Ферменти генетичної інженерії. Маніпуляції з молекулами нуклеїнових кислот

Скачать презентацию Ферменти генетичної інженерії. Маніпуляції з молекулами нуклеїнових кислот Скачать презентацию Ферменти генетичної інженерії. Маніпуляції з молекулами нуклеїнових кислот

41932-bt6_1_fermenti_gen_inzheneriyi.ppt

  • Количество слайдов: 25

>Ферменти генетичної інженерії. Маніпуляції з молекулами нуклеїнових кислот in vitro Ферменти генетичної інженерії. Маніпуляції з молекулами нуклеїнових кислот in vitro

>Основні етапи генно-інженерного експерименту 1. Розщеплення ДНК донора ендонуклеазою рестрикції  (ЕР) HindIII 2.Розщеплення Основні етапи генно-інженерного експерименту 1. Розщеплення ДНК донора ендонуклеазою рестрикції (ЕР) HindIII 2.Розщеплення векторної молекули ДНК ЕР Hind III НindIII НindIII 3.Лігування Рекомбінантні молекули ДНК 4.Перенесення рекомбінантних ДНК у клітини - реципієнти 5.Відбір клітин, що містять клоновані гени донора за Х+-фенотипом X X X X Вектор A. Виділення гена з геному Синтез гена in vitro Б. Створення рекомбінантних ДНК В. Клонування гена в клітинах - реципієнтах

>Явище рестрикції-модифікації відкрили на початку 50-х  років ХХ століття С. Лурія та його Явище рестрикції-модифікації відкрили на початку 50-х років ХХ століття С. Лурія та його співробітники, вивчаючи особливості взаємодії бактерій та бактеріофагів Ефективність розмноження (EP) бактеріофага в клітинах бактерій залежить від того, в якому бактерійному штамі востаннє він розмножувався (від попереднього господаря) E. coli C λ λc 2 ∙ 10-4 ЕР = 1 – усі фагові частинки дають потомство ЕР = 2∙ 10-4 – 2 фагові частинки з 10 000 дають потомство

>Відбувається обмеження (рестрикція) розвитку бактеріофагу λC на штамі E. coli K12  Частина фагових Відбувається обмеження (рестрикція) розвитку бактеріофагу λC на штамі E. coli K12 Частина фагових частинок долає рестрикцію, модифікується в клітинах К12 і далі розмножується в цьому штамі без обмежень Після повторного їхнього розмноження в клітинах штаму С модифікація втрачається В. Арбер та ін. довели, що рестрикція зумовлена розщепленням фагової ДНК ендонуклеазами рестрикції, які діють на специфічні послідовності неметильованої ДНК Модифікація – це метилування (гідроксиметилування, глікозилювання) залишків аденіну та цитозину в ДНК. Модифікація захищає ДНК від розщеплення ЕР. ДНК не розщеплюється, якщо метильований хоча б один з ланцюгів Пара ферментів – ЕР та метилтрансфераза (МТ) формують систему рестрикції-модифікації (РM – cистему) У клітині може діяти 1 або більше РM – cистем (їх може не бути взагалі), які діють на різні послідовності. ДНК, метильовану однією системою, може розщеплювати ЕР іншої

>У 1968 Лінн і Арбер, а також Мезельсон і Юань виділили ензими  У 1968 Лінн і Арбер, а також Мезельсон і Юань виділили ензими EcoB and EcoK, які віднесено до ЕР Типу І У 1970 Сміт і Вількокс відкрили першу ЕР Типу ІІ - HindII РM системи класифікують на чотири типи (I, II, III і IV) залежно від структури ферментів, їхньої специфічності та потреби у кофакторах Запропоновано скорочену назву ферментів з трьох літер: Перша літера родової та дві літери видової назви мікроорганізму, з якого виділений фермент Додаткові літери відображають специфіку штаму Якщо в клітинах виявлено декілька РM-систем, то їх нумерують римськими цифрами ЕР позначають літерою R, МТ цієї системи – М (наприклад, R.EcoK, M.EcoK) Приклад - фермент HindII виділено з клітин Haemophilus influenzae серотипу d

