, способные связываются с регуляторными молекулами и регулировать экспрессию гена. Цис - регуляторные ДНК элементы в составе генов, транскрибируемых РНК полимеразой II

Базальный промотор – короткая последовательность ДНК, необходимая для РНК-полимераза II-зависимой транскрипции. Коровый промотор имеет длину ~ 35-40 п.о. и содержит определенные ДНК мотивы: TATA box Инициаторный элемент Initiator element (Inr) Регуляторный элемент, располагающийся ниже старта транскрипции (Downstream core promoter element) Downstream Promoter Element (DPE) TFIIB распознающий элемент (BRE) Motif Ten Element (MTE) Эукариоты – базальный промотор TATA box Базальный промотор для РНК-полимеразы II или TATA-box.

Виды базальных промоторов: Инициаторный элемент (Initiator element (Inr)) TFIIB распознающий элемент (BRE) Регуляторный элемент, располагающийся ниже старта транскрипции (Downstream core promoter element (DCE)) Motif Ten Element (MTE) Downstream Promoter Element (DPE) Эукариоты – базальный промотор Базальные промоторные элементы Maston et al., 2006

У Drosophila melanogaster существует большая группа промоторов РНК-полимеразы II, не содержащих ТАТА бокса. Было замечено, что для осуществления транскрипции с таких промоторов необходима область от +1 до +40 от старта инициации транскрипции. Она была названа DPE (Downstream Promoter Element). Консенсусная последовательность DPE промоторов; наиболее важен нуклеотид G в положении +24 (вне области DPE консенсуса). Для работы DPE промотора критично наличие интактного инициаторного элемента (Inr). Эукариоты – базальный промотор Burke and Kadonaga, 2012

Эукариоты – «другие» базальные промоторы тРНК, 5S РНК и 7SL РНК гены транскрибируются при помощи РНК-полимеразы III, промотор которой значительно отличается от промотора РНК-полимеразы II. В отличие от промоторов РНК-полимеразы II, промоторы РНК-полиеразы III – внутренние, то есть находятся в составе кодирующей части гена и транскрибируются. Существуют и другие варианты промоторов…

Проксимальный промотор – регуляторный район, расположенный непосредственно перед коровым промотором и содержащий множество сайтов связывания с активаторами. Эукариоты –проксимальные элементы CpG островки – регуляторные последовательности, имеющие длину от 500 до 2000 п.о. (не менее 200 п.о.) и GC состав более 50%. Схема регуляции взаимодействия энхансера с коровым промотором с помощью проксимального промоторного элемента у Drosophila Calhoun et al., 2002; Fuks et al., 2003 Регуляция транскрипции через метилированные CpG островки

Энхансер, «промоторы для промоторов» - специфическая регуляторная последовательность ДНК, расположенная удаленно от базального промотора гена - мишени и осуществляющая функцию активации транскрипции через связывание различных транскрипционных факторов. Эукариоты – дистальные элементы, энхансеры Особенности энхансеров Энхансеры представляют собой тесно сгруппированные кластеры сайтов связывания транскрипционных факторов Пространственная организация и ориентация сайтов транскрипционных факторов в составе энхансера оказывает влияние на регуляторную активность Функция не зависит от расстояния между энхансером и промотором регулируемого гена Функция не зависит от ориентации энхансера относительно промотора регулируемого гена

Теневые энхансеры - shadow enhancer/s Эукариоты – дистальные элементы, энхансеры Hobert et al., 2010 Иллюстрация защитной функции теневых промоторов Having two copies of the same thing is good, but the adaptive advantage of such duplication may only be apparent under specific, perturbing conditions. Spemann and Waddington Генетическая избыточность

Альтернативная модель сборки ПИК Эукариоты –энхансеры Szutorisz et al., 2005 Классическая модель активации транскрипции генов Энхансеры и активация транскрипции Пример

Эукариоты – дистальные элементы, энхансеры Некоторые энхансеры ортологичных или гомологичных генов позвоночных – весьма консервативные последовательности, что позволяет проводить их поиск у разных организмов. Вариабельность одного из энхасеров, регулирующих экспрессию генов развития позвоночных.

