Controlul procesului de testare in hemostaza Ioana Culea

Controlul procesului de testare in hemostaza Ioana Culea Institutul Naţional Hematologie Transfuzională Bucureşti

Calitate Totalitatea caracteristicilor unei entităţi care implică capacitatea acesteia de a satisface cerinţe implicite şi explicite Curs ALMR Octombrie 2011 2

Sistemul de management al calităţii “Ansamblul de activităţi coordonate pentru conducerea şi controlul unei organizaţii cu privire la calitate. “ • Sistemul de management al calităţii Ø Stabileste obiectivele şi responsabilităţile calităţii Ø Implementează obiectivele în sistemul calităţii folosind mijloace ca: planificarea calităţii, procesul calităţii, controlul calităţii, evaluarea calităţii şi îmbunătăţirea calităţii Curs ALMR Octombrie 2011 3

Documentaţia calităţii • Politici • Descrieri de procese • Proceduri şi înregistrări Curs ALMR Octombrie 2011 4

Documentaţia calităţii Politica calităţii: declaraţia de intenţie cu privire la cerinţele reglementărilor, acreditării şi standardelor. Curs ALMR Octombrie 2011 5

Organizatii importante pentru standarde de laborator – ISO 9001: 2008 abordează cerinţele generale sistemului de management al calităţii – ISO/ IEC 17025 Cerinţe generale pentru competenţa laboratoarelor de încercări şi etalonări. – ISO 15189 Cerinţe specifice de calitate şi competenţă; specific laboratoarelor medicale. Curs ALMR Octombrie 2011 6

Organizatii importante pentru standarde de laborator CLSI (NCCLS) Clinical and Laboratory Standards Institute – Organizaţie importantă pentru standarde internaţionale utilizate în laborator – CLSI a dezvoltat modelul sistemului de management al calităţii bazat pe cele douăsprezece Esenţiale Sistemului Calităţii, model pe deplin compatibil cu standardele de laborator ISO. Curs ALMR Octombrie 2011 7

Organizatii importante pentru standarde de laborator Documente importante pentru laboratorul clinic: Ø CLSI/NCCLS. A Quality Management System Model for Health Care; Approved Guideline—Second Edition. CLSI/NCCLS document HS 1 -A 2. Wayne, PA: NCCLS; 2004. Ø CLSI/NCCLS. Application of a Quality Management System Model for Laboratory Services; Approved Guideline—Third Edition. CLSI/NCCLS document GP 26 -A 3. Wayne, PA: NCCLS; 2004. Curs ALMR Octombrie 2011 8

Documentaţia calităţii • Descrieri de procese – Descrierile de procese acoperă adesea mai multe departamente. – Diagramele (flow charts) sunt instrumente utile în descrierea unui proces. Curs ALMR Octombrie 2011 9

Documentaţia • Proceduri şi înregistrări – Procedurile de operare standard (SOP) reprezintă o descriere pas cu pas a modului cum se efectuează o metodă sau o anumită activitate la nivelul laboratorului. Politica şi SOP sunt documente folosite în mod obişnuit în laborator dar descrierea de procese poate uneori să nu fie la fel de familiară. Curs ALMR Octombrie 2011 10

Ex. Procedura analitică • • • Subiect Definiţii şi termeni Principiu Siguranţa şi consideraţii privind mediul Reactivi, materiale de control, standarde/ calibratori • Echipament şi resurse: echipament (se dau specificaţiile utile, configuraţia oricărui hard, numele producătorului, şi numărul versiunii softului); resurse (p. H-metre, băi termostat, cuve, pipete) • Probe biologice primare : recoltare, conservare şi manevrare în laborator. Curs ALMR Octombrie 2011 11

Ex. Procedura analitică (cont. ) • activarea echipamentului, întreţinerea zilnică a echipamentului, calibrarea , precauţii, preparare, testare, limitele de detecţie ale metodei, eliminarea deşeurilor, note şi coduri de erori, atitudine faţă de greşeli • Procesarea rezultatelor: înregistrarea datelor, calcularea rezultatelor, note (aspecte speciale referitoare la procesarea rezultatelor) • Raportare: intervalul de referinţă biologică, comunicarea rezultatelor, rezultate ce trebuie transmise telefonic, • Validare: se face trimitere la raportul de validare Curs ALMR Octombrie 2011 12

