Биотехнология растений Трансгенные растения-1 1. Молекулярные механизмы

Биотехнология растений

Трансгенные растения-1 1. Молекулярные механизмы взаимодействия растения – агробактерии 2. Векторы на основе агробактерии 3. Селективные и репортерные гены 4. Методы трансформации 5. Замолкание (сайленсинг) генов у трансгенных растений

Нобелевская премия , основоположник 1 и 2 -ой Зеленой революции. Норман Эрнст Борлаг Норман Борлаг получил новые сорта пшеницы с повышенной урожайностью. Начало «Зеленой Революции» в сельском хозяйстве.

X 4 Методы традиционной селекции растений 1. Близкородственное скрещивание (имбридинг) родительска я форма 1 потомство отбор 2. Отдаленное скрещивание (аутбридинг) родительска я форма 1 Xродительска я форма 1 потомство (гетерозисные гибриды) отбор родительска я форма 2 3. Мутагенез родительская форма потомство (мутанты) отбормутагенез

Teosinte Maize Slidecourtesyof. Wayne. Parrott, Universityof. Georgia теосинте кукуруза

Slidecourtesyof. Wayne. Parrott, Universityof. Georgia

ген интереса. Традиционная селекция растений ДНК – цепь генов. Традиционная селекция сразу комбинирует много генов. Переносится много «балласта» Традиционный донор Коммерческая разновидность Новая разновидность ген интереса X = ( скрещивание ) ( перенесено много генов ) Биотехнология растений Используя биотехнологию, можно перенести только один ген интереса Коммерческая разновидность Новая разновидность ( перенос ) = ген интереса (целевой ген) ( перенесен только ген интереса )

В чём преимущества методов генной инженерии по сравнению с традиционной селекцией? Значительное ускорение создания сорта (1 -3 года против 10 и более лет). Избавление от значительного количества «генетического балласта» . Создание растений с заданными признаками. Традиционная селекция отбирает растения, которые нас устраивают, биотехнология создает растения, которые нам нужны. Большая возможность контроля целевого гена за счет управления его экспрессией в нужных органах, тканях и в нужное время.

Г енетически м одифицированный о рганизм (ГМО) — организм, генетический материал которого (ДНК) изменен не в ходе естественной гибридизации (вертикального переноса генов от родителей потомству), а с помощью горизонтального переноса генов от одного организма — другому. Процесс горизонтального переноса называется генетической трансформацией , а ГМО – трансгенным организмом.

1975 г. — группы из компании Монсанто, из Гентского государственного университета (Бельгия), из Института растениеводства им. Макса Планка в Кельне (Германия) и группа из Вашингтонского университета создали первые трансгенные растения — санбин. 1990 г. — первое коммерческое применение ГМО в США. 1992 г. — в Китае начали промышленно выращивать трансгенный табак, устойчивый к насекомым. 1994 г. — в США зарегистрировали первое трансгенное растение, предназначенное для употребления в пищу, — томаты “Флавр-Савр” с замедленным созреванием. 1999 г. — получены трансгенные растения более чем 120 видов. История развития получения трансгенных растений

В. Монтегю и Й. Шелл

Уолтер Гилберт Создание ГМ растений с полезными свойствами – устойчивостью к гербицидам, вредителям и вирусам. 1980 -е годы

Основные культуры трансгенных растений Соя Кукуруза Хлопок Рапс Картофель 54% 28% 9% 9% 0, 01%Соя 54, 00% Кукуруза 28, 00%Хлопок 9, 00% Рапс 8, 99% Картофель 0, 01%

Основные направления биотехнологии: производство продуктов питания с заданными характеристиками; производство веществ вторичного метаболизма и фармбелков; получение растений с декоративными признаками; использование трансгенных растений в фундаментальных исследованиях.

