13.12.2017 Свергун В.Т. 1 БЕЛКИ 4 МАТРИЧНЫЕ БИОСИНТЕЗЫ-

13.12.2017 Свергун В.Т. 1 БЕЛКИ 4 МАТРИЧНЫЕ БИОСИНТЕЗЫ- РЕПЛИКАЦИЯ, ТРАНСКРИПЦИЯ Лекция доцент Свергун В.Т.

13.12.2017 Свергун В.Т. 2

13.12.2017 Свергун В.Т. 3 Содержание лекции 1. Формы спирали ДНК 2.Условия и этапы репликации ДНК 3.Принципы транскрипции 4.Геном 5.Альтернативный сплайсинг 6. Белок р53

13.12.2017 Свергун В.Т. 4 Митохондриальные рибосомы похожи на рибосомы эукариот, но меньше по размеру

13.12.2017 Свергун В.Т. 5 Существуют несколько форм двойной спирали ДНК. Формы двойной спирали ДНК А – форма В – форма С - форма А– форма важна для процессов транскрипции. С– форма необходима для хранения информации. В– форма адекватна для репликационных процессов

13.12.2017 Свергун В.Т. 6 Условия репликации: 1.Энергия всех дезоксирибонуклеозидов- д АТФ,дТТФ, дЦТФ, дГТФ 2. Матрица для репликации новой молекулы 3. Стехиометрическое соотношение: m( дАТФ+ дTTF) + n(дГТФ + дЦТФ)---- ------------------- -ДНК +Н4Р2О7 Матрица ДНК

13.12.2017 Свергун В.Т. 7 Репликация ДНК бывает консервативной и полуконсервативной и происходит во время фазы S клеточного цикла. Процесс репликации начинается со специфической точки в молекуле ДНК ( область начала репликации). Образуются две репликационные вилки, которые двигаются в противоположных направлениях. Две цепи реплицируются одновременно

13.12.2017 Свергун В.Т. 8 Цикл эукариотической клетки

13.12.2017 Свергун В.Т. 9 Репликация

13.12.2017 Свергун В.Т. 10 Главные белки, вовлеченные в репликацию ДНК- полимеразы ---- добавляют нуклеотиды к растущей цепи в направлении 5/- к 3/, копируя образец 3/-----5/Праймаза---- синтезирует РНК праймер Геликаза - разделяет комплементарные цепи ДНК( нарушает дуплекс) Раскручивающиеся ДНК белки - препятствуют скручиванию ДНК Ферменты, которые удаляют праймер---гидролиз гибрида- ДНК-РНК, Flap-эндонуклеаза-1 –узнает первую порцию РНК около 5/ конца…….

13.12.2017 Свергун В.Т. 11 Главные белки, вовлеченные в репликацию ДНК- лигаза- соединяет, формируя фосфорноэфирные связи двух цепей ДНК Пролиферация клеточного ядра антигеном---------- Выраженность ДНК полимераз. Связывание многих белков представлено в репликационной вилке

13.12.2017 Свергун В.Т. 12 Поэтому на второй матричной цепи вначале синтезируются короткие фрагменты новой цепи ДНК, так называемые фрагменты Оказаки (ОF). Каждый такой фрагмент начинается с короткой РНК- затравки( праймера), которая необходима для действия ДНК-полимеразы –III

13.12.2017 Свергун В.Т. 13 Матричная цепь ДНК всегда читается в направлении 3'—5', поэтому только одна цепь считывается непрерывно ( это ведущая цепь). На отстающей цепи информация считывается в направлении противоположном движению репликационной вилки

13.12.2017 Свергун В.Т. 14 Каждая репликативная вилка включает по две молекулы ДНК-полимеразы, которые связаны с вспомогательными белками. К последним относят- ДНК-топоизомеразы ( гиразы), которые раскручивают плотно свернутую двойную спираль ДНК, и хеликазы, которые расплетают двухтяжевую ДНК на две цепи

13.12.2017 Свергун В.Т. 15 Семейства ДНК-полимераз На основании своей структуры ДНК-полимеразы могут быть разбиты на семь различных семейств: A, B, C, D, X, Y, и RT. Семейство A включает в себя репликативные и восстановительные ДНК-полимеразы Репликативные члены этого семейства представлены, хорошо исследованной ДНК-полимеразой вируса Т7 или эукариотической митохондриальной ДНК-полимеразой γ. Среди восстановительных полимераз есть такие примеры как E.coli полимераза I (Pol I), Thermus Aquaticus Pol I или Bacillus stearothermophilus Pol I. Восстановительные полимеразы участвуют в процессе устранения ошибок в ДНК, которая собирается, а также в обработке фрагментов Оказаки.

