Будова та властивості ДНК Докази генетичної функції ДНК

Будова та властивості ДНК

Докази генетичної функції ДНК (самостійна робота) Досліди Гріфітса, Евері, Херші і Чейза. Правила Чаргаффа. Первинна структура ДНК. Компоненти хімічної структури ДНК. Полінуклеотидний ланцюг. Нуклеази. Макромолекулярна структура нуклеїнових кислот. Подвійна спіраль. Структурні форми ДНК. Властивості молекули ДНК. Розмір молекул ДНК. Денатурація та ренатурація ДНК. Кільцева ДНК. Топоізомерази.

Відкриття нуклеїнових кислот У 1868 р. швейцарський біохімік Фрідріх Мішер виявив у ядрах білих кров’яних тілець хімічну речовину, що містила фосфор, яку він назвав нуклеїном, або нуклеїновою кислотою. Скляна пробірка з нуклеїном, виділеним Ф. Мішером із сперми лосося під час роботи в Базельському університеті. На вицвілій етикетці написано “Nuclein aus Lachssperma, F. Miescher” (Нуклеїн зі сперми лолося, Ф. Мішер). Восени 1871 р. він розпочав роботу зі спермою лосося і розробив ряд методів для виділення нуклеїну (опубліковані після смерті Ф. Мішера), які дозволили йому отримати значну кількість очищеного нуклеїну.

Досліди Евері, Маклеода та Маккарті Культура віруленетних бактерій ІІІS Фільтрат бактерій ІІІS 1 2 3 1 2 3 РНКаза протеаза ДНКаза Додавання до культури бактерій ІІR IIIS IIIS IIR

Hershey & Chase

1950 р. – Ервін Чаргафф (1905–2002) вперше визначив сталі й специфічні для дезоксирибонуклеїнових кислот кожного біологічного виду кількісні співвідношення між пуриновими та піримідиновими азотистими основами – “правила Чаргаффа”, або “принцип комплементарності”, що став одним з головних теоретичних обгрунтувань уявлення про двоспіральну молекулу ДНК та механізм її реплікації.

Первинна структура ДНК. Компоненти хімічної структури ДНК. Міжнуклеотидний зв’язок.

Первинна структура ДНК. Компоненти хімічної структури ДНК Мономерна одиниця нуклеїнової кислоти – нуклеотид – складається з трьох елементів: азотиста основа, пентозний цукор, залишок фосфорної кислоти.

Первинна структура ДНК. Компоненти хімічної структури ДНК Азотисті основи - гетероциклічні сполуки, у кільцях яких містяться Карбон і Нітроген, а всі зв’язки мають характер частково подвійних. До складу нуклеїнових кислот входять два типи азотистих основ: пурини (purines, загальноприйняте позначення R) - аденін (A) і гуанін (G); піримідини (pyrimidines, Y) - урацил (U), тимін (T), цитозин (C). Загальне позначення для всіх основ - N.

Властивості азотистих основ: ▪ Оскільки всі зв’язки в кільці - частково подвійні, азотисті основи є планарними - усі атоми кільця лежать практично в одній площині. ▪ Атоми Нітрогену кільця та приєднані до нього атоми Оксигену є акцепторами, а NH2-групи - донорами водневого зв’язку. ▪ Площина кільця є гідрофобною, тому азотисті основи погано розчиняються у воді.

▪ Один із атомів Нітрогену кільця приєднується у складі нуклеотиду до Карбону пентозного цукру глікозидним зв’язком і позначається С1′ (символ прийнято додавати, щоб відрізняти атоми фуранозного кільця пентози від атомів азотистої основи). ▪ Інші С′-атоми пентози нумеруються далі за порядком їхнього розташування. До 3'-атома завжди приєднана ОН-група.

Оксипохідні пурину та піримідину, залежно від рН середовища, можуть перебувати у двох таутомерних формах - лактамних (оксоформах) і лактимних: У складі нуклеотидів нуклеїнових кислот всі оксипохідні пурину та піримідину перебувають у лактамній формі, що сприяє утворенню міжмолекулярних водневих зв'язків між пуринами та піримідинами окремих ланцюгів у дволанцюговій структурі молекул ДНК та в РНК.

