ГАПОУ «Липецкий медицинский колледж» Лекция 7. Физиология бактерий, методы её изучения Составитель: Лень Т. А.
1. Основные виды пластического обмена: 1) белковый; 2) углеводный; 3) липидный; 4) нуклеиновый. Белковый обмен характеризуется катаболизмом и анаболизмом. В процессе катаболизма бактерии разлагают белки под действием протеаз с образованием пептидов. Под действием пептидаз из пептидов образуются аминокислоты. Распад белков в аэробных условиях называется тлением, в анаэробных – гниением.
В зависимости от конечных продуктов выделяют следующие виды брожения: 1) спиртовое (характерно для грибов); 2) пропиониво кислое (характерно для клостридий, пропиони бактерий); 3) молочно кислое (характерно для стрептококков); 4) масляно кислое (характерно для сарцин); 5) бутиленгликолевое (характерно для бацилл). Наряду с основным анаэробным распадом (гликолизом) могут быть вспомогательные пути расщепления углеводов (пентозофосфатный, кетодезоксифосфоглюконатный и др. ). Они отличаются ключевыми продуктами и реакциями.
Липидный обмен осуществляется с помощью ферментов – липопротеиназ, летициназ, липаз, фосфолипаз. Липазы катализируют распад нейтральных жирных кислот, т. е. ответственны за отщепление этих кислот от глицерина. При распаде жирных кислот клетка запасает энергию. Конечным продуктом распада является ацетил Коэнзим. А. Биосинтез липидов осуществляется за счет ацетилпереносящих белков. При этом ацетильный остаток переходит на глицерофосфат с образованием фосфатидных кислот, а они уже вступают в химические реакции с образованием сложных эфиров со спиртами. Эти превращения лежат в основе синтеза фосфолипидов. Бактерии способны синтезировать как насыщенные, так и ненасыщенные жирные кислоты, но синтез последних более характерен для аэробов, так как требует кислорода.
Метаболизм - это обмен веществ: ассимиляция – анаболизм (синтез веществ с затратой энергии), диссимиляция – катаболизм. Особенности метаболизма у бактерий: 1) многообразие используемых субстратов; 2) интенсивность процессов метаболизма; 3) направленность всех процессов метаболизма на обеспечение процессов размножения; 4) преобладание процессов распада над процессами синтеза; 5) наличие экзо– и эндоферментов метаболизма.
В процессе метаболизма выделяют два вида обмена: 1) пластический (конструктивный): а) анаболизм (с затратами энергии); б) катаболизм (с выделением энергии); 2) энергетический обмен (протекает в дыхательных мезосомах): а) дыхание; б) брожение.
Химический состав бактерий Вещества: 1) неорганические: вода 75 85 % (в споре 18 20%) универсальный растворитель; минеральные соли 2 14% (фосфор, натрий, железо, магний, калий, сера) и микроэлементы (кобальт, молибден, марганец, медь, цинк)
2) Органические ВЕЩЕСТВА : белки 50 80% сухой массы бактерии, бывают больше 2000: простые и сложные, нуклеиновые кислоты: ДНК и РНК 10 30% обеспечивают передачу наследственной информации, жиры липиды 0, 2 40% запасные вещества, участвуют в энергообмене, углеводы 12 18% источник энергии.
Под питанием понимают процессы поступления и выведения питательных веществ в клетку и из клетки. Питание в первую очередь обеспечивает размножение и метаболизм клетки. Среди необходимых питательных веществ выделяют органогены – это восемь химических элементов, концентрация которых в бактериальной клетке превосходит 10— 4 моль. К ним относят углерод, кислород, водород, азот, фосфор, калий, магний, кальций. Кроме органогенов, необходимы микроэлементы. Они обеспечивают активность ферментов. Это цинк, марганец, молибден, кобальт, медь, никель, вольфрам, натрий, хлор.