>Системи рестрикції –модифікації Типу І  Складаються з декількох неідентичних субодиниць: зазвичай двох R, Системи рестрикції –модифікації Типу І Складаються з декількох неідентичних субодиниць: зазвичай двох R, двох M та однієї S Функція S – впізнавання специфічної послідовності ДНК, R – розщеплення ДНК, М – метилювання Якщо ензими Типу І діють на неметильовані субстрати, вони функціонують як рестриктази. Для їхньої дії необхідний гідроліз АТФ та Mg2+. ДНК розщеплюється у випадкових сайтах на різній віддалі від сайту впізнавання (від 40 до 7000 п.н) З малою ймовірністю може відбуватися метилювання. Продукт метилування – m6A. Донор метильних груп – S-аденозилметіонін Якщо субстратом є ДНК, один з ланцюгів якої є метильований (наприклад, після реплікації ДНК), то ензим діє як метилтрасфераза

>Системи рестрикції- модифікації Типу ІІІ та IV  Ферменти Типу ІІІ складаються з двох Системи рестрикції- модифікації Типу ІІІ та IV Ферменти Типу ІІІ складаються з двох субодиниць: 1) Mod, яка виконує функції впізнавання специфічної послідовності ДНК та її метилювання, і 2) Res, яка каталізує розщеплення ДНК Обидві субодиниці потрібні для розщеплення ДНК Для розщеплення ДНК необхідний гідроліз АТФ, Mg2+ Розриви вносяться на віддалі приблизно 25 п.н. від сайту впізнавання Приклад: EcoP1I, EcoP15I Ферменти Типу IV діють тільки на модифіковану ДНК з метильованими, гідроксиметильованими та глікозил-гідроксильованими азотистими основами Наприклад, фермент EcoKMcrBC впізнає два динуклеотиди Pu mC, які розділені будь якими послідовностями довжиною від 40 до 3000 п.н. Розщеплення відбувається на віддалі приблизно 30 п.н. від одного з сайтів Ферменти класів І, ІІІ та IV не використовують як інструменти генетичної інженерії

>Системи рестрикції - модифікації типу ІІ  Системи рестрикції - модифікації типу II широко Системи рестрикції - модифікації типу ІІ Системи рестрикції - модифікації типу II широко розповсюджені серед бактерій. Їх можуть кодувати геноми архебактерій, фагів та вірусів водоростей. Відомо більше 3500 ЕР Типу ІІ, які впізнають понад 240 різних послідовностей ДНК Системи РM Типу II є простими і найкраще вивченими Рестрикційні ферменти, зазвичай, є гомодимерами і співіснують в клітинах з окремими білками-метилтрансферазами Для вияву активності ЕР потребують лише Mg2+ Відповідні МТ потребують для своєї активності як кофактор S-aденозилметіонін, метилюють обидва ланцюги ДНК, формуючи залишки N6-метиладеніну, 5-метилцитозину або N4-метилцитозину Впізнають паліндромні послідовності по 4-8 п.н., паліндромні послідовності, які перервані неспецифічними нуклеотидами або частково паліндромні, чи несиметричні послідовності http://rebase.neb.com

>ЕР Типу ІІ впізнають специфічні послідовності ДНК і розщеплюють її в постійних позиціях – ЕР Типу ІІ впізнають специфічні послідовності ДНК і розщеплюють її в постійних позиціях – в цих послідовностях або на певній короткій віддалі від них Утворюють фрагменти з 5’-фосфатами та 3’-гідроксилами на кінцях

