Антитіла (antibody=AB). Будова і властивості. Гени імуноглобулінів. Біосинтез

Антитіла (antibody=AB). Будова і властивості. Гени імуноглобулінів. Біосинтез антитіл.

Тема 4. Антитіла: будова і властивості

Основні функції антитіл

Антитіла – продуковані В- лімфоцитами глікопротеїни, відкриті як γ- глобулінова фракція сироватки крові, що здатні специфічно взаємодіяти з антигеном. В 1972 році Родні Портер та Джеральд Едельман отримали Нобелівську премію за вивчення структури імуноглобулінів. Згідно з їхніми дослідженнями було створено модель молекули антитіла

Будова антитіла Структура IgG

Будова антитіл

Структура імуноглобулінів Н-важкі поліпептидні ланцюги 5 класів ланцюгів - відповідні класи (ізотипи) імуноглобулінів α-Ig A підкласи α 1, α 2 γ-Ig G підкласи γ1, γ2, γ3, γ4 δ-Ig D ε-Ig E μ-Ig M підкласи μ1, μ 2 L-легкі поліпептидні ланцюги 2 типи- κ, λ Підтипи 1κ і 4 λ

Доменна організація імуноглобулінів

Доменна організація імуноглобулінів (всередині-цілісна молекула білка, зліва-константні домени, справа – варіабельні домени)

Типова молекула імуноглобуліну. Структурна організація легкого ланцюга імуноглобуліну

Типова молекула імуноглобуліну. Виділено структурну організацію легкого ланцюга імуноглобуліну

Надродина імуноглобуліноподібних молекул, яка нараховує у людини приблизно 765 членів

Імуноглобуліни - глікопротеїни, містять до 12% вуглеводневих залишків. Олігоцукор (N-aцетилглюкозамін, манноза,галактоза), що зв’язаний N-глікозидним зв’язком із залишком аспарагіну у Fc фрагменті Ig G

Будова імуноглобулінів: варіабільні (V-variable) і константні (С-constant ) домени

Будова імуноглобулінів HV- hypervariability regions- гіперваріабельні ділянки = CDR-complementarity - determining regions(більш загальний термін); FR- framework region- каркасні ділянки =регіони зрізу

Будова імуноглобулінів. Організація активного центру антитіл Організація VL – варіабельного домену легкого ланцюга, що структурує активний центр антитіла

Четвертинний рівень організації імуноглобулінів

Протеолітична фрагментація молекули антитіла

Класи імуноглобулінів

IgM 5-10% сироваткових Ig, Мм мономерної форми- 190 кДа, пентамерної форми - 970 кДа

Форми IgM Вільний IgM (не зв'язаний з антигеном) може набувати форми зірки, а IgM, зв'язаний з антигеном, що містить лінійно повторювані епітопи, набуває форми краба (на підставі мікрофотографій R. Feinstein і співавт.).

IgM

IgG 70-80% сироваткових Іg, Мм в середньому 150 кДа

Процес опсонізації

IgА 13-15 % сироваткових Іg, Мм в середньому 150 кДа

Механізм переносу sІgА через епітеліальну клітину

IgЕ 0,002 % сироваткових Іg, Мм в середньому 190 кДа

Функціонування IgE

ІgD 2 % сироваткових Іg, Мм в середньому 185 кДа

Ig D

Середня концентрація у сироватці (мг/мл)

Будова активного центру антитіл 1. До складу активного центру антитіла входять гіперваріабільні амінокислотні залишки. 2. Зв'язок антигену з антитілом не ковалентний, а іонний, водневий , гідрофобний, Ван-дер-Ваальсівський. 3. Розміри активного центру, де може розміститися 5-6 залишків амінокислот чи глюкози, становлять, відповідно, 1,5х0,6х0,8 нм і можуть варіювати у різних антитіл. 4. Активний центр - це порожнина, заглиблена у Fv фрагмент приблизно на 1,5 нм. 5. У 70-ті роки 20 ст. було зроблено рентгеноструктурний аналіз мієломних імуноглобулінів, який підтвердив дані, отримані раніше, і показав, що активний центр антитіла - це порожнина, в утворенні якої беруть участь гіперваріабільні ділянки Fаb фрагменту, зближені у третинній структурі. За цими ж данними приблизно 10-12 амінокислотних залишків гіперваріабільних ділянок важкого і легкого ланцюга беруть участь у контактуванні з антигеном.