По типу питания микроорганизмы: Аутотрофы – используют в качестве источника углерода простые неорганические вещества: Ø Нитрофицирующие Ø Азотфиксирующие Ø Серобактерии Ø Железобактерии Гетеротрофы – питаются готовыми органическими веществами: Ø Сапрофиты используют мёртвые органические остатки Ø Паразиты питаются живыми органическими веществами, используя ресурсы хозяина. Все болезнетворные м/о: риккетсии, вирусы и др.
Аутотрофы: нитевидные серобактерии железобактерии азотфиксирующие Размножение железобактерий
3. Метатрофы (используют органические вещества неживой природы). 4. Паратрофы (используют органические вещества живой природы).
По способности усваивать азот микроорганизмы: Аминогетеротрофы получают азот из органич х соединений Аминоавтотрофы для синтеза белка клетки используют молекулярный азот из воздуха (клубеньковые бактерии) По источникам энергии: 1) фототрофы способны использовать солнечную энергию (пурпурные серобактерии), 2) хемотрофы получают энергию за счет окислительно восстановительных реакций.
Сообщества микроорганизмов чёрных курильщиков являются хемотрофами и являются основными продуцентами на дне океанов
Строение фототрофов Снимки 1 — 4 сделаны в световом микроскопе снимки 5 — 6 — в электронном микроскопе
Пути поступления метаболитов и ионов в микробную клетку. 1. Пассивный транспорт (без энергетических затрат): 1) простая диффузия; 2) облегченная диффузия (по градиенту концентрации, с помощью белков переносчиков). 2. Активный транспорт с затратами АТФ (против градиента концентрации; при этом происходит взаимодействие субстрата с белком переносчиком на поверхности цитоплазматической мембраны). 3. Перенос или транслокация групп радикалов.
Дыхание бактерий (биоокисление) – это совокупность биохимических процессов, в результате которых выделяется энергия, необходимая для жизнедеятельности микроорганизмов
По типу дыхания группы бактерий: 1. Облигатные аэробы развиваются при наличии 20% кислорода с освобождением энергии. Это микобактерии ТБС, чудесная пал ка. 2. Облигатные анаэробы, для которых наличие молекулярного кислорода является губительным, например, клостридии столбняка. Брожение это процесс разложения органических веществ в бескислородных условиях с выделением энергии. Бывает спиртовое и молочно кислое. 3. Факультативные анаэробы могут размножаться как в присутствии кислорода, так и без него. Это сапрофиты и патогенные: возбудители тифа и дизентерии.
Возбудители брюшного тифа Микроаэрофилы нуждаются в значительно меньшем количестве кислорода, и его высокая концентрация хотя и не убивает бактерии, но задерживает их рост (актиномицеты, бруцеллы, лептоспиры). Некоторые микробы нуждаются в повышенном содержании углекислого газа (капнофилы)
Основные методы создания анаэробных условий для культивирования микроорганизмов 1. Физический откачивание воздуха, введение специальной газовой безкислородной смеси (чаще N 2 85%, CO 2 10%, H 2 5%). 2. Химический применяют химические поглотители кислорода. 3. Биологический совместное культивирование строгих аэробов и анаэробов (аэробы поглощают кислород и создают условия для размножения анаэробов). 4. Смешанный используют несколько разных подходов.
5. Ферменты – это биологические катализаторы, высокомолекулярные вещества (ВМВ) белковой природы, вырабатываемые живой клеткой с характерной специфичностью действия Практическое использование: дрожжи в пивоварении и хлебопечении, биодобавки к стиральному порошку (сенная палочка). Классификация ферментов. По строению выделяют: 1) простые ферменты (белки); 2) сложные; состоят из белковой (активного центра) и небелковой частей; необходимы для активизации ферментов.
Различают также ферменты: 1) конститутивные ферменты находятся в микробной клетке постоянно (синтезируются постоянно независимо от наличия субстрата); 2) индуцибельные адаптивные индуктивные ферменты появляются в клетке только под влиянием соответствующего субстрата в питательной среде (синтезируются только в присутствии субстрата). Набор ферментов в клетке строго индивидуален для вида. Способность микроорганизма утилизировать субстраты за счет своего набора ферментов определяет его биохимические свойства.