13.12.2017 Свергун В.Т. 16 ДНК полимеразы эукариот Эукариоты содержат минимум 15 видов ДНК-полимераз ДНК-полимераза α формирует комплекс с праймазы, которая синтезирует праймер ДНК, после чего полимераза присоединяет к этому праймера нуклеотиды. После того, как длина цепочки достигнет около 20 нуклеотидов , в транскрипции приступают полимеразы δ и ε; ДНК-полимераза β задействована в восстановлении ДНК; ДНК-полимераза γ, осуществляющая репликацию митохондриальной ДНК; ДНК-полимераза δ - основная полимераза эукариот. Она высокопроизводительная, а также 3'-5'-экзонуклеазну активность; ДНК-полимераза ε, иногда замещает ДНК полимеразу δ при синтезе 3'-5'-цепочки. Основное назначение этой полимеразы неясно; ДНК-полимеразы η, ι, κ и Rev1 из семейства Y, а также ζ из семейства B. Эти полимеразы задействованы в пропуске поврежденных участков ДНК Существуют также другие эукариотические ДНК-полимеразы, которые пока недостаточно изучены: θ, λ, φ, σ и μ, и некоторые другие.

13.12.2017 Свергун В.Т. 17 Семейство B В семейство B в основном входят восстановительные полимеразы, в частности основные эукариотические ДНК-полимеразы α, δ, ε, а также ДНК-полимераза ζ. К этому семейству также относят ДНК-полимеразы некоторых бактерий и бактериофагов, например бактериофагов T4, Phi29 и RB69. Отличительной особенностью полимераз этого семейства есть замечательная точность репликации. Многие также обладает сильной 3'-5'-экзонуклеазною действием (за исключением ДНК-полимераз α и ζ, которые не имеют способности корректировать ошибки)

13.12.2017 Свергун В.Т. 18 Семейство X К семейству Х относится широко известная эукаричная ДНК-полимераза β (Pol β), а также σ, λ, μ и конечная дезоксинуклеотидил-трансфераза (TDT). ДНК-полимераза β необходима для осуществления процесса восстановления поврежденных участков ДНК. Полимеразы λ и μ участвуют в негомологические соединении - процессе восстановления разрывов двойной спирали. TDT експрессуется только в лимфоидной ткани и добавляет "N нуклеотидов" к разрывам двойной спирали, образующиеся при В (Р) С рекомбинации. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae имеют только одну полимеразу X, Pol 4, участвующего в негомологические соединении

13.12.2017 Свергун В.Т. 19 Семейство C Полимеразы этого семейства - в основном бактериальные хромосомные репликативные ферменты, имеющие, кроме того, 3'-5'-экзонуклеазну активность. Семейство D Полимеразы этого семейства недостаточно изучены. Все известные образцы считаются репликативной полимеразами и обнаруженные у архей типа Euryarchaeota

13.12.2017 Свергун В.Т. 20 Семейство Y Полимеразы этого семейства отличаются от других низкой производительностью на целостных шаблонах, а также способностью осуществлять репликацию на шаблонах поврежденной ДНК. Вследствие этого члены семейства называются полимеразами транслезийного синтеза (ТЛС-полимеразы). В зависимости от характера повреждения (лезвии) ТЛС-полимеразы могут восстановить начальную цепочку. Ошибка может и не быть восстановлена, что приводит к мутаций

13.12.2017 Свергун В.Т. 21 Семейство Y Так пациенты, страдающие от пигментной склеродермы, имеют в своем геноме мутантную ДНК полимеразу η (ета), что может без ошибок восстанавливать повреждения, вызванные ультрафиолетом, однако другие полимеразы, например ζ (относящийся к семейству B), приводят к ошибкам, что, как считается, приводит к предрасположенности к онкологическим заболеваниям Другие члены этого семейства - человеческие полимеразы ι, κ, а также конечная дезоксинуклеотидил-трансфераза Rev1. Семейство RT Семейство обратной транскриптазы (название семейства происходит от англ. reverse transcriptase ) Содержит полимеразы, обнаружены как в ретровирусов, так и у эукариот. Эти полимеразы используют шаблонную РНК для синтеза цепи ДНК

13.12.2017 Свергун В.Т. 22 Полимеразы бактерий У бактерий обнаружено пять ДНК-полимераз: ДНК-полимераза I - задействована в