Эукариоты – дистальные элементы, сайленсеры Сайленсер - специфическая регуляторная последовательность ДНК, расположенная удаленно от базального промотора гена - мишени и осуществляющая функцию репрессии транскрипции через связывание различных транскрипционных факторов. Сайленсеры содержат сайты связывания репрессоров Регуляторная активность не зависит от расстояния между сайленсером и промотором регулируемого гена Функция не зависит от ориентации сайленсера относительно промотора регулируемого гена Существуют сайленсеры для которых функция зависит от позиции Особенности сайленсеров

Эукариоты – дистальные элементы, инсуляторы Capelson and Corces, 2005 Инсуляторы - особые регуляторные элементы, которые обладают способностью блокировать сигналы исходящие от окружения Свойства инсуляторов Домен экспрессии гена (Gene expression domain) – геномная последовательность, содержащая сам ген и все цис - элементы необходимые для достижения уровня и тайминга экспресии соответствующего паттерну in vivo Инсулятор имеют длину от 0.5 до 3 тысяч п.о. Регуляторная активность инсуляторов зависит от позиции и не зависит от их ориентации Инсуляторы могут блокировать взаимодействие между энхансером и промотором, если находится между ними. Инсуляторы могут предотвращать распространение репрессионного хроматина

Эукариоты – дистальные элементы, инсуляторы Механизмы регуляторной активности инсуляторов Capelson and Corces, 2005 Активность инсуляторов регулируется при помощи РНК-интерференции. (А) Два инсулятора связаны друг с другом при помощи инсулятор-связывающих белков. (В) Специальный белок Rm62 связывает как инсулятор-белковый комплекс, так и двухцепочечную РНК, что приводит к разрушению комплекса двух инсуляторов.

Эукариоты – дистальные элементы, ЛКР Локус – контролирующий район – группа регуляторных элементов, участвующих в регуляции локуса или кластера генов Свойства ЛКР ЛКР как правило состоят из большого количества цис - элементов: энхансеров, сайленсеров, инсуляторов, MARs или SARs (участки ассоциированные с матриксом). С цис – элементами ЛКР связываются различные транскрипционные факторы, коактиваторы, репрессоры, и/или модификаторы хроматина. Регуляторная активность инсуляторов не зависит от позиции и зависит от их ориентации относительно контролируемого локуса

Эукариоты – дистальные элементы, ЛКР Liang et al., 2008 Организация локуса глобинов человека Петлевая модель (Looping model) Механизм действия локус – контролирующего района

Спасибо за внимание

Прокариоты Shine-Delgarno box Cis-Regulatory Elements Coding Sequence= ORF +1 5’ UTR = Leader sequence Spacer = 5’UTR of 2nd cistron Stop Codon TAA, TAG, TGA Coding Sequence= ORF USE/Promoter /Operator DNA Protein A Protein B терминатор

RNA Polymerases Differences between eukaryotes & prokaryotes Prokaryotes 1 enzyme with 4 subunits 2 α’s, 1 , & 1 ’ actual polymerase function Sigma factors (σ ) recognize & bind promoter DNA sequence Eukaryotes 3 separate holoenzymes – each has ~12 subunits RNA Pol I – 28S, 18S, 5.8S rRNA RNA Pol II – mRNA, snRNA RNA Pol III – tRNA, 5S rRNA 3 sets of basal transcription factors recognize promoter DNA sequences

Figure 12.6 Prokaryotic Transcription Initiation

Rho Independent Termination in Prokaryotes r-independent termination requires two sequences in the RNA A stem-loop structure upstream of 7-9 U residues Stabilizes the RNA pol pausing

Прокариоты - регуляция промоторов Регуляция trp оперона

Эукариоты: 5’-регуляторные участки 5’-регуляторные участки эукариот по своему составу уникальны для каждого гена, однако, имеют общую структуру – промотор, проксимальные элементы и дистальные элементы. Общая схема организации регуляторных последовательностей эукариот. (a) Пример простейшей организации – присутствует коровая промоторная последовательность TATА-box, UAS – активаторная последовательность, и сайленсер. (b) Пример сложной организации – помимо проксимальных регуляторных последовательностей (коровый промотор и проксимальные промоторные элементы) присутствуют также дистальные элементы – энхансеры и инсуляторы; инициаторная последовательность или инициаторный элемент – INR, внутренние промоторные элементы – DPE, и энхансерные элементы в 3’ области.

RNA Pol I rRNA precursor RNA Pol II mRNAs, U6 snRNA RNA Pol III tRNA, 5S rRNA, U1-U5 snRNAs Эукариоты – «другие» базальные промоторы