Будова активного центру антитіл

Будова активного центру антитіл Комплекс лізоциму курячого яйця з антитілом D1.3. Фіолетові- важкі ланцюги; легкі ланцюги-жовті; лізоцим-блакитний. Червоним позначено залишок глутаміну 121,що належить лізоциму, який міститься між двома V- доменами і утворює водневі зв’язки, що стабілізують взаємодію АГ-АТ

Будова активного центру антитіл

Чотири риси гуморальної імунної відповіді 1) універсальність: антитіла можуть бути виробленими проти будь-якого хімічного угрупування. Важко уявити, скільки повинно бути варіантів антитіл, якщо вважати, що кожний антиген потребує окремого антитіла; 2) специфічність: антитіла розрізняють о- чи p-положення функціональних груп, стереоізомери, білки, що відрізняються на один амінокислотний залишок; 3) гетерогенність: на один антиген виробляється багато типів (популяцій) антитіл, інколи більше 100 на одну антигенну детермінанту; 4) поліфункціональність: одне антитіло здатне зв'язувати більш, ніж один антиген. Поліфункціональність антитіл сприяє універсальності імунної відповіді, а гетерогенність - її високій специфічності.

Тема 5. Гени імуноглобулінів. Біосинтез антитіл 1976 р. С. Тонегава і співавт. довели можливість реаранжування генів 1987- Нобелівська премія за вивчення генів імуноглобулінів

Гени імуноглобулінів. Біосинтез антитіл Три кластери (локуси) генів імуноглобулінів: Н, κ, λ. У людини – Н- 14 хромосома, κ- 2 хромосома, λ- 22 хромосома. У миші - Н- 12 хромосома, κ- 6 хромосома, λ -16 хромосома. Входять V, C - гени важких і легких ланцюгів, J - гени (joining), D-гени (diversity). Кластер генів λ -ланцюга. 30 V генів, 4 (6) пар J λ -і Сλ – генів, які є зчепленими між собою. 2. Кластер генів κ –ланцюга. 40 V генів, 5 J-генів, 1 С κ -ген. Кластер генів Н-ланцюгів. Більше 1000 V- генів (функційні –51), 27 D-генів, 6 J-генів та С-гени всіх класів імуноглобулінів. V- сегменту передує ділянка ДНК, що кодує лідерний пептид (L).

Загальна характеристика хромосом людини (http://www.ensembl.org) Локус генів імуноглобулінів людини: Н- 14 хромосома, κ- 2 хромосома, λ- 22 хромосома

Організація локусу генів зародкової лінії , що кодують імуноглобуліни людини

Реорганізація (реаранжування) генів імуноглобулінів 1) сайт-специфічна рекомбінація VJ ( для генів легких ланцюгів)-одна рекомбінаційна подія; 2) сайт-специфічна рекомбінація DJ (1) і V+DJ (2)- для генів важкого ланцюга- дві рекомбінаційні події; 3) транскрипція цілого блоку V(D) J- intron- С; 4) сплайсинг РНК з утворенням функціонального транскрипту V(D)JC; 5) трансляція; 6) посттрансляційне відщеплення лідерної послідовності.

Транскрипційний промотор активується тільки після проходження рекомбінації, тобто транскрипція неперебудованої ДНК є неможливою

Схема перебудови генів імуноглобулінів: гени, що кодують варіабельні домени, утворюються в результаті сайт-специфічної рекомбінації

Стадії 0 A B C D E F Стадії дозрівання В-лімфоцитів (1)

0-лімфоїдна стовбурова кровотворна клітина. А-ранні про-В-клітини- не мають рецепторів В клітин, започатковується реаранжування DJ - сегментів в локусі важкого (Н) ланцюга імуноглобулінів, може відбуватись в обох гомологічних хромосомах. В- пізні про-В-клітини - V- DJ реаранжування генів (підлягає алельному виключенню - тобто проходить лише в одній хромосомі). На цій стадії перебудовуються гени і “експресується” важкий ланцюг в комплексі з сурогатним легким, що є сигналом для позитивної селекції цих клітин. С- великі пре-В-клітини- “експресують” пре-В-клітинний рецептор, мають форму бластів, утворюють клони : 6 поділів, не працюють рекомбінази. D- малі пре-В-клітини, перебудова генів легкого κ–ланцюга, який “експресується” на мембрані разом з перебудованим μ- важким ланцюгом. Непродуктивність одного гена -включається інший, якщо ні - перебудова генів в λ-локусі. E- незрілі В-клітини, мають сформовані Ig M-рецептори, але підлягають негативному відбору. На цій стадії В клітини виходять з кісткового мозку до селезінки і вступають на стадію дозрівання. F- зрілі наївні В-клітини, які рециркулюють (до зустрічі з антигеном). Таким чином, перебудова генів та синтез білкового продукту пов’язані з: а) перебудовою важкого ланцюга Іg на стадії про-В-клітин; б) перебудовою легкого ланцюга Іg на стадії пре-В-клітин. Стадії дозрівання В-лімфоцитів (2)