Poate fi scrisă o singură procedură analitică pentru TP, TTPa, Fibrinogen? DA NU Curs ALMR Octombrie 2011 13

Modelul Sistemului de Management al Calităţii • Modelul de gestionare a sistemului calităţii dezvoltat de CLSI şi pe deplin compatibil cu standardele ISO, organizează toate activităţile de laborator în douăsprezece Esenţiale Sistemului Calităţii (EEC). • Aceste esenţiale sunt activităţi coordonate care servesc ca elemente de construcţie în managementul calităţii. Fiecare trebuie să fie abordat pentru îmbunătăţirea generală a calităţii de laborator. Curs ALMR Octombrie 2011 14

Esenţialele Sistemului Calităţii Organizare Personal Echipament Achizitii şi inventar Controlul Procesului & Managementul probelor Managementul informatiei Documente & Inregistrari Managementul evenimentelor Evaluare Imbunatatirea procesului Serviciu clienti Locatii& siguranta Curs ALMR Octombrie 2011 15

Controlul Procesului – Managementul corespunzător al probei biologice (recoltare-colectare, transport , manevrare), – Validarea şi verificarea metodei, – Controlul calităţii procesului de testare Curs ALMR Octombrie 2011 16

Managementul corespunzător al probei biologice testată în laboratorul de coagulare (recoltare/colectare, transport manevrare) Curs ALMR Octombrie 2011 17

Recoltarea şi manevrarea corespunzătoare a probelor de sânge expediate laboratorului de coagulare cea mai mare importanţă deoarece în faza preanalitică sunt posibile numeroase erori: identificare incorectă a pacientului, ordine incorectă de recoltare, folosire incorectă a tuburilor cu aditivi, erori de etichetare, moment incorect de recoltare, erori de înregistrare. Curs ALMR Octombrie 2011 18

Recoltarea probelor biologice pentru evaluarea coagulării Puncţie venoasă • sisteme care colectează probele biologice direct într-un tub care conţine anticoagulant şi a cărui suprafaţă nu activează coagularea; • siringă cu volum 20 m. L • dispozitiv de acces vascular folosind un sistem de colectare sau o seringă; atenţie la posibila contaminare cu heparină şi la diluţia probei de sânge; • sistem de colectare cu fluturaş –primul tub recoltat (tub fără aditiv sau cu acelaşi anticoagulant) se aruncă iar al doilea va fi folosit pentru testare; Curs ALMR Octombrie 2011 19

Recoltarea probelor biologice pentru evaluarea coagulării • tehnica cu siringă dublă: sângele din a doua siringă va fi folosit ca probă biologică pentru coagulare • ac hipodermic-siringă : este important ca sângele să fie adăugat peste un volum corespunzător de anticoagulant într-un minut de la terminarea recoltării. Indiferent de dispozitivul de recoltare folosit, tuburile trebuie să fie răsturnate de cel puţin 4 ori pentru a se asigura amestecul complet între Curs ALMR Octombrie 2011 20 sânge şi anticoagulant

Ordinea de recoltare a probelor biologice 1. ) tub pentru hemocultură; 2) tub pentru coagulare (ex: dop albastru); 3) tub pentru ser cu sau fără activator de cheag cu sau fără gel (ex: dop roşu) 4) tub cu heparină cu sau fără gel separator de plasmă ( ex: dop verde) 5) tub cu EDTA ( ex: dop mov) 6) tub cu inhibitor glicolitic ( ex: dop cenuşiu) (CLSI H 3 A 6) Rezultatele testului Timp de protrombină (INR) şi rezultatele testului Timp de tromboplastină parţială activat, nu sunt influenţate dacă acestea sunt efectuate pe primul tub recoltat; totuşi, nu există confirmări în cazul altor teste de coagulare. Curs ALMR Octombrie 2011 21