По месту действия выделяют: 1) экзоферменты выделяются во внешнюю среду и расщепляют макромолекулы питательных веществ до более простых соединений, усваиваемых микробной клеткой (например, гидролазы действуют вне клетки; принимают участие в процессе распада крупных молекул, которые не могут проникнуть внутрь бактериальной клетки). Характерны для грамположительных бактерий; 2) эндоферменты катализируют метаболические реакции, происходящие внутри клетки (действуют в самой клетке, обеспечивают синтез и распад различных веществ).
В зависимости от катализируемых химических реакций все ферменты делят на шесть классов: 1) оксидоредуктазы (катализируют окислительно восстановительные реакции между двумя субстратами); 2) трансферазы (осуществляют межмолекулярный перенос химических групп); 3) гидролазы (осуществляют гидролитическое расщепление внутримолекулярных связей); 4) лиазы (присоединяют химические группы по двум связям, а также осуществляют обратные реакции); 5) изомеразы (осуществляют процессы изомеризации, обеспечивают внутреннюю конверсию с образованием различных изомеров); 6) лигазы, или синтетазы (соединяют две молекулы, вследствие чего происходит расщепление пирофосфатных связей в молекуле АТФ).
Рост – увеличение размеров отдельной особи и упорядоченное воспроизведение всех клеточных компонентов и структур Факторы роста – особые вещества, играющие роль катализаторов в биохимических процессах, являются структурными единицами при образовании некоторых ферментов
Размножение - способность к самовоспроизведению с увеличением числа клеток в популяции. Основной способ размножения у бактерий поперечное деление (бинарное – пополам), реже почкование (tbs). При благоприятных условиях деления через каждые 15 30 минут. Размножение бактерий определяется временем генерации. Это период, в течение которого осуществляется деление клетки. Продолжительность генерации зависит от вида бактерий, возраста, состава питательной среды, температуры и др.
Скорость деления (время появления нового поколения) в благоприятной среде и при оптимальных температурных условиях у многих бактерий составляет примерно 20 -30 минут. График показывает теоретическую скорость размножения одной- единственной бактерии при длительности цикла деления 20 минут за 10 часов
После посева на жидкую питательную среду бактерии проходят стадии: Начальная стационарная фаза; то количество бактерий, которое попало в питательную среду и в ней находится. Исходная латентная скрытая лаг – фаза покоя. Длится 3– 4 ч. , происходит адаптация бактерий к питательной среде, начинается активный рост клеток. Лог – фаза, логарифмический рост. Стационарная (максимальная концентрация бактерий). Отмирание.
Пигментообразование – образование красящих веществ в процессе метаболизма у некоторых бактерий и грибов По химическому составу пигменты бывают: - растворимые в воде синий – пиоцианин у синегнойной палочки; - растворимые в спирте красный продигиозан у чудесной палочки; - нерастворимые ни в воде, ни в спирте: чёрные и бурые меланины у дрожжей, жёлтые липохромы у стафилококка.
Пигменты обеспечивают: защиту от УФ радиации, участвуют в реакциях синтеза, обладают антибиотическим действием. Свечение фотогенных бактерий (люминесцентность) возникает в результате окислений с выделением энергии у фотогенных аэробов, чаще в морской воде (галофиты). Ароматообразование – это способность выделять летучие вещества, вырабатываются сложные жиры с ароматными (фруктов, вина, молока) или неприятными запахами (сероводород).
Свечение возникает в результате окисления с выделением энергии Ароматообразование – способность выделять летучие вещества Колонии сине гнойной палочки пахнут карамелью
Классификация питательных сред. 1. По происхождению: 1) естественные натуральные (молоко, желатин, картофель и др. ); 2) искусственные – среды, приготовленные из специально подготовленных природных компонентов (пептона, аминопептида, дрожжевого экстракта); 3) синтетические – среды известного состава, приготовленные из химически чистых неорганических и органических соединений (солей, аминокислот)
2. По составу: 1) простые – мясопептонный агар МПА, мясопептонный бульон МПБ, агар Хоттингера, пептонная вода, питательный желатин; 2) сложные – это простые с добавлением дополнительного питательного компонента (кровяного, шоколадного агара): сахарный бульон, желчный бульон, сывороточный агар, желточно солевой агар, среда Китта—Тароцци, среда Вильсона—Блера и др.
