69 АППАРАТ ТРАНСЛЯЦИИ Особенности структуры тРНК «клеверный лист»

69 АППАРАТ ТРАНСЛЯЦИИ Особенности структуры тРНК «клеверный лист» L-конфигурация Акцепторами для одной и той же аминокислоты могут служить несколько разных тРНК (изоакцепторные тРНК), имеющих разные антикодоны, что позволяет им спариваться с кодонами-синонимами.

70 Образование аминоацил-тРНК Aminoacyl tRNA synthetase for aspartic acid (Class II aaRS). It is a dimer of two identical subunits (blue and green); tRNA molecules are shown in red.

Состав рибосом Прокариоты Эукариоты Selected views of the 70S ribosome of E. coli as obtained by cryo-electron microscopy of single ribosomes and reconstruction using 4300 projections (Frank et al., Nature 376 (1995) 441-444). Yellow: 30S subunit, blue: 50S subunit. 71 (L1-34) (S1-21)

72 Строение рибосом A P E К анимации: 5S(50S) - желтый; 23S(50S) и 16S(30S)-красный; белки - синие каталитический аденин (50S)-зеленый

73 Особые тРНК и некоторые вспомогательные белки, участвующие в трансляции Как у про-, так и у эукариот имеются два вида тРНК, которые связывают метионин. У прокариот они обозначаются как тРНКMetF и тPHKMetM, а у эукариот - тРНКMetI и тРНКMetM. Известны белки, которые только временно, на период трансляции, связываются с рибосомами. К ним относятся: факторы инициации IF-1, IF-2 и IF-3 факторы элонгации EF-Tu и EF-Ts, EF-G факторы «освобождения» RF-1, RF-2 и RF-3 комплекс EF-Tu - тРНК

74 ТРАНСЛЯЦИЯ мРНК У ПРОКАРИОТ Полипептидные цепи синтезируются однонаправленно: с N-конца к C-концу. При этом карбоксильная группа уже образовавшегося участка полипептидной цепи соединяется с аминогруппой следующей присоединяемой аминокислоты пептидной связью. Трансляция продолжается в направлении 5' → 3' до тех пор, пока не достигнет стоп-сигнала, расположенного сразу же за кодоном, детерминирующим С-концевую аминокислоту

75 Инициация трансляции IF-2 способен узнавать fMet-РНКMetF, но не Met-тРНКMetM При связывании IF-1 и IF-3 с 30S-субчастицей происходит диссоциация 70S-рибосомы IF-1 связывается с 30S-субчастицей в А сайте и препятствует входу аминоацил-тРНК в P-сайт, увеличивает сродство IF-2 к рибосоме IF-3 обнаружен не у всех бактерий, но у E. coli он необходим для связывания 30S с мРНК в инициаторном сайте.

76 Инициация трансляции Богатая пуринами последовательности из пяти-восьми нуклеотидов, последовательность Шайна-Дальгарно или SD-последовательность

77 Элонгация полипептидной цепи На рибосоме три сайта связывания тРНК (Aminoacyl) (Peptidyl) (Exit)

78 Элонгация полипептидной цепи Связывание аминоацил-тРНК в А-сайте и освобождение тРНК из Е-сайта

Structures of the ribosome associated with elongation factors, and apo-form crystal structures of elongation factors The ribosomal RNAs are colored gray, the 50S subunit proteins are colored green, and the 30S subunit proteins are colored dark blue. The P-site tRNA is shown in light blue, and the E-site tRNA is shown in yellow as surface representations. (b) Left, the Thermus aquaticus EF-Tu·GDPNP·Phe-tRNAPhe complex (PDB 1TTT) (EF-Tu, elongation factor Tu); right, Thermus thermophilus EF-G·GDP (PDB 1DAR) (EF-G, elongation factor G). (c) Structure of EF-Tu and aminoacyl-tRNA bound to the ribosome. Overall view of the complex, with EF-Tu and tRNAs. Note that aminoacyl-tRNA (orange) bound to EF-Tu (purple) is in the ‘A/T state’. (d) EF-G in the posttranslocational state of the ribosome. Overall view of EF-G (purple) on the ribosome. Wiley Interdiscip Rev RNA. 2011. 2(5): 647-68

79 Терминация синтеза полипептидной цепи Сигналом терминации служат терминирующие (стоп, «nonsense») кодоны мРНК UGA - amber UAG - opal UAA - ochre Факторы терминации (release factors) RF-1 узнает UAA или UAG RF-2 узнает UAA или UGA RF-3 облегчает работу RF-1 и RF-2 1. RF-1 или RF-2 вместо тРНК связыватся с кодоном в сайте A 2. Пептидилтрансфе-раза катализирует реакцию молекулы воды с активированной пептидной цепью 3. Полипептидная цепь освобождается 4. тРНК и мРНК освобождаются 5. 50S и 30S субчастицы диссоциируют