Recoltarea probelor biologice pentru evaluarea coagulării Anticoagulantul • Anticoagulantul folosit pentru testele de coagulare este citratul trisodic forma dihidrat în concentraţie de 3, 13%3, 2% (105 -109 mmol/L) tamponat sau netamponat. • Raportul anticoagulant/sânge 1: 9 • Umplerea necorespunzătoare a tubului de recoltare va reduce acest raport conducând la rezultate incorecte Curs ALMR Octombrie 2011 22

Recoltarea probelor biologice pentru evaluarea coagulării Ajustarea concentraţiei de citrat: • concentraţia finala de citrat trebuie să fie ajustată la pacienţii care au valori ale hematocritului peste 0, 55 L/L(55%); • pentru valori ale hematocritului sub 0, 20 L/L(20%) nu există date care să susţină ajustarea concentraţiei de citrat. Curs ALMR Octombrie 2011 23

Rejectarea probelor necorespunzătoare • Laboratorul trebuie să aibă proceduri pentru tratarea probelor necorespunzătoare. Aceste proceduri trebuie să conţină criteriile de rejectare • Conducerea laboratorului trebuie să analizeze în mod regulat numărul de probe rejectate, să organizeze instruiri referitoare la recoltarea probelor pentru personalul implicat şi dacă este necesar, să revizuiască procedurile pentru managemetul probei. Curs ALMR Octombrie 2011 24

• • Exemple de probe necorespunzătoare Probă coagulată Tub de recoltare spart Probă contaminată Solicitare in duplicat Probă hemolizată, icterică, lipemică Probă recoltată pe tub necorespunzător Probă manevrată necorespunzător Probă fără identificare/ cu identificare nesigură • Volum de probă insuficient pentru o testare corespunzătoare • Probă biologică cu raport anticoagulant/sânge Curs ALMR Octombrie 2011 25 incorect

Procesarea şi păstrarea probei biologice pentru evaluarea coagulării • Obţinerea plasmei: centrifugare la FCR=1. 500 g nu mai puţin de 15 minute plasmă saracă în plachete <10 x 109/L(10. 000/µL) Absenţa celulelor este o condiţie când plasma urmează să fie congelată pentru o testare ulterioară • Testarea TTPa, TP/ INR, TT, pe plasmă proaspătă nu este influenţată când numarul de 9/L) 200. 000/µL. plachete este 200 x 10 Octombrie 2011 Curs ALMR 26

Procesarea şi păstrarea probei biologice pentru evaluarea coagulării • Intervalul de timp dintre recoltarea probei primare şi testarea probei secundare va depinde de temperatura din timpul transportului şi din timpul păstrării probei. • Probele pentru testul Timp de protrombină (TP), necentrifugate sau centrifugate, cu plasma rămasă pe sedimentul celular, în tub închis ţinut la 18 o. C – 24 o. C vor fi testate în 24 ore din momentul recoltării Perioda de păstrare poate influenţa rezultatele TP la pacienţii cu terapie anticoagulantă. Curs ALMR Octombrie 2011 27

Procesarea şi păstrarea probei biologice pentru evaluarea coagulării Probele pentru testul timp de tromboplastină parţială activat (TTP), la pacienţi neheparinaţi, necentrifugate sau centrifugate , cu plasma pe sedimentul celular, păstrate în tub închis la 2 o. C-8 o. C sau 18 o. C-24 o. C , vor fi testate într- un interval de 4 ore din momentul recoltării. Curs ALMR Octombrie 2011 28

Procesarea şi păstrarea probei biologice pentru evaluarea coagulării Probele biologice pentru analizele TTPa suspectate că ar conţine heparină nefracţionată ţinute la 2 o. C -4 o. C sau 18 o. C 24 o. C vor fi centrifugate într-un interval de 1 oră de la recoltare iar plasma testată într - un interval de 4 ore din momentul recoltării. Dacă proba urmează să fie transportată în altă locaţie, plasma va fi separată într-un interval de 1 ora şi testată într-un interval de 4 ore din momentul colectării probei Curs ALMR Octombrie 2011 29

