Энзимология номенклатура и классификация ферментов Медицинская энзимология ЛФ

Энзимология номенклатура и классификация ферментов Медицинская энзимология ЛФ д. м. н. , проф. Грицук А. И. зав. кафедрой биохимии ГГМУ

Строение клетки 2

Локализация ферментов в клетке (компартментализация) Клет. мемб. – Na/K АТФ-аза, АЦ, транспортеры Цитозоль – ферм гликолиза, б/с ЖК Ядро – ферм метаболизма ДНК, РНК Мх - ЦТК, β-окисл ЖК Лизосомы - разл. гидролазы Б, Ж, У Рибосомы - б/с Б Аппарат Гольджи – ферм глизилирования Гладкая ЭПС – ферменты детоксикации (микросомального окисления) 3

Маркерные и органоспецифические ферменты n Маркерные ферменты являются маркерами отдельных органелл n Органоспецифические ферменты высокая активность которых имеется в отдельных органах (КФК – мышечная тк) n Оба вида ферментов используются в энзимодиагностике 4

Выделение ферментов принцип grind & bind (размолоть и собрать) Все работы по выделению и очистке ферментов ведутся при t 0º C Этапы выделения: n Гомогенизация ткани или органа n Дифференц. центрифугирование гомогената и выделение нужной фракции органелл n Очистка фермента 5

Денатурация белка 08. 02. 2018

Очистка ферментов Широко используются следующие методы очистки: n Высаливание - осаждение различными концентрациями солей n n n щелочных металлов (Na 2 SO 4, ) Высаливание с органическими растворителями (ацетоном, этанолом), Дифференциальная денатурация при нагревании или изменении р. Н, Дифференциальным центрифугирование –разделение ферментов по массе, Гель-фильтрация - разделение белков по размерам Электрофорез - разделение белков по массе и заряду. Избирательная адсорбция и элюция с ионобменников (ДЭАЭ или КМ целлюлозы и др. ) применяется для их быстрой очистки Поскольку все эти методы мало селективны для выделения индивидуального фермента из сложной смеси, применяют: n Метод аффинной хроматографии 7

Качественное обнаружение и количественное определение E S □ Качественное обнаружение P Цветные реакции на S или P (крахмал ----> глюкоза) □ Количественное определение - количественное измерение ∆S или ∆P (или ∆NADH для дегидрогеназ ) количественные цветные реакции, спектры поглощения NADH при λ= 340 н. М) NADH NAD Пируват -------> Лактат 8

Единицы измерения активности ферментов n Внесистемная единица активности "U" или "Е" (unit- n В системе СИ в качестве единицы активности фермента единица) и определяется как 1 мкмоль субстрата/мин. используют "катал" (kat). 1 kat = 1 моль/сек. Размерность её слишком велика, пользуются нанокатала (нкат). Это одна миллиардная катала или 10 -9 кат. 1 U = 16, 67 нкат n Удельная активность - активность в пересчете на объем биол. n Молекулярная активность (число оборотов) показывает, сколько молекул S в секунду превращаются в продукт 1 молекулой жидкости, грамм ткани или мг белка-фермента и используется для сравнительной характеристики активности нескольких ферментов (карбангидраза Э 36 000 в мин) СО 2 + Н 2 О Н 2 СО 3 9

Классификация ферментов Тривиальная – исторически сложившаяся (пепсин, трипсин и т. д. ) n Рациональная – название фермента образуется: корень субстрата + суффикс аза амилаза (amyl um) + аза n n Международная в основу положен тип катализируемой реакции (6 типов, поэтому 6 классов) 10

Номенклатура МСТПХ «Правила номенклатуры ферментов» 1972 г. 11

Изоферменты n Изоферменты –группа родственных Е, катализир. одну и ту же реакцию (прямую или обратную), но отличных по физ-хим свойствам: - четвертичной структурой - эарядом (ЭФ подвижностью) - чувствительность к t°, р. Н, ингибиторам - скоростью, направлением реакции и др. n Известно более 100 изоферментов, имеющие различную тканевую локализацию, они используются в энзимодиагностике 12