Essential steps in translation. The 30S (blue) and 50S (green) subunits harboring the decoding center (DC) and peptidyl-transferase center (PTC), with the mRNA (yellow) bound to the 30S subunit. The three different positions for tRNA molecules are indicated as the A, P, and E sites. In the elongation cycle, the incoming aminoacyl-tRNA is delivered to the empty A site of the ribosome as a ternary complex with elongation factor Tu (EF-Tu; purple) and GTP. After GTP hydrolysis, the peptidyl-tRNA in the P site donates its growing polypeptide to the amino acid on the tRNA in the A site. The newly formed peptidyl-tRNA is then translocated from the A to the P site. Simultaneously, the deacylated tRNA in the P site is moved into the E site. Protein synthesis terminates when a stop codon enters the DC of the ribosome. Release factor (RF; red) binds to the empty A site of the termination state of the ribosome, with a deacylated tRNA in the E-site and a peptidyl-tRNA in the P-site, recognizes the stop codon, and triggers peptidyl-tRNA hydrolysis. tRNA mimicry in translation termination and beyond Yoshikazu Nakamura and Koichi Ito Wiley Interdiscip Rev RNA. 2011. 2(5): 647-68 (RF1, RF2) (RF3)

Recognition of the stop codon in the decoding center (DC) by RF1 and RF2. (a) RF1 (the PVT motif) reading UAA (PDB code: 3D5A). (b) RF1 (the PVT motif) reading UAG (PDB code: 3MR8).39 (c) RF2 (the SPF motif) reading UAA (PDB code: 3F1E).31 (d) RF2 (the SPF motif) reading UGA (PDB code: 2WH1). Recognition of the stop codon in the decoding center by RF1 and RF2

80 ТРАНСЛЯЦИЯ После трансляции кодирующей последовательности рибосомы начинают новый раунд. Диссоциация субчастиц контролируется фактором инициации IF-3 совместно с IF-1, которые таким образом осуществляют общий контроль уровня белкового синтеза.

81 ОБЩИЕ ОСОБЕННОСТИ ПРОЦЕССА ТРАНСЛЯЦИИ Одновременная трансляция молекулы мРНК более чем одной рибосомой Образование полирибосомы. После того как одна рибосома удалится из сайта инициации на расстояние 100-200 нуклеотидов, следующая образует инициаторный комплекс в том же сайте и начинает трансляцию

82 Трансляция бактериальных мРНК осуществляется параллельно транскрипции

83 Взаимодействие кодона и антикодона. Неоднозначное соответствие тРНКTyr тРНКGlu тРНКLys тРНКTrp тРНКSer1 тРНКSer2 тРНКSer3

84 Неоднозначное соответствие 1. Некоторые аминокислоты могут доставляться к рибосоме несколькими типами тРНК, имеющими разные антикодоны. В тоже время другие аминокислоты доставляются к рибосоме только одной тРНК. 2. Некоторые типы тРНК могут доставлять их специфическую аминокислоту распознавая несколько кодонов, что является следствием потери специфичности спаривания нуклеиновых оснований на одном конце кодона и антикодона. Такое “небрежное” спаривание получило название неоднозначное соответствие или “качание” (wobble). U, С, A, G - четыре обычных основания РНК; Нх - дезаминированная форма аденина - гипоксантин Wobble rules (Ser)

85 Неоднозначное соответствие тРНКTyr тРНКGlu тРНКLys тРНКTrp тРНКSer1 тРНКSer2 тРНКSer3

86 Мутации в кодонах и антикодонах Трансляционная супрессия терминирующих кодонов Трансляционная супрессия миссенс-мутаций AUC CUA ААА UCU GUA AUA CAG AUG GGC Ile-Leu-Lys-Ser-Val-Ile-Gln-Met-Gly- AUC CUA UAA UCU GUA AUA CAG AUG GGC Ile-Leu- нонсенс-мутация

87 ТРАНСЛЯЦИЯ мРНК У ЭУКАРИОТ Транскрипция и трансляция мРНК прокариот Транскрипция, процессинг и трансляция мРНК эукариот

136 Структура эукариотической мРНК 7-метилгуаниловая кислота (кэп) Первичный транскрипт Последовательность Козак

Каноническая инициация трансляции у эукариот Схема предполагаемого расположения факторов инициации на 40S рибосомной субчастице. Вид со стороны головки. Номера соответствуют номенклатуре факторов инициации (eIF). Составлено по данным криоэлектронной микроскопии. Модель сканирования, основанная на предотвращении обратного движения инициаторного комплекса путем циклического связывания фактора eIF4B с мРНК. 136.5 Успехи биологической химии, т. 52, 2012, с. 127–156

ДЛЯ ТОГО, ЧТОБЫ ПОЛУЧИТЬ БЕЛОК, НУЖНО ОБЕСПЕЧИТЬ ТРАНСКРИПЦИЮ И ТРАНСЛЯЦИЮ ГЕНА 136.6