>

>Одна послідовність може впізнаватися більше, ніж одним ензимом   Вперше відкритий фермент, який Одна послідовність може впізнаватися більше, ніж одним ензимом Вперше відкритий фермент, який володіє унікальною специфічністю до певної послідовності нуклеотидів, називають прототипом Наступні ферменти з такою ж специфічністю, як у прототипу, називають ізошизомерами ЕР, які впізнають однакові послідовності, але по різному їх розщеплюють, називають неошизомерами Специфічність деяких ЕР змінюється залежно від умов EcoRI при рН 7,3, 100 мМ NaCl та MgCl2 впізнає послідовність GAATTC При збільшенні рН до 8,3, заміні Mg2+ на Mn2+ впізнає послідовність ААТТ. Таку змінену активність позначають як EcoRI* (star) - активність

>Використання ЕР Типу ІІ у генетичній інженерії  Отримання певних фрагментів ДНК з певною Використання ЕР Типу ІІ у генетичній інженерії Отримання певних фрагментів ДНК з певною структурою кінців Фрагменти фракціонують за розмірами за допомогою гель-електрофорезу та піддають іншим маніпуляціям, наприклад, з’єднують їх з іншими фрагментами Визначають розміри фрагментів ДНК, порівнюючи їхню електрофоретичну рухливість з рухливістю маркерних фрагментів, розміри яких відомі Розміщення сайтів розщеплення ЕР є постійною характеристикою молекули ДНК – її “молекулярним маркером” Це дає змогу будувати фізичні (рестрикційні) карти геномів – схеми розміщення сайтів розщеплення ЕР. Віддаль між сайтами на картах визначають у парах нуклеотидів. Побудова рестрикційних карт є важливим методом вивчення організації геномів і передумовою подальших генно-інженерних процедур

>Молекули, які з’єднують за допомогою ДНК-лігаз повинні мати комплементарні “липкі” кінці Молекули, які з’єднують за допомогою ДНК-лігаз повинні мати комплементарні “липкі” кінці

>Аналіз електрофоретичного розподілу фрагментів сумарної ДНК  ДНК кожного виду дає після розщеплення ЕР Аналіз електрофоретичного розподілу фрагментів сумарної ДНК ДНК кожного виду дає після розщеплення ЕР відмінний набір фрагментів різної довжини і, відповідно, індивідуальну картину розподілу фрагментів їхньої ДНК після електрофорезу (геномний фінгерпринт). Це можна використати для встановлення приналежності певного організму до даного виду Аналіз дає змогу виявити перебудови послідовностей ДНК – ампліфікації, делеції, додаткові фрагменти Мутації змінюють послідовність нуклеотидів, що зумовлює появу або втрату сайтів розщеплення ЕР. Так, серед членів популяції виникає поліморфізм за довжинами рестрикційних фрагментів (ПДРФ), який є показником мінливості популяції

>Транзиція А→Т  в шостому кодоні гена β-глобіну призводить до втрати MstI-сайту в першому Транзиція А→Т в шостому кодоні гена β-глобіну призводить до втрати MstI-сайту в першому екзоні, зумовлює заміну залишку Glu наVal та появу HbS Виділяють ДНК, розщеплюють її ЕР MstI та фракціонують фрагменти електрофорезом

>Ген βА утворює фрагмент розміром 1,1 т.п.н.  Ген βS утворює фрагмент розміром 1,3 Ген βА утворює фрагмент розміром 1,1 т.п.н. Ген βS утворює фрагмент розміром 1,3 т.п.н. Елктрофореграма Б М Д П 1,3 т.п.н 1,1 т.п.н Б – ДНК батька, М – матері, Д – першої дитини, хворої на серпоподібну анемію, П – плоду Висновок: батьки є гетерозиготами βАβS перша дитина - гомозигота βSβS плід є гомозиготним βАβА

>Рестрикційна карта плазміди pUC18/19 Рестрикційна карта плазміди pUC18/19

>Побудова рестрикційних карт. Метод двох рестриктаз Результати розщеплення кільцевої молекули ДНК (плазміди) ЕР Побудова рестрикційних карт. Метод двох рестриктаз Результати розщеплення кільцевої молекули ДНК (плазміди) ЕР Використання кожної з ЕР окремо призводить до утворення одного фрагменту ДНК, розмір якого 4,36 т.п.н. Це вказує на те, що в кільцевій молекулі є по одному сайту дії рестриктаз EcoRI, PstI та SalI, а розмір молекули – 4,36 т.п.н. При дії цих ЕР кільцева молекула перетворюється в лінійну такого ж розміру Позначимо на карті сайт дії EcoRI (Е) і визначимо стосовно нього положення PstI (Р)- та SalI (S)-сайтів