Векторные системы для переноса генов в растения Вирусы растений Транспозоны Агробактерии

Схема агробактериальной трансформации A. tumefaciens Ti-плазмида Т-ДНК Хромосома Хромосомная ДНК Т-ДНК Трансформированная клетка Корончатый галл

Геном агробактерий A. rhizogenes. A. tumefaciens A. vitis 3 Мб 3 Мб 2 Мб хромосома II 2 , 65 Мб 3 Мб 450 кб 200 кб Хромосома I p. At p. Ti/p. Ri p. Tip. At 200 кб

HN NH 2 C NH (CH 2 ) 3 CH COOH NH CH COOHCH 3 Октопин. HN NH 2 C NH (CH 2 ) 3 CH COOH NH CH COOH (CH 2 ) 2 HOOC Нопалин Агропин. Катаболизм опина. Л ПАуксин Цитокинин Опин. Т-ДНК ori. Гены vir Структура Ti- плазмиды и основные опины O N O OH OHO

Синтез опинов 10 R 1 COOH O NH 2 CH R 2 COOH НАД(Ф)Н Н 2 OH + НАД(Ф) COOH R 1 CH NH CH R 2 COOHКетокислота Аминокислота N- карбоксиалкиламинокислота (опин) Опины образуются из аминокислот и кетокислот путем восстановительной конденсации.

Гены биосинтеза опинов 13 Тип плазмиды Гены биосинтеза опинов Синтезируемые опухолью опины Нопалиновые p. Ti. C 58, p. Ti. T 3 7 Acs (агроцинопинсинтаза) Nos ( нопалинсинтаза ) Нопалин , нопалиновая кислота Агроцинопины А и B Октопиновые p. Ti. A 6, p. Ti. B 6 S 3 Ocs (октопинсинтаза) Ags (агропинсинтаза) Mas 1, Mas 2 (маннопинсинтазы) Маннопин, маннопиновая кислота; агропин, агропиновая кислота; октопин, лизопин, гистопин, лизопиновая кислота Агропиновые p. Ri А 4, p. Ri А 281 Ags (агропинсинтаза) Mas 1, Mas 2 (маннопинсинтазы) Маннопин, маннопиновая кислота; агропин, агропиновая кислота Маннопиновые p. Ri 8196 Mas 1, Mas 2 (маннопинсинтазы) Маннопин, маннопиновая кислота

Т-ДНК Ti и Ri- плазмид – обмен фрагментами acs nosrol. B-H iaa. M 6 a tml LB RB LB 1 RB 1 ags RB 2 LB 2 tmr PTi-SAKURA PTi 15955 Гены биосинтеза гормонов Гены-индукторы пролиферации. Опиновые гены Псевдогеныacs iaa. H iaa. M ons tmltmr ocs mas 1 mas 2 rol. A rol. B rol. C m as 2 RBorf 14 orf 13 a. PRi 8196 ( фрагмент) m as 1 ОРС с неизвестной функцией 205 PRi 15834 (TR-DNA ) agsmas 1 mas 2 Rol. B TRaux 2 aux 1 LB RB Пермеазы. A. tumefaciens A. rhizogenes lsnlso RBL BP Ti. AB 2/73 A. tumefaciens

Онкогены A. tumefaciens 51. tms- гены (iaa. M, iaa. H) Триптофан Индолацетамид Аукси нiaa. M iaa. H Гены бактериального происхождения , гомологи аналогичных генов у других ауксин-синтезирующих фитопатогенов Pseudomonas savastanoi iaa. H 6 biaa M i pt

Онкогены A. tumefaciens 62. tmr- ген (ipt) HMBDP Зеатинрибозид – 5 -МФ Транс-зеати нipt iaa. H 6 biaa M i pt

Онкогены A. tumefaciens 73. tml- локус (6 a, 6 b) 6 a – опиновая пермеаза 4. ген 5. Индол-3 -лактат56 b – онкоген с неизученным механизмом действия, взаимодействует с некоторыми хозяйскими ТФ. Триптофа н

Онкогены A. rhizogenes. 8 Rol. A — есть на всех Ri -плазмидах. Снижает концентрацию ауксина, повышает чувствительность к нему. Экспессируется и в самих бактериях. Rol. B – рассматривается как основной онкоген A. rhizogenes. Повышает чувствительность клеток к ауксину Rol С – b- гликозидаза. Гидролизует неактивные цитокинин-гликозиды или влияет на клеточный цикл через регуляцию метаболизма сахаров. Rol. D – орнитин-циклодеаминаза Набор онкогенов A. rhizogenes не совпадает с набором онкогенов A. tumefaciens и не всегда содержит гены синтеза гормонов. Пролин. Орнитин Rol.