Procesarea şi păstrarea probei biologice pentru evaluarea coagulării • Dacă testarea nu se poate realiza în 24 ore în cazul PT sau în 4 ore în cazul TTPa şi a altor analize, plasma va fi separată şi congelată la – 20 o. C până la 2 săptămâni sau la -70 o. C pînă la 6 luni. Notă: nu sunt recomandate congelatoarele “no frost” • În vederea testării, probele congelate vor fi dezgheţate rapid la 37 o. C şi testate imediat; dacă testarea nu se poate face imediat, probele vor fi păstrate maxim 2 ore la 4 o. C. • TTPa poate fi influenţat în cazul probelor care au fost congelate Curs ALMR Octombrie 2011 30

Validarea şi verificarea metodei Curs ALMR Octombrie 2011 31

ISO 15189 5. 5. 1. 2 • Toate procedurile de examinare trebuie să fie validate pentru a se asigura, pe baza unor dovezi obiective, că specificaţiile de performanţă ale procedurii corespund utilizării sale. • Pentru acele proceduri care au fost validate de cel care a dezvoltat metoda, ex producătorul sau autorul unei metode publicate, laboratorul trebuie să obţină informaţii de la acesta pentru a confirma că specificaţiile de performanţă ale metodei sunt corespunzătoare scopului. Procedurile validate de cel ce a devzoltat metoda trebuie să fie verificate înainte de introducerea în utilizarea de rutina Curs ALMR Octombrie 2011 32

Validarea este un proces care oferă dovezi obiective potrivit cărora cerinţele care definesc o utilizare sau aplicare au fost îndeplinite. Procesul de validare trebuie efectuat în conformitate cu condiţiile de utilizare reale, după conceperea unui plan de validare. Curs ALMR Octombrie 2011 33

Protocol de validare Continut (nu exclusiv) • etapele procedurale necesare pentru efectuarea testului • parametrii peformanţei analitice care urmează să fie validaţi • instrumentul • reactivii şi probele necesare • sursa standardelor de referinţă şi a controalelor • metoda de calibrare • formula de generare a rezultatelor • metodele statistice folosite • criterii pre -definite de acceptare Protocol de validare se incheie cu un raport de validare. Curs ALMR Octombrie 2011 34

Stabilirea performanţei analitice • • Precizia analitică Acurateţea analitică Interferernţe Sensibilitatea analitică Domeniul analitic de măsurare Contaminarea (Carry- over) Compararea unei metode noi cu metoda curentă • Validarea sistemului TP/INR Curs ALMR Octombrie 2011 35

Precizia şi acurateţea • Precizia şi acurateţea sau erorile întâmplătoare şi erorile sistematice sunt caracteristici ale performanţei unei proceduri de măsurare pe care producătorii, în general, le declară iar laboratorul le verifică. Curs ALMR Octombrie 2011 36

Eroarea totală permisă (TEa) • TEa este o cerinţă a calităţii care stabileşte o limită atât pentru imprecizie (eroarea întâmplătoare) cât şi pentru bias (eroarea sistematică )care este tolerabilă într-o singură măsurătoare sau un singur rezultat al testării Curs ALMR Octombrie 2011 37

Eroarea totală • Eroarea totală este definită ca ER (TE)= Bias + Z*SD unde, • Bias=estimarea erorii sistematice • SD=estimarea erorii întâmplătoare • Z=factor de multiplicare (1. 65=95% confidenţă) Curs ALMR Octombrie 2011 38

Precizia Precizie=gradul de variabilitate între măsurători obţinute pe eşantioane multiple dintr-o singură probă sau dintr-un singur material de referinţă • Precizie intra serie de testare determinată prin efectuarea unui test pe aceiaşi probă sau material de control într-o singură serie folosind acelaşi lot de reactiv de cel puţin 20 x • Precizie inter- serii evaluată prin repetarea aceleaşi probe (în mod obişnuit controale) pe acelaşi instrument dar cu includerea altor variabile, în cel puţin 10 serii Curs ALMR Octombrie 2011 39

Acurateţe • Acurateţe= apropierea dintre valoarea test şi valoarea adevărată • În testarea de rutină a hemostazei, acesta poate fi unul din cei mai dificili sau imposibili parametrii de determinat; conceptul de "valoare adevărată"nu se poate aplica testelor ale căror rezultate sunt raportate ca valoare timp (TP, TTPa, TT) Curs ALMR Octombrie 2011 40