3. По консистенции: 1) твёрдые (содержат 3– 5 % агара); 2) полужидкие (0, 15— 0, 7 % агара); 3) жидкие (не содержат агара).
4. По назначению: 1) универсальные основные общего назначения – для культивирования большинства бактерий (мясопептонный агар, мясопептонный бульон, кровяной агар); 2) специального назначения: а) избирательные элективные – среды, на которых растут бактерии только одного вида (рода), а род других подавляется (щелочной бульон, 1 % ная пептонная вода, желточно солевой агар, казеиново угольный агар;
По консистентности: твёрдые, полужидкие и жидкие (синтетические и полусинтетические) • По составу: Холерный вибрион в мазке из пептонной воды. б) дифференциально диагностические среды, на которых рост одних видов бактерий отличается от роста других видов по тем или иным свойствам, чаще биохимическим (среда Эндо, Левина, Гиса, Плоскирева и др. ); в) среды обогащения – среды, в которых происходит размножение и накопление бактерий возбудителей какого либо рода или вида, т. е. обогащение ими исследуемого материала (селенитовый бульон); 3) консервирующие (глицерин)
Методы выделения чистых культур 1. Механическое разобщение на поверхности плотной питательной среды (метод штриха обжигом петли, метод разведений в агаре, распределение по поверхности твёрдой питательной среды шпателем, метод Дригальского). 2. Использование элективных питательных сред. 3. Создание условий, благоприятных для развития одного вида (рода) бактерий (среды обогащения). Чистую культуру получают в виде колоний
Методы выделения чистых культур анаэробов. Метод Цейсслера. Исследуемый материал сеют штрихами по поверхности плотной среды. Создают анаэробные условия. И инкубируют при 37 градусах 24 72 ч. Изолированные колонии анаэробов пересевают на среду контроля стерильности или среду Китта Тароцци. Метод Вейнберга. Несколько капель исследуемого материал вносят в пробирку с 4 5 мл изотонического раствора. Перемешивают запаянным капилляром переносят в пробирку с охлажденным до 45 50 градусов сахарным агаром, разлитым высоким столбиком. После перемешивания этим же капилляром засевают еще две пробирки с сахарным агаром и быстро охлаждают под струей воды. Выросшие в глубине колонии пересевают на СКС или среду Китта Тароцци.
Условия культивирования бактерий: 1. Наличие полноценной питательной среды. 2. Определенная температура культивирования (оптимальная температура 370 С). 3. Определенная атмосфера культивирования. Для строгих аэробов необходим кислород, поэтому они хорошо растут на поверхности агара чашках Петри или в тонком верхнем слое жидкой среды. Для роста аэробов в глубинном слое жидкой среды необходимо непрерывно перемешивать или встряхивать питательные среды, чтобы кислород распределялся по всему объему среды. Для факультативных анаэробов используют те же методы.
4. Время культивирования (18 48 часов). Для культивирования микобактерий туберкулеза (3 4 недели). 5. Освещение. Для выращивания фототрофных бактерий необходим свет. 6. Культивирование облигатных внутриклеточных паразитов бактерий, относящихся к родам риккетсия, эрлихия, коксиелла, хламидия осуществляют на культурах клеток или в организме животных и членистоногих, а также в куриных эмбрионах.
Термостат — это устройство, позволяющее поддерживать постоянную температуру в замкнутом пространстве. Применяется в бактериологических и вирусологических лабораториях для культивирования микроорганизмов при определенной температуре, а также в клинических лабораториях для проведения различных химических анализов. Термостаты бывают водяные и воздушные. Оба вида термостатов представляют собой металлический шкаф с двойными стенками между которыми находится теплоноситель (воздух или вода). Необходимым элементом любого термостата является терморегулятор (контактный термометр), благодаря которому автоматически включается и выключается подогреватель и таким образом поддерживается постоянная температура в термостате.