Онкогены A. rhizogenes. 9 ORF 13 – связывает белок ретинобластомы ( Rb). Стимулирует пролиферацию клеток, вызывает эктопическую экспрессию KNOX -генов. В конечном итоге способствует дедифференцировке трансформированных клеток и образованию новой меристемы aux 1, aux 2 – гены синтеза ауксина, гомологи iaa. M и iaa. H. Только у агропиновых штаммов.

Опиновая концепция 12 Т-ДНК Опины

Сигнальные молекулы C CH 3 O OHCH 3 O OCH 3 Ацетосирингон C CH 2 OHO OHCH 3 O OCH 3 Гидроксиецетосирингон

Интеграция Т-ДНК в геном растения VI ? Vir. BVir. E 2 Vir. D 1 Vir. C 1 Vir. B Vir- область Vir. E 2 Vir. D 1 Vir. D 2 Vir. C T -цепь в комплексе с Vir. E 2 и Vir. D 2 RBLB T -ДНК III IV VII I P P P Vir. A Vir. G + P Ti -плазмида Цитоплазма агробактерии Оболочка клетки агробактерии Vir- область Сигнальные молекулы растительной клетки Ядро Т-ДНККлеточная стенка растения-хозяина. Цитоплазма растительной клетки

Требование к векторным системам Идеальная векторная система на основе Ti-плазмиды должна содержать: сигналы, необходимые для переноса и стабильной интеграции в ДНК растений; узнаваемый растительными полимеразами промотор; селективный маркер для селекции трансформированных клеток; репортерные гены для отбора трансгенных растений; полилинкер (уникальные сайты рестрикции), в который будет клонирован чужеродный фрагмент ДНК; не содержать онкогены.

p. BR 322 Ti -плазмида + T- ДНК p. BR 322 Ген растения Встраивание гена растения в несущественный участок Т-ДНК p. BR 322 Agrobacteria Гомологичная рекомбинация с Ti -плазмидой Ti -плазмида со встроенным геном ДНК растения. Интеграция Т-ДНК с новым геном в геном растения. Схема конструирования вектора на основе Ti -плазмиды

Бинарный вектор Коинтегративный вектор Ген интереса П ЛГомологичный участок ori E. coli ori A. tumefaciens Бактериальный селективный маркерный ген Гены vir. Рекомбинантная Ti -плазмида. Растительный селективный маркерный ген. Ген интереса ПЛ ori A. tumefaciensori E. coli селективный маркерный ген и для E. coli, и для A. tumefaciens. Растительный селективный маркерный ген Хелперная плазмида, содержащая vir -гены+

неомицинфосфотрансфераза гигромицинфосфотрансфераза дигидрофолатредуктаза хлорамфеникол-ацетилтрансфераза гентамицин-ацетилтрансфераза нопалинсинтаза октопинсинтаза β-глюкоронидаза стрептомицинфосфотрансфераза фермент, обуславливающий устойчивость к блеомицину люцефераза светляка бактериальная люцефераза треониндегидротаза металлотионеин II енол-пирувилшикимат-3 -фосфатсинтаза фосфинотрицин-ацетилтрансфераза β-галактозидаза бластицидин S -дезаминаза ацетолактатсинтаза бромоксинилнитраза Репортерные и селективные маркеры

Репортерные гены Ген GFPGFP Ген GUSGUS Ген LUXLUX

Биолюминисценция у Aequoria victoria aequorin Зеленый флюоресцентный белок

Репортерные гены

Методы трансформации растений Физические Химические Биологические • Микроинекция • Электропорация • Biolistics — gene gun/ particle bombardment • Silicon carbide whiskers • Lazer mediated transformation • SA(A)T • PEG • DEAE- декстран • Кальций фосфат • Липосомы • A. Tumefaciens • A. Rhizogenes • Вирус опосредованная трансформация In planta