Джерела різноманіття антитіл Виділяють 6 можливих джерел різноманіття Іg : 1) множинність гаметних генів (існування копій майже кожного генного сегмента); 2) соматичні рекомбінації (урізноманітнення за рахунок сайт- специфічної рекомбінації варіабельних ділянок молекули); 3) вбудовування (інсерції) та делеції додаткових нуклеотидів=junction diversity=урізноманітнення з'єднань; 4) механізм комбінаторної диверсифікації (утворення можливих варіантів імуноглобулінів); 5) соматичний мутагенез; 6) генна конверсія (активація роботи псевдо-генів)

Джерела різноманіття антитіл

Механізми сайт- специфічної рекомбінації. Організація сигнальних послідовностей RSSs ( recombination signal sequences ) в процесі рекомбінації генів імуноглобулінів

Рекомбінація генних сегментів

Механізми сайт- специфічної рекомбінації. На етапах рекомбінації залучені: Продукти генів RAG1 і RAG2 - рекомбінази. Саме початок експресії цих генів є сигналом для початку перебудови генів імуноглобулінів. У складному процесі рекомбінації на етапі з'єднання кінців ДНК беруть участь білки, які працюють в системі репарації дволанцюгових розривів ДНК [ консервативний процес NHEJ = nonhomologous DNA end-joining = негомологічне з'єднання кінців ДНК], модифікації кінців розривів і т. д., а саме: ДНК-залежна протеїнкіназа (DNA-PK) , білок Ки (гетеродимер Ки 70:80), який асоціює з DNA-PK, ендонуклеаза Artemis, процес лігування відбувається за участі ДНК-лігази IV та ДНК-репараційного білка XRCC4 , ендо- та екзонуклеази, термінальні дезоксинуклеотидил-трансферази (TdT), полімерази та інші.

Механізм сайт- специфічної рекомбінації

Механізм сайт- специфічної рекомбінації (RAG-залежна рекомбінація) генів V-області імуноглобулінів

Схема приєднання нуклеотидів Р до рекомбінуючих генів D і J М.Якобисяк ”Імунологія” : “Спочатку відбувається перерізання подвійної ДНК на межі сигнальних і кодуючих послідовностей з утворенням характерних "шпильок для волосся". Потім ці "шпильки" відкриваються в місцях, позначених ламаними стрілками. Виникають одноланцюгові відрізки ДНК, в яких два останні нуклеотиди комплементарні до нуклеотидів початкової послідовності (нуклеотиди Р-паліндромні). Тепер може відбутись і видалення, а також приєднання поодиноких нуклеотидів (не позначене на рисунку). Після приєднання комплементарних нуклеотидів відбувається відновлення кодуючої послідовності ДНК”

P-i N- нуклеотидні вставки при з’єднанні кодуючих сегментів генів імуноглобулінів

Будова імуноглобулінів Кодування CDR- complementarity determining regions Рекомбінація запускає транскрипцію перебудованого ланцюга, що припиняє рекомбінацію інших варіантів відповідного гену і, таким чином, визначає клональний характер лімфоцитів: кожна клітина продукує антитіла тільки однієї специфічності. Гіперваріабільні ділянки V -доменів (CDRs) кодуються: на легкому ланцюгу: CDR 1, CDR 2 — на V- гені, CDR3 - на з'єднанні VJ; на важкому ланцюгу: CDR 1, CDR 2 - на V- гені, CDR 3 - на D-сегменті. У будові активного центру антитіл беруть участь продукти V-, D- і J- генів.

Події, що відбуваються при синтезі легких ланцюгів В процесі дозрівання в результаті рекомбінації ДНК відбувається зближення одного із V та J сегментів (V + J) – 1 рекомбінаційна подія. При цьому всі гени, що знаходяться між ними, видаляються із хромосомної ДНК (ДНК-сплайсинг). Після з сайту ініціації транскрипції вказаного V – гена починається транскрипція з лідерної ділянки, яка закінчується на термінаторі транскрипції С- гена. Утворена пре-мРНК підлягає сплайсингу, при цьому видаляються інтрони та додаткові J-сегменти, проходить з′єднання екзонів варіабельної і константної області та лідерної послідовності, після кепування та поліаденілювання така мРНК транслюється у легкий ланцюг каппа (κ) типу або за такими ж правилами – лямбда (λ) типу, не дивлячись на те, що в останньому J і С- сегменти є зчепленими. Для генів легких ланцюгів: V-сегмент кодує 1-95 амінок.зал., J сегмент-96-108, далі - С-сегмент. (Всього-220-230 а.з.).