>Після розщеплення молекули рестриктазами EcoRI і SalI утворилися фрагменти розміром 3,98 та 0,38 т.п.н. Після розщеплення молекули рестриктазами EcoRI і SalI утворилися фрагменти розміром 3,98 та 0,38 т.п.н. Це означає, що сайт SalI розміщений на віддалі 0,38 т.п.н. від EcoRI-сайту Після розщеплення рестриктазами EcoRI і PstI утворилися фрагменти розміром 3,61 та 0,75 т.п.н. Це означає, що віддаль між сайтами становить 0,75 т.п.н. Сайти PstI та SalI можуть розміщуватися з одного, або з різних боків від сайту EcoRI

>Для того, щоб вибрати між цими можливостями, слід проаналізувати результати одночасного розщеплення молекули рестриктазами Для того, щоб вибрати між цими можливостями, слід проаналізувати результати одночасного розщеплення молекули рестриктазами PstI та SalI Їхня дія на ДНК призводить до утворення фрагментів розміром 3,23 та 1,13 т.п.н. Розмір меншого з них (1,13 т.п.н.) є сумою розмірів двох малих фрагментів, які утворилися в попередніх варіантах експерименту (0,75 + 0,38). Це можливо тоді, коли сайти PstI та SalI розміщені з різних боків від EcoRI-сайту.

>Побудова фізичних карт хромосом (PFGE-карт)  Клітини змішують з агарозою (іммобілізують у гель) Побудова фізичних карт хромосом (PFGE-карт) Клітини змішують з агарозою (іммобілізують у гель) Клітини руйнують і очищають ДНК. ДНК залишається іммобілізованою в гелі, що зберігає її цілісність. ДНК розщеплюють рестриктазами, які вносять лише декілька розривів у хромосомі Макрофрагменти ДНК фракціонують за допомогою гель-електрофорезу в пульсуючому полі (pulse field gel electrophoresis, PFGE). Під час такого електрофорезу періодично змінюється напрям електричного поля, що дає змогу отримувати як окремі фракції великі фрагменти ДНК (від 50 т.п.н. до декількох млн.п.н) і визначати їхні розміри Карти хромосом будують, порівнюючи розміри макрофрагментів ДНК, отриманих після дії різних ЕР

>Фізична карта хромосоми Streptomyces coelicolor A3(2) Сумуючи розміри макрофрагментів, можна визначити розміри хромосоми в Фізична карта хромосоми Streptomyces coelicolor A3(2) Сумуючи розміри макрофрагментів, можна визначити розміри хромосоми в т.п.н.

>Інші нуклеази, які використовують у генетичній інженерії Екзонуклеаза VII E. coli розщеплює одноланцюгову ДНК Інші нуклеази, які використовують у генетичній інженерії Екзонуклеаза VII E. coli розщеплює одноланцюгову ДНК з 5’- та 3’- кінців λ-екзонуклеаза E. coli розщеплює дволанцюгову ДНК з 5’- кінців Екзонуклеаза ІII E. coli розщеплює дволанцюгову ДНК з 3’- кінців Нуклеаза Bal Alteromonas espejana розщеплює дволанцюгову ДНК з 5’- та 3’- кінців

>Нуклеаза S1 з Aspergillus oryzae розщеплює однониткову ДНК та РНК Руйнування виступаючих однониткових кінців Нуклеаза S1 з Aspergillus oryzae розщеплює однониткову ДНК та РНК Руйнування виступаючих однониткових кінців Руйнування однониткових петель та однониткових ділянок навпроти прогалин Руйнування “шпилькових” структур

>ДЯКУЮ ЗА УВАГУ ДЯКУЮ ЗА УВАГУ