Biolistics / gene gun

Микроинъекция

Трансформация картофеля Agrobacterium Образование микроклубней (1 мес. ) Иннокуляция клубневых дисков A. tumefaciens (15 с) Регенерация побегов Укоренение на среде, содержащей Km устойчивых к норфлуразону регенерантов. Селекция на среде, содержащей 100 мг / л Km. Ко — культивация с A. tumefaciens (3 д) Ночная культура A. tumefaciens

Трансформация гороха Agrobacterium Спелый горох 96% этанол, 20 минут Удаление корней и разделение горошины на 2 -4 части Среда B 5: + 0, 5 мг / л 2 -4 D 4, 5 мг / л BAP Среда MS: + 5 мг / л BAP 2 мг / л NAA , с Agrobacterium Среда MS: + 5 мг / л BAP 2 мг / л NAA , 500 мг / л Cf , 5 мг / л Basta Среда MS: + 5 мг / л BAP 2 мг / л NAA , 500 мг / л Cf , 5 мг / л Азацетидин. Фильтровальная бумага. Вакуум Агробактериальная суспензия 48 ч 20 д ПЦР, GUS окрашивание

Обнаружение явления косупрессии у растений (Alexander R. van der Krol, et a 1 1 990) Окраска лепестков петуньи, трансформированной генетическими конструкциями: 35 S : : DFR и 35 S : : CHS Гены DFR и CHS контролируют биосинтез пигментов: -ген DFR -кодирует дихлорфлавонол-4 -редуктазу -ген CHS -кодирует халкон-синтазу

Механизмы замолкания генов Эффект положения Не влияет на экспрессию гомологичных генов • положение на хромосоме • гетерохроматизация • MAR-районы ДНК • энхансеры и сайленсеры Эффект гомологии Подавление экспрессии гомологичных генов

— з акодированные в геноме растений (эндогенные) — регулирую т экспрессию генов за счет разрезания транскрипта или репрессии трансляции — и грают важную роль в развитии растений. «Малые» РНК растений, обеспечивающие сайленсинг: si. RNAs (small (short) interfering RNAs) mi. RNAs (micro. RNAs) контролирую т сайленсинг транспозонов или трансгенов через изменения хроматинаиз транспозонов или трансгенных промоторов о беспечиваю т: — противовирусный ответ — сайленсинг трансгена посредством деградации м. РНКвирусного / трансгенного происхождения

Роль mi. RNAs в развитии растений развитие цветка развитие листа развитие корня mi. R 170, mi. R 171 (GRAS транскрипционные факторы ) mi. R 164 (NAC 1)mi. R 172 (AP 2 и AP 2 — подобные транскрипционные факторы ) mi. R 172, mi. RNA EAT (TOE) mi. R 164 (CUC 1, CUC 2, ) mi. R 165 (PHABULOSA, PHAVOLUTA, REVOLUTA) mi. RNA- JAW (TCP 2 -4, TCP 10, TCP 24))метаболизм mi. RNA mi. R 162 (DCL) mi. R 168 (AGO)

Генетичекий контроль экспрессии гена ТСР 4 JAW локус синтез mi РНК расщепление m РНК гена TCP 4 ограниченная (нормальная) активность белка TCP 4 аберрантная активность TCP

A. wt B. ap 2 -9 C. 35 S : : MIR 172 a-1 Фенотип трансгенных растений 35 S: : MIR 172 a-1 повторяет фенотипическое проявление мутации ap 2 -9 mi. R 172 регулирует экспрессию гена AP 2 Ч Л Т П A B C AP 3/PI AG Мутация ap 2 : П T Т П

Белки, участвующие в метаболизме «малых» РНК у растений • DCL 1 (DICER-like) – рибонулеказа, участвующая в процессинге mi. RNA • HYL 1 (HYPONASTIC LEAVES) ядерный ds. RNA-связывающий белок HEN 1 (HUA ENHANCER 1) HEN 1 и HYL 1 участвуют в ядерном процессинге «малых» РНК • HST (HASTY) – гомолог экспортина, участвует в транспорте mi. RNA из ядра в цитоплазму • AGO (ARGONAUTE)- рибонуклеаза, компонент RISC ( RNA-induced silencing complex)