13

Изоферменты Множественная форма ферментов, катализирующих одинаковые реакции Лактат дегидрогеназа: –Тетрамер, – 2 субъединицы, – 5 изоформ Субъединица соотв B=H и A=M (H – heart, аэробная форма (M – muscle, анаэробная форма) ЛДГ 1 (В 4) ЛДГ 2 (AB 3) ЛДГLDH 3 (A 2 B 2) ЛДГ 4 (A 3 B) ЛДГ 5 (A 4) Есть также 3 -я субъединица Х – in testis. Аналог субъединицы А 14

Роль изоферментов Каждая ткань имеет свой набор изоферментов, что обеспечивает специфику, гибкость, регулируемость и адаптивность ее метаболизма при воздействии внешних и внутренних факторов n В зависимости от возраста, пола, физического состояния и др. в организме устанавливается адаптивное соотношение изоферментов, определяющее уровень его метаболизма n При патологии (опухоли, травмы, воспаление и др. ) в тканях наблюдается «изоферментный сдвиг» n 15

Метаболизм ферментов n Сходен с таковым для белков (протеолиз внутри клетки) n При гибели клеток: Е попадает в кровь → протеолиз в клетках РЭС → оборот (турновер) АК часть Е экскретируются с мочой, желчью и калом n Малая 16

Полиферментные комплексы и метаболоны n Полиферментные комплексы структурно-функциональные блоки, катализирующие ключевые стадии метаболизма (Пируват ДГ) Пируват ---> Ацетил Ко. А комплекс (E. coli) состоит из 60 полипептидов (Мв = 5, 3 · 106 ) n Метаболон – надмолекулярный комплекс нескольких Е метаболического пути (ЦТК, гликолиз и др. ) и структурных элементов клетки, повышающих скорость и эффективность метаболизма 17

Изменение активности Е в онтогенезе В процессе онтогенеза разворачивается генетическая программа, которая сопровождается изменением активности многих ферментов: n n внутриутробный период – активность ферментов ГНГ (синтез глюкозы), аэробного обмена, гидролаз ЖКТ min, после рождения их активность резко возрастает 18

Основные направления медицинской энзимологии n Энзимопатии – патологические состояния, n Энзимодиагностика – диагностика заболеваний путем n Энзимотерапия – применение ферментов в качестве n Применение ферментов в лабораторной практике, обусловленные нарушением активности ферментов определения активности ферментов в тканях, биол. жидкостях и др. объектах лекарств медицинских технологиях и др. 19

Энзимопатии Первичные или наследственные связаны с нарушением экспрессии генетической информации, процессинга и фолдинга ферментов. Возможно также нарушение соотношения естественных активаторов и ингибиторов ферментов. n Вторичные или приобретенные м. б. - алиментарными (дефицит микронутриентов – витаминов, микроэлементов, ненасыщенных ЖК) - токсические отравления, интоксикации n 20

Механизм развития метаболических нарушений при энзимопатиях n При блоке фермента метаболической цепи, [P] дает, а [S] возрастает, что ведет к активации альтернативных минорных метаболических путей и образованию необычных метаболитов, конкурентно ингибирующих естественные метаболические пути. Фен - Тир Фенил-пвк фенил-ацетат фенил-лактат Т 3 , Т 4 меланин АДРЕНАЛИН 21

Энзимодиагностика n Ds-ka заболеваний путем определения в биол. жидкостях и тканях активности Е, которые делятся на: Клеточные Секреторные (гемостаз, ЛП-липаза, …) 3. Экскреторные (ферм. ЖКТ) 1. 2. n Типы активности ферментов в крови: Гиперферментемия (при острых деструктивных проц. ) Гипоферментемия (при дегенеративных проц. ) 3. Дисферментемия (при вялотекущих хрон. процессах – 1. 2. алкогольный цирроз печени и др. ) 22