Події, що відбуваються при синтезі легких ланцюгів

Утворення легких κ- ланцюгів імуноглобулінів

Утворення легких λ- ланцюгів імуноглобулінів

Події, що відбуваються при синтезі важких ланцюгів При формуванні функційного гену важкого ланцюга відбувається ряд перебудов на рівні ДНК, а саме 2 рекомбінаційні події (V +D J ). Спочатку відбувається об'єднання вибраних D J сегментів. При цьому всі сегменти ДНК, що є між ними, делетуються. На другому етапі - об'єднання перебудованих D J з V сегментами з наступним видаленням всіх проміжних сегментів ДНК. Таким чином шляхом рекомбінації V, D, J сегментів утворюється перебудований V ген (ДНК-сплайсинг). Нижче J генів розташовані всі гени (відстань між V і С – 8,5 тис. п.н.) константних областей. Розпочинається транскрипція, яка закінчується на термінаторі транскрипції, що розташований після кластера генів Сμ і С δ. Перед кожним Сн екзоном, крім Сδ, містяться ділянки переключення - світч- сайти (SWITCH SITE=S), які побудовані з нуклеотидних послідовностей, що повторюються, і є в основному схожими на послідовності switch site перед екзоном Сμ. Саме switch site дозволяють певному Сн гену рекомбінувати з перебудованим геном варіабельних доменів (VDJ). Утворена пре-мРНК підлягає сплайсингу, при цьому видаляються інтрони та додаткові J і D сегменти, проходить з′єднання екзонів варіабельної і константної області та лідерної послідовності, після кепування та поліаденілювання така мРНК транслюється. Для важких ланцюгів- V –кодує 1-99 амінок. зал, D -100-107 амінок. зал, J- 108-123 амінок. зал. Всього- від 440-450 амінокислот (крім IgM і IgЕ).

Схема збірки активного гена важкого ланцюга імуноглобулінів

Події, що відбуваються при синтезі важких ланцюгів

Схема збірки активного гена важкого ланцюга імуноглобулінів

Важкі ланцюги імуноглобулінів Червоні малі квадратики - switch site (sequence) μ δ γ3 γ1 γ2b γ2a ε α S - switch site (sequence) мають колір, відповідний певним Сн - генам

Ізотипи імуноглобулінінів кодуються кластерами генів константних доменів важких ланцюгів

Механізми диверсифікації (різноманітності) = (diversification) імуноглобулінів Комбінаторна диверсифікація (див. табл.кластерів генів) 1) L -ланцюги : λ -ланцюг - VJ: 30Vх 4J λ = 120; κ –ланцюг- VJ: 40V х 5Jк =200; 120 + 200= 320 варіантів L-ланцюга 2) Н ланцюги: DJ: 27D х 6J = 162; V(DJ): 51 х 162 = 8262; D ген має три вірогідні рамки зчитування: 8262 х 3 = 24786 варіантів Н-ланцюга. 3) Комбінація Н х L: 320 х 24786 = 7,9 х 106 4. Мутації у сайтах рекомбінації, генна конверсія, випадковість сайтів розщеплення за участі ендонуклеази Artemis, додавання Р і N -нуклеотидів - додають різноманітності >108

Соматичний гіпермутагенез (активаційно-індукована дезаміназа (АІD), урацил-ДНК-глікозилаза (UNG))

Алельне виключення

Переключення з мембранної на секретовану форму- на прикладі ІgМ

SC = Secretion Сoding; pAs- polyadenylation site МС= Мembrane Сoding;pAm - polyadenylation site

SC = Secretion Сoding; pAs- polyadenylation site МС= Мembrane Сoding; pAm- polyadenylation site

Переключення з мембранної на секретовану форму- на прикладі ІgМ

Переключення класів імуноглобулінів

Переключення класів імуноглобулінів μ

Переключення класів імуноглобулінів за участі class- switch рекомбінації (активаційно-індукована дезаміназа (АІD), урацил-ДНК-глікозилаза (UNG), апурин/апиримідин- ендонуклеаза (АРЕ1)

Переключення з IgM на IgG

Синтез і транспорт Ig М у мембрани й у позаклітинний простір: 1-1- цис-; 2 - транс- сторони апарата Гольджі

Додатки