Determinarea interferenţelor • Determinarea interferenţelor unei metode este importantă pentru a evita rezultatele false mai ales când interferenţele nu sunt detectate de sistemul de măsurare • Laboratoarele îşi pot determina interferenţele din literatura medicală şi din informaţiile producătorului. Curs ALMR Octombrie 2011 41

Determinarea sensibilităţii la deficienţe ale factorilor de coagulare • Pentru T P şi TTPa, este important să se cunoască sensibilitatea la diferitele deficienţe. • Laboratoarele obţin informaţiile respective de la producători sau din studii publicate. In absenţa acestor informaţii laboratorul trebuie să determine acest parametru al performanţei. Curs ALMR Octombrie 2011 42

Determinarea senisibilităţii la heparină • Implicarea laboratorului în monitorizarea terapiei cu heparină impune ca acesta să evalueze sensibilitatea la heparină a reactivilor APTT noi şi a loturilor noi ale aceluiaşi reactiv. • Aceasta evaluare poate fi realizată prin comparare cu reactivii sau loturile existente sau prin comparare cu o metodă anti-Xa. Curs ALMR Octombrie 2011 43

Domeniul analitic de măsurare • Domeniu analitic de măsurare un domeniu de valori pe care o metodă le poate măsura direct pe o probă, fără diluţie, concentrare sau alt pretratament care nu face parte din procesul obişnuit de testare Curs ALMR Octombrie 2011 44

Verificarea domeniului analitic de măsurare • Verificarea este necesară pentru a stabili domeniul pe care analizele au o acurateţe acceptabilă. Pentru TP, INR, a. PTT, ACT (activated clotting time) şi TT, conceptul de domeniu analitic de măsurare nu este aplicabil deoarece nu există standard de „trueness”. • Pentru testele de coagulare unde există standarde, domeniul analitic de măsurare poate fi verificat. Ex. protocol de verificare: Ø Standarde cu matrix corespunzător , cu valori ţintă sau valori atribuite, care acoperă range-ul de valori Curs ALMR Octombrie 2011 45 care interesează se testează în duplicat.

Verificarea domeniului analitic de măsurare Ø Se calculează deviaţiile absolute şi (relative procente) ale valorilor medii faţă de valorile ţintă (target) Ø Se compară deviaţiile cu limitele de toleranţă definite. Limitele de toleranţă pot fi stabilite de producător, reglementări sau date publicate. În absenţa lor, limitele de toleranţă pot fi stabilite de laborator. Domeniul analitic de măsurare “de lucru” trebuie să fie limitat la cel acoperit de standard. Curs ALMR Octombrie 2011 46

Determinarea stabilităţii reactivului/probei de testat Când nu există informaţii de la producător, studii publicate sau când informaţiile nu sunt credibile este obligatoriu pentru laborator să determine perioada de stabilitate a reactivului/probei de testat Curs ALMR Octombrie 2011 47

Determinarea contaminării (carry over) • Multe analizoare folosesc o singură sondă pentru aspirarea tuturor probelor. Contaminarea de la o probă la alta la altul poate influnţa rezultatele. • Ex. carry-overul neutralizatorilor heparinei din reactivii TP pot scurta în mod artificial valorile TTPa în probele care conţin heparină. • Ex. carry overul heparinei din probele care conţin acest anticoagulant poate prelungi artificial rezultatele TP şi TT • Curs ALMR Octombrie 2011 48

Verificarea sistemului local de testare TP/INR • Este recomandată pentru toate laboratoarele care folosesc ISI specific instrumentului /reactivului. • Este obligatorie pentru laboratoarele care folosesc ISI generic Verificarea PT/INR trebuie să suplimenteze testarea făcută prin programele externe de asigurare a calităţii. Curs ALMR Octombrie 2011 49

Procedura de verificare • plasme certificate (n =3) cu valori INR atribuite care să acopere domeniul terapeutic INR 1. 5 -4. 5 Plasme certificate: probe de plasmă proaspătă congelată sau liofilizată. • Se determină INR –ul acestor plasme cu sistemul de lucru local, Testarea se face în duplicat pe o perioadă de cel puţin 2 zile • Documentul ISTH asupra calibrării PT INR plasmelor certificate folosind sistemul local trebuie să se compare cu valoarea atribuită ± 15%. Curs ALMR Octombrie 2011 50

Procedura de verificare Procesul de verificare nu este validat • Soluţii -1. se verificaă dacă instrumentul funcţionează corect; 2. Se analizează protocolul de verificare) 3. calibrarea locala a sistemului PT/INR Curs ALMR Octombrie 2011 51

Calibrarea locală a sistemului ISI • Calibrarea locală a sistemului ISI poate fi realizată folosind plasme certificate în 2 moduri: *prin calcularea locală a ISI *prin generarea unei linii de calibrare PT/INR ( “direct INR”) Curs ALMR Octombrie 2011 52

Calibrarea sistemului local PT/ INR • 1. determinarea ISI sistem local metodă WHO modificată : • Testarea plasme certificate cu valori TP atribuite • Înregistrare log/ log : valori TP (atribuite) plasme certificate /valori TP obţinute cu sistemul local de testare • Panta liniei de regresie ortogonală = valoarea ISI Curs ALMR Octombrie 2011 53

2. Generarea unei linii de calibrare PT/INR ( “direct INR”) • Plasme certificate cu valori INR atribuite • Se determină TP “local “(reactiv şi instrument propriu) al plasmelor certificate • Înregistrare log : valori INR (atribuite) plasme certificate /valori TP obţinute cu sistemul local de testarecorespunzătoare. Se generează o linie de calibrare folosind regresia ortogonală. V aloarea INR pacient este interpolată din linia de calibrare • Această metodă este independentă de ISI şi de MNPT Curs ALMR Octombrie 2011 54

Diagrama validării sistemului PT/INR • Verificare locală a INR validată invalidată OK calibrare ISI “local” INR “direct” verificare validată invalidată OK Nu se face testarea pacienţilor 1. se evaluează instruentul 2. se testează cu alte tromboplastine 3. se folosesc alte plasme certificate 4. se contactează producătorul şi se urmeză recomandările Curs ALMR Octombrie 2011 55

Compararea metodei • Înainte ca laboratorul să introducă o modificare la o metodă de testare este important să se evalueze cum va influenţa această modificare rezultatele pacientului • O modificare metodologică poate fi minimă: modificarea unui lot de reactivi sau mare: introducerea unui analizor şi a unui reactiv de la alt producător. Curs ALMR Octombrie 2011 56

Controlul calităţii Scop: oferă dovezi documentate că rezultatele sunt corecte şi sigure pentru a fi folosite de clinician • Control intern • Control extern Curs ALMR Octombrie 2011 57

Materiale de control intern • • • Proprietăţi asemănătoare probelor testate Liofilizate (preferate) Fără variaţie flacon → flacon Stabile pe perioada utilizării Control normal Control patologic Curs ALMR Octombrie 2011 58

Frecvenţa/numărul de materiale de control In funcţie de • tipul de test • utilizarea testului • numărul de probe procesate • modul de procesare al probelor Curs ALMR Octombrie 2011 59

Stabilirea limitelor de acceptabilitate • Acoperă variabilitatea de la o zi la alta • Datele oferite de producători au valoare de “ghid” ( pot fi folosite până la obţinerea datelor proprii laboratorului) Curs ALMR Octombrie 2011 60

Stabilirea limitelor de acceptabilitate ex. protocol • Se testează materialul de control de cel puţin 20 x în cel puţin 10 serii analitice • Se calculează media şi deviaţia standard • Cel mai comun domeniu: valoarea medie +/-2 sd • Cel mai comun sistem de procesare: graficul Levey-Jennings cu reprezentarea valorii medii+/2 sd Curs ALMR Octombrie 2011 61

Validarea controlului statistic al calităţii constă în furnizarea de dovezi conform cărora studiile pentru stabilirea limitelor de acceptabilitate sunt efectuate corespunzător, iar aceste limite sunt introduse corect în analizor şi în LIS (sistemul informatic al laboratorului) sau în aplicaţia “QC” (acolo unde este cazul) Curs ALMR Octombrie 2011 62