Особенности культивирования риккетсий и хламидий Риккетсии и хламидии – бактерии, которые, как и вирусы, являются облигатными внутриклеточными паразитами. Поэтому для их культивирования применяются: а) тканевые культуры; б) куриные эмбрионы; в) лабораторные животные.
Риккетсии являются облигатными внутриклеточными паразитами и не размножаются на искусственных питательных средах. 1. Эпидермо-мембранный метод (метод А. В. Пшеничного и Б. И. Райхера). Принцип его заключается в том, что с кожи трупа снимают путем термической обработки эпидермальный слой в виде тонкой пленки, то есть тончайшей мембраны. Эпидермальную мембрану натягивают на кормушку и закрепляют. В кормушке на эпидермо мембрану высыпают вшей, а под мембрану подводят небольшое количество дефибринированной крови, содержащей риккетсии. Кормушку нагревают до 32 370 С. Вши сосут кровь и заражаются риккетсиями.
Размножаясь в эпителиальных клетках кишечника риккетсии через 8 9 дней накапливаются во вшах. Затем их растирают в ступке, и взвесь очищают путем фильтрации и центрифугирования (в настоящее время метод имеет историческое значение). 2. Метод Кокса (заражение куриных эмбрионов в полость желточного мешка). Для этого используют 6 7 дневные эмбрионы. Работа производится в боксах с тщательным соблюдением стерильности. После дезинфекции 50% спиртом и 5% йодной настойкой скорлупы тупого конца яйца пробуравливают отверстие над вершиной воздушной камеры и в него вводят шприц, содержащий 0, 4 0, 5 мл инфицирующего материала.
Максимальное накопление риккетсий происходит на 8 10 день. Риккетсии размножаются в ткани стенки желточного мешка и при гибели клеток легко из них освобождаются. При вскрытии зараженных эмбрионов желточный мешок извлекают стерильным пинцетом и из него готовится суспензия на стерильном физиологическом растворе, которую используют для приготовления риккетсиозных антигенов и вакцин. 3. Метод культуры тканей. Риккетсии можно выращивать в культурах in vitro на многих типов клеток млекопитающих. Риккетсии культуре клеток накапливаются медленно и в небольшом количестве, поэтому клеточные культуры нужно поддерживать в течение нескольких недель, прежде чем появятся признаки инфекции.
Температурный оптимум 32 350 С, р. Н – 7, 4 7, 8, солевой состав в культуральной среде обеспечивается смесью жидкости Тироде с сывороткой морской свинки или кролика. 4. Метод заражения лабораторных животных (биологический метод). В настоящее время для культивирования риккетсий широко используют морских свинок и белых мышей. Морских свинок заражают внутрибрюшинно или интратестикулярно (в толщу яичек). Риккетсии выделяют из крови, селезенки, почек, надпочечников, но особенно много их в мозговой ткани животного. Инфицирование их производится под эфирным наркозом с инсталляцией в ноздри 10 кап риккетсиальной взвеси. При такой дозе мыши погибают на 4 5 сут. При вскрытии извлекают легкое, в котором находятся риккетсии.
Хламидии вызывают у человека орнитоз, трахому, бленнорею новорожденных с включениями, болезнь Рейтера, венерическую лимфогранулёму, урогенитальные инфекции. Хламидии, также как и риккетсии культивируются в организме чувствительных животных, в культурах тканей, в желточном мешке куриного эмбриона. 1. Биологический метод. Исследуемым материалом заражают новорожденных морских свинок и белых мышей. Новорожденные мыши погибают при внутримозговом заражении через 5 10 сут от пневмонии. При внутрибрюшинном заражении гибель животных отмечается на 3 4 сут на фоне пневмонии и перитонита.
При микроскопическом исследовании клеток пораженных органов обнаруживаются хламидийные включения, наибольшее количество возбудителя отмечается в легких, печени, селезенке. 2. Заражение куриных эмбрионов. Наиболее эффективно заражение 7 дневных куриных эмбрионов в желточный мешок и 9 11 дневных в полость аллантоиса. Гибель эмбрионов происходит уже на 4 сут, температура инкубации 360 С. Препараты отпечатки и мазки окрашивают акридиновым оранжевым, по Романовскому Гимзе, Макклавелла и исследуют под микроскопом для обнаружения включений.