Задачи энзимодиагностики 1. 2. 3. 4. 5. 6. Ранняя Ds-ka (увеличение АЛТ и АСТ при гепатите гораздо раньше, чем появление желтухи) Дифференциальная Ds-ka (стенокардия и ИМ) Оценка динамики заболевания Оценка эффективности лечения Оценка эффективности выздоровления Оценка прогноза заболевания 23

Объекты энзимодиагностики n Кровь – универсальный коллектор организма (сыворотка, плазма, клетки) n Биологические жидкости – моча, ликвор, слюна, эксудаты, трасудаты и др. n Биоптаты nи др. тканей

Механизмы ферментемий и ферментурий 25

Ферменты энзимодиагностики заболеваний n n n Амилаза Слюнные железы, поджелудочная железа, яичники Заболевания поджелудочной железы Кислая фосфатаза Простата, эритроциты Рак простаты Щелочная фосфатаза Печень, кость, слизистая оболочка кишечника, плацента, почки Болезни костной ткани, болезни печени n n АЛТ Печень, скелетная мышца, сердце Гепатиты АСТ Печень, скелетная мышца, сердце, почки, эритроциты Инфаркт миокарда, Гепатиты, болезни мышц n Холинэстераза Печень Отравление фосфорорганическими инсектицидами, болезни 26 печени

Ферменты энзимодиагностики заболеваний (прод) n КФК и ее изоформы Скелетная и гладкая мышцы, мозг, сердце, Инфаркт миокарда, болезни мышц n ГГТП n ЛДГ Сердце, печень, скелетная мышца, и ее изоформы эритроциты, тромбоциты, лимфоузлы Печень, почки Гепатобилиарные болезни, алкоголизм Инфаркт миокарда, гемолиз, Гепатиты n 5 ' нуклеозидаза. Гепатобилиарный тракт Гепатобилиарные болезни n Трипсин (оген) Панкреас Заболевания поджелудочной железы 27

Изменение активности ферментов в крови при ИМ 28

Энзимотерапия n n n Применение ферментов с лечебной целью: Заместительная терапия болезней ЖКТ (фестал, мезим и т. д. ) В комплексной терапии в виде, орошений, промываний для санации гнойных ран, полостей (протеазы, нуклеазы и др. гидролазы) Для тромболизиса (стрептолиаза, стрептодеказа, урокиназа) Для лечения лейкозов (аспарагиназа) Для рассасывания контрактур и рубцов после ожогов и операций (гиалуронидаза - лидаза) Для лечения вирусных конъюнктивитов и кератитов (РНКаза и ДНК-аза) 29

Иммобилизованные ферменты и липосомы В биотехнологии для повышения эффективности действия Е их иммобилизуют на твердой поверхности или путем внутримолекулярных сшивок n Для «адресной» доставки лекарства к пораженному органу используют: n липосомы загруженные лекарством на их поверхности расположены АТ, специфически «атакующие» определенные клетки и ткани 2. Вирусные векторы (невирулентные формы вирусов), специфически тропные к отдельным клеткам и тканям 1. 30

Применение Е в лабораторной практике Высокая специфичность ферментов позволяет использовать их как хим. реагенты (точное определение в тканях и биол. жидкостях конц. глюкозы, лактата, мочевины и др метаболитов). n Для этого создают сопряженные реакции из нескольких Е n 1 NADP+ NADPН глюкоза ----> Г 6 ф ------> 6 Ф глюконат 2 1. гексокиназа, 2. NADP- зависимая Г 6 ф ДГ Измеряя количество (СФ, флюориметр) образованного NADPН можно судит о конц. глюкозы. 31

Применение ферментов в производстве быту и …. n Биотехнология производства лекарств, препаратов высокой степени чистоты (ОСЧ) n Пищевые технологии в хлебопечении, пивоварении, производстве табака и т. д. n Кожевенном производстве n Стиральные порошки со значком «Е» применяют растительные гидролазы 32

33