►Пентози та фосфатні залишки є полярними й добре взаємодіють з водою. ► Пентоза не містить подвійних зв’язків. Тому у фуранозному кільці пентози є можливим обертання навколо зв’язків, і воно не є планарним. ► Конформація С2'-ендо (С2′-атом виходить у бік С5′-атома з площини, заданої атомами С4′-О-С1′) є домінуючою для дезоксирибози. ► Поява ОН-групи замість гідрогену при С2′-атомі робить цю конформацію неможливою, і для рибози переважною стає конформація С3'-ендо.

При зміні конформації (С3′-ендо→С2′-ендо) вуглеводного залишку змінюється відстань між фосфатними групами в полінуклеотидному ланцюзі. Перемикання цих двох конформацій суттєво змінює геометрію інших зв’язків у складі нуклеотиду й тому лежить в основі перетворень між структурними формами нуклеїнових кислот.

Нуклеозиди - двокомпонентні біоорганічні молекули, які складаються з азотистої основи пуринового чи піримідинового ряду та пентози (D-рибози або 2′-дезокси-D-рибози) - рибонуклеозиди та дезоксирибонуклеозиди відповідно: За своєю хімічною будовою нуклеозиди є N-глікозидами рибози або дезоксирибози та азотистої основи. В утворенні відповідних N-глікозидних зв’язків у піримідинових нуклеозидах бере участь N1 піримідину та С1′ пентози, а в пуринових - N9 пурину та С1′ пентози.

У зв'язку з можливістю вільного обертання навколо N-глікозидного зв’язку, нуклеозиди (та нуклеотиди, що їм відповідають) можуть знаходитися в анти- та син-конформаціях: Вільні пуринові нуклеозиди (та нуклеотиди), які знаходяться в розчині, можуть набувати як син-, так і анти-конформацїї, тоді як для вільних піримідинових нуклеозидів (та нуклеотидів) переважаючою є анти-конформація. У складі нуклеїнових кислот (особливо у двоспіральних молекулах ДНК та РНК) просторове взаєморозташування азотистих основ та пентоз відповідає анти-конформації, що є необхідною стеричною умовою для утворення водневих зв'язків між комплементарними нуклеотидами.

Нуклеотиди Фосфорилювання (ацилування фосфорною кислотою) певного гідроксилу в пентозі, що входить до складу нуклеозиду, приводить до утворення нуклеотиду (нуклеозидфосфату). До складу нуклеотидів (та нуклеозидів) ДНК входить 2′-дезокси-D-рибоза, до складу РНК входить D-рибоза: Найважливішою для нуклеїнових кислот властивістю фосфатного залишку є негативний заряд, який він має за нейтральних рН. На відміну від азотистих основ, пентози та фосфатні залишки є цілком полярними й добре взаємодіють з водою.

Отже, нуклеотид складається з двох елементів, які розрізняються за полярністю та конформаційною рухливістю: • Полярна й досить гнучка частина - пентозний цукор із фосфатним залишком, який має негативний заряд. • Жорстка планарна азотиста основа, яка в цілому є неполярною, хоча й містить донорні та акцепторні групи.

Залежно від місця фосфорилювання пентозного гідроксилу розрізняють три типи нуклеотидів (нуклеозидфосфатів): В результаті гідролізу нуклеїнових кислот, залежно від місця розщеплення фосфодіефірних зв'язків в молекулах полінуклеотидів, утворюються нуклеозид-5′-фосфати та нуклеозид-3′-фосфати. Крім різниці в пентозах, нуклеотиди РНК та ДНК відрізняються також за складом піримідинових основ (в РНК - цитозин, урацил, в ДНК - цитозин, тимін). С5′ С3′ С2′

Крім основних п'яти азотистих основ (двох пуринових та трьох піримідинових), до складу деяких нуклеїнових кислот входять у відносно незначних кількостях додаткові (мінорні) азотисті основи та відповідні їм мінорні нуклеотиди. Найбільша кількість мінорних нуклеотидів зустрічається в молекулах транспортних РНК (тРНК) – до 5% нуклеотидного складу. До мінорних нуклеотидів належать метильовані похідні звичайних азотистих основ, наприклад, 5-метилцитозин, 5-гідроксиметилцитозин, 5-гідроксиметилурацил, 2-аміноаденін та ін. ДНК людини містить значну кількість 5-метилцитозипу. Модифіковані пурини і піримідини

В молекулі ДНК деяких бактеріофагів до гідроксильної групи гідроксиметилцитозину приєднані моно- або дисахариди.

Нуклеотидами незвичайної структури у складі тРНК є дигідроуридин та псевдоуридин, в якому рибоза приєднана до урацилу в 5-му положенні, тобто не Нітроген-Карбоновим, а Карбон-Карбоновим зв'язком: Біологічні функції мінорних нуклеотидів до кінця не з’ясовані. Деякі вільні рибонуклеотиди та їхні похідні, що не входять до складу нуклеїнових кислот, виконують функції кофакторів, алостеричних ефекторів різних ферментних систем.

ДНК – полімер, у складі якого чергуються 4 різних мономери – нуклеотиди - в різній послідовності. Нуклеотид містить одну з 4-х гетероциклічних азотистих основ. Полінуклеотидні ланцюги утворюються з’єднанням дезоксирибозних залишків фосфодіефірними зв’язками. Кожний фосфат з’єднує гідроксильну групу біля С3′ дезоксирибози одного нуклеотиду з ОН-групою біля С5′ дезоксирибози сусіднього нуклеотиду.

Полінуклеотидний ланцюг має напрямок: на одному його кінці залишається 5′-фосфат (5′-кінець), на іншому 3′ ОН-група (3′-кінець). Послідовності нуклеотидів прийнято записувати в напрямку 5′→3′, у тому ж напрямку відбувається синтез усіх нуклеїнових кислот. Полярний остов полінуклеотидного ланцюга представлений фосфатними залишками та пентозами, що чергуються - цукрофосфатний остов. Від цього остова відходять азотисті основи як бокові залишки.

Подвійна спіраль. Стабілізація подвійної спіралі.

Між остовами на поверхні спіралі утворюються два жолобки - великий і маленький (major/minor groove), в які дивляться донорні та акцепторні групи азотистих основ. У великому жолобку міститься по два акцептори (O, N) та одному донору (-NH2) водневого зв’язку кожної пари; у маленькому - два акцептори пари А-Т, два акцептори й один донор пари G-C.

Усередині спіралі формується стопка (stack) пар основ, захищена на поверхні спірально закрученими один навколо одного полярними цукрофосфатними остовами. Гідрофобні взаємодії між площинами пар азотистих основ зумовлюють формування подвійної спіралі. При цьому реалізується щільна упаковка - утворюються вандерваальсові контакти між сусідніми парами. Такі контакти уздовж осі спіралі робить їх суттєвим фактором стабілізації дуплекса. Такі взаємодії складного характеру (гідрофобний ефект + вандерваальсові взаємодії) у складі стопки мають назву - стекінг-взаємодії. Отже, стекінг-взаємодії - головний фактор стабілізації подвійної спіралі.

Пари основ A-T, G-C – комплементарні пари Вміст пуринових нуклеотидів (A+G) = вмісту піриримідинових нуклеотидів (G+ C) Число А = числу T Число G = числу С Утворення пар між двома пуринами, двома піримідинами або некомплементарними основами (А-С або G-T) стерично ускладнене. Геометрія двох типів пар основ практично є однаковою

Будова і параметри уотсон-криківських пар Пари основ A -T, G-C: ●Близькі за формою і мають однакові розміри ●Зв’язані віссю симетрії 2-го порядку і є псевдосиметричними: при повороті на 180о навколо осі, що лежить в площині малюнка, співпадають тільки С1′-атоми ●Є енергетично найбільш вигідними ●Стабілізовані переважно електростатичними взаємодіями ● G-C – пари суттєво стабільніші за A-T Отже, стабільність подвійної спіралі залежить від послідовності пар основ

Гетероциклічні основи нуклеїнових кислот є гідрофобними, тобто у водному розчині їм вигідніше розташовуватися один над одним При утворенні таких стопок у взаємодію вступають функціональні (С=О і С-NН2) групи однієї основи і електронні системи сусідньої по вертикалі основи Стекінг-взаємодії основ залежать від складу комплементарних пар та їхньої послідовності. Міжплощинні взаємодії основ Перекривання основ у подвійній спіралі

стабільність подвійної спіралі залежить також від температури: при зростанні температури ентропійна компонента вільної енергії збільшується і відбувається розходження ланцюгів - плавлення подвійної спіралі. температура плавлення - є мірою стабільності й залежить від послідовності пар основ. стабільність подвійної спіралі (і температура плавлення) залежить від іонної сили розчину і зростає при підвищенні концентрації солі.

Структурні форми ДНК.

ДНК може існувати в кількох можливих конформаціях. Зараз ідентифіковані та описані такі: A-ДНК, B-ДНК, C-ДНК, D-ДНК, E-ДНК, H-ДНК, L-ДНК, P-ДНК і Z-ДНК. Проте, тільки A-, B- і Z- форми ДНК спостерігалися в природних біологічних системах. Конформація, яку приймає ДНК, залежить від послідовності ДНК, величини та напрямку суперскрученості, хімічних модифікацій основ і концентрації хімічних речовин у розчині, перш за все концентрацій іонів металів і поліамінів. Із всіх конформацій, B-форма є найзагальнішою формою за умов, які властиві більшості клітин.

ДНК із майже будь-якою послідовністю пар основ може існувати у двох структурних формах А і В. А і В спіралі є правими. Основні відмінності між двома формами ДНК зумовлені різною конформацією цукру – С2'- та С3'-ендо, тому в А-формі порівняно з В-формою: Скорочується відстань між фосфатними залишками. Зменшується ступінь правої спіральної закрутки. Кожна пара основ суттєво нахиляється до осі спіралі (у В-форм і пари майже перпендикулярні до осі). Унаслідок нахилу в А-формі скорочується відстань між сусідніми парами основ уздовж осі спіралі. “”Великий”” і “”маленький”” жолобки є справді великим і маленьким для В-форми, в А-формі їхні відносні розміри міняються місцями.

В-форма спіралі характерна для волокон ДНК при високій відносній вологості (92%) і в розчинах низької іонної сили. У такій формі ДНК знаходиться у живій клітині Молекула ДНК знаходиться у формі подвійної правозакрученої спіралі Ланцюги мають антипаралельну орієнтацію Відстань між парами основ 0,34 нм. Основи направлені всередину спіралі Спіраль робить повний оберт через кожні 10 основ На зовнішній поверхні спіралі – велика (завширшки 2,2 нм) і мала (1,2 нм) борозенки Діаметр спіралі постійний (1,8 нм) В-форма подвійної спіралі

Комплементарні основи знаходяться в одній площині Сусідні пари основ в ДНК обернуті одні відносно інших на 36о В-форма подвійної спіралі

● Рідко зустрічається, перехід А→В in vitro за певних концентрацій солей і спиртів у розчині, при зниженій вологості у фібрилах ● Площини основ складають з перпендикуляром до вісі спіралі кут 20о. ● Залишок дезоксирибози знаходиться в С3′-ендо-конформації (у В-формі – в С2′-ендо-конформації) зменшується відстань між фосфатними групами зменшується відстань між нуклеотидними парами вздовж вісі спіралі (0,29 нм) ● на виток спіралі припадає 11-12 нуклеотидних залишків ● Всередині спіралі виникає порожнина діаметром 0,40 нм ● Спіраль правозакручена А-форма подвійної спіралі ● в А-формі відносні розміри жолобків міняються місцями.

А-форма є фізіологічною: Усі подвійні спіралі РНК існують в А-формі за фізіологічних умов (оскільки рибоза не може набувати С2′-ендо-конформації) Гібридні подвійні спіралі РНК-ДНК, зокрема під час транскрипції, набувають А-форми В комплексі з білками ДНК може переходити в А-форму

Z-форма ДНК – реалізується тільки коли G-С пари чергуються по ланцюгу. Перехід у Z-форму in vitro відбувається при концентрації NaCl – 2,5 моль/л ● Особливість - чергування конформацій нуклеотидних залишків: Одиниця, що повторюється складається з 2-х пар нуклеотидів (у В і А-формах – з однієї) ● Відстань між парами основ - 0,77 нм ● 12 пар основ на виток спіралі ● Остов молекули має зигзагоподібну форму ● Спіраль лівозакручена Z-форма подвійної спіралі

Властивості молекули ДНК.

Розмір молекули ДНК виражається кількістю пар нуклеотидів За одиницю приймається 1000 пар нуклеотидів (т.п.н.) Мол.маса 1 т.п.н. в середньому дорівнює 6,6 × 105 Довжина поглинання – 340 нм Існує відповідність між довжиною ДНК і масою невеликої хромосоми

Денатурація (дисоціація) дволанцюгової ДНК при підвищенні температури розчину та ренатурація (реасоціація) двох комплементарних ланцюгів при охолодженні

Крива денатурації типової дволанцюгової ДНК, отримана при підвищенні температури Тm – значення температури за яких ДНК денатурована (або ренатурована) на 50% Тm зростає із зростанням вмісту GС-пар Дволанцюгова ДНК

Найпростішою характеристикою плавлення ДНК переважно є температура плавлення Tm, яка відповідає температурі, за якої половина ДНК є денатурованою. За сталого складу розчинника температура плавлення лінійно залежить від частки GC-пар в ДНК, ХGC : Тm = ТАТ + (ТGC - TAT)×ХGC , де через TAT и TGC позначені температури плавлення молекул ДНК, які складаються тільки з AT- і тільки з GC-пар, відповідно.

Крива денатурації типової дволанцюгової ДНК, отримана при підвищення рН рНm – значення рН за якого ДНК денатурована (або ренатурована) уполовину рНm зростає із зростанням вмісту GС-пар Дволанцюгова ДНК

Якщо t або рН знижуються поступово, то ланцюги спарюються з відновленням усіх вихідних пар основ. У разі різкого зниження рН або t вірне з’єднання ланцюгів ускладнене за рахунок спарювання основ локально комплементарних ділянок у межах одного або різних ланцюгів.

Ренатурація (реасоціація) – процес воз’єднання Швидкість процесу ренатурації описують рівнянням: С/С0= 1/ (1+ kС0t) С – концентрація одноланцюгової ДНК, С0 – сумарна концентрація ДНК, t – час, k - константа швидкості 2-го порядку, С0t – величина, за якої реасоціація відбувається на 50% Послідовність ДНК, яка часто зустрічається в геномі, буде реасоціювати швидко; Швидкість реасоціації нуклеотидної послідовності, яка зустрічається із середньою частотою, буде мати проміжне значення; Рідкісні послідовності ДНК в геномі будуть ренатурувати дуже повільно.

Кільцева ДНК. Топоізомерази.

ДНК майже завжди існує іn vivo у вигляді кільцевої ковалентно замкненої молекули (прокаріоти) або у формі, що є еквівалентною кільцевій - у вигляді петель, закріплених своїми кінцями на скелетних структурах клітинного ядра.

У молекулі, два кінці якої жорстко зафіксовані або з’єднані один з одним, виникають топологічні обмеження, і це має важливі біологічні наслідки. Кільцева ДНК може існувати в трьох топологічних формах: суперскрученій (supercoiled), вузловатій (knotted) і скутій (catenated). Вузловата і скута форми ДНК можуть переходити в суперскречену.

Центральним поняттям топології кільцевої ДНК є так зване число зчеплень Lk (linking number) двох полінуклеотидних ланцюгів - двох кілець, закручених одне навкруг одного в подвійну спіраль. Число зчеплень визначається як кількість перетинів одним циркулярним контуром поверхні, що натягнута на другий контур. У найпростішому випадку два кільця можна зчепити одне з одним один раз (Lk = 1), і будь-які деформації кілець (за умови збереження цілісності кожного кільця) не змінять цієї величини: кільця не можна ні розвести, ні збільшити ступінь зчеплень.

Якщо ДНК знаходиться у релаксованому стані, то Lk= Тw Тw (твіст) = числу витків у подвійній спіралі ДНК Енергетично найвигідніша форма ДНК, коли Tw = Tw0. Тоді при замиканні в кільце ДНК набуде найбільш енергетично вигідної планарної форми, у складі якої реалізується мінімальний вигин молекули. Схема утворення негативно суперспіралізованої кільцевої ковалентої замкненої ДНК

Збільшення або зменшення витків спіралі компенсується утворенням супервитків. Wr – число супервитків (райзинг) = Lk - Тw δ – щільність супервитків, яка характеризує ступінь суперспіралізації ДНК = Wr /Тw Wr може бути позитивою і негативною величиною Схема утворення негативно суперспіралізованої кільцевої ковалентої замкненої ДНК

Якщо зробити одноланцюговий розрив, збільшити кількість витків подвійної спіралі на 1 (закрутити подвійну спіраль торсійно) і зашити розрив, відновивши ковалентний зв’язок, то кількість зчеплень зросте на 1: ΔLk набуде значення +1, яке розподілиться між зміною твіста та райзингом. Виникає позитивну надспіралізацію, яка є топологічно еквівалентною зростанню закрутки подвійної спіралі. Відповідно, розкручення подвійної спіралі після розриву та наступне відновлення цілісності ланцюга призведе до негативної надспіралізації з ΔLk = -1. Однакові кільцеві молекули ДНК, які різняться лише кількістю зчеплень (як три молекули з Lk = 19, 20 та 21, називаються топоізомерами.

Функціональні процеси (у першу чергу, транскрипція і реплікація) призводять до виникнення надспіралізації. Оскільки молекула ДНК –- спіраль, пересування ДНК- або РНК-полімерази супроводжується прокручуванням подвійної спіралі всередині величезного мультибілкового комплексу. Локальне розкручування подвійної спіралі попереду ДНК- або РНК-полімерази має бути компенсованим позитивною надспіралізацією, відновлення спіралі (закручування) –надспіралізацією негативною. У результаті попереду й позаду від транслокази виникаютьдві “хвилі” надспіралізації протилежного знаку.

ДНК-топоізомерази (topoisomerases) - знімають надспіралізацію, релаксуючи ДНК. Топоізомерази каталізують і забезпечують розплітання ДНК шляхом створення розривів в обох ланцюгах ДНК, при цьому каталіз здійснює консервативний залишок тирозину в активному центрі ферменту. Вбудовування вірусної ДНК в хросоми господаря та інші форми рекомбінації також потребують присутності топоізомераз. До топоізомераз I належать ферменти, які каталізують зміни топологічного стану молекули за допомогою однониткового розриву-зшивання двониткової ДНК, до топоізомераз II – за допомогою двониткового розриву-зшивання.

Топоізомерази І (мономерні білки), поділяються на два підкласи Іa і Іb, здійснюють одноланцюговий розріз ДНК. Топоізомерази Іа (присутні як у про- так і в еукаріотів) здатні релаксувати тільки негативно надспіралізовану ДНК. У результаті число зчеплень змінюється на одиницю в напрямку зниження рівня негативної надспіралізації . Основна роль топоізомераз цього типу - підтримувати певний оптимальний рівень надспіралізації в ДНК бактеріальної клітини. Топоізомерази Іb (тільки еукаріотичні) переводять будь-яку ДНК у максимально релаксований стан. Lk в результаті роботи топоізомерази змінюється на величину, кратну одиниці, - на кількість обертів. Таким чином, топоізомерази І обох типів змінюють число зчеплень шляхом зміни твіста подвійної спіралі.

Топоізомерази ІІ, на відміну від топоізомераз першого класу, змінюють число зчеплень шляхом зміни райзингу кільцевої ДНК. Ці субодиничні білки мають два активні центри, в яких відбувається розрізання обох полінуклеотидних ланцюгів; фермент є активним тільки у присутності АТР, гідроліз якої використовується для здійснення конформаційних змін білка. 1) ділянка ДНК, яка називається G-сегментом, зв'язується з ферментом, що викликає спорідненість ферменту до АТР; 2) у відповідь на зв’язуванняАТР відбувається конформаційна зміна, яка супроводжується замиканням іншої зв'язаної ділянки ДНК – Т-сегмента, і дволанцюговим розривом у складі G-сегмента; 3) відбувається гідроліз АТР, що приводить до проштовхування Т-сегмента крізь розрив; 4) здійснюється зшивання розриву та звільнення обох сегментів.

Отже, хоча конструкція молекули ДНК є простішою за білкову, на сьогодні неможливо точно передбачити деталі структури ДНК, виходячи з її послідовності. Залежні від послідовності особливості структури подвійної спіралі та потенціал щодо конформаційних змін - основа механізму специфічного впізнання послідовностей ДНК білками.