3. Метод культуры тканей. Исследуемым материалом заражают культуры клеток. Эффективность заражения клеток хламидиями возрастает при обработке культуры цитостатиками или центрифугирования после внесения инфицированного материала в культуру. Культуры клеток обычно выращивают на покровных стеклах, которые вынимают, фиксируют и красят через 24 28 час после заражения. Если цитоплазматические включения хламидий не обнаруживаются, культивирование продолжают до 6 10 суток.
Посевом в микробиологической практике называют внесе ние в стерильную питательную среду какого либо исследуемого материала для обнаружения микроорганизмов. Пересев – это перенос выращенных микроорганизмов в стерильную среду. Посевы и пересевы микробов являются одним из наиболее распространенных приемов в микробиологической практике.
Пересевы производят следующим образом 1) посевы производят непосредственно около зажженной горелки, в пламени которой стерилизуют петли, пинце ты, куль турой, другую (со стерильной питательной средой) дер жат в наклонном положении между большим и указа тельным пальцами; ватные пробки, края пробирок; 2) в левую руку берут одну пробирку с пересеваемой 3) петлю держат в вертикальном положении над пламенем горелки и прокаливают ее металлическую часть докрас на, а затем наклоняют горизонтально и стерилизуют держатель петли; 4) вынимают ватные пробки и держат их безымянным пальцем и мизинцем правой руки; класть пробки на стол или на какой нибудь предмет не рекомендуется;
5) обжигают края обеих пробирок; 6) вносят петлю в пробирку с пересеваемой культурой осторожно, не касаясь стенок, захватывают каплю жид кости или небольшое количество налета на твердой среде и переносят, стараясь не задеть стенок, во вторую про бирку с обеспложенной питательной средой; 7) петлю вынимают, обжигают края пробирок и внутренние концы пробок. Если ватная пробка загорится, то ею за крывают пробирку, а наружный конец гасят рукой или пинцетом; 8) петлю вновь обжигают в пламени, на пробирке делают соответствующую надпись: название культуры и дату по сева.
Посев в жидкую питательную среду При использовании пастеровской пипетки обожженным пинцетом следует надломить запаянный конец и слегка обжечь всю пипетку. Пробирку с исследуемой культурой помещают в левую руку, а пипетку – в правую между большим и средним пальцами, зажав ее верхнее отверстие указа тельным пальцем. Вынув ватную пробку из пробирки, обжигают края послед ней. Осторожно опускают пипетку в пробирку и снимают указа тельный палец. Затем закрывают указательным пальцем верхнее отверстие пипетки, вынимают ее из пробирки. Ватную пробку и края пробирки, перед тем как закрыть, обжигают. Исследуемый материал переносят в жидкую среду. После по сева пипетки помещают в дезинфицирующий раствор.
Посев на плотные среды. При посеве на косой агар Для этого петлю с засе ваемым материалом вводят в пробирку до скопившейся на дне конденсационной воды и осторожно, не взрыхляя агар, наносят штрих. Сплошной посев получают при размазывании посевного материала по всей поверхности косого агара. На плотной среде в чашке Петри Питательную среду в пробирках расплавляют на кипящей водяной бане, охлаждают до 48 50°С и разливают ров ным слоем высотой 3 5 мм в стерильные чашки. Застывшую среду подсушивают в термостате в закрытых чашках в течение 20 30 минут.
Открытые чашки кладут вверх дном на полки тер мостата, покрытые стерильной бумагой. Рядом с чашками по мещают крышки. При подсушивании с поверхности питательной среды и внутренней поверхности чашек испаряется конденсаци онная вода. Посев делают петлей в виде параллельных штрихов или стеклянным шпателем.
Скачать презентацию ГАПОУ Липецкий медицинский колледж Лекция 7 Физиология бактерий
лекция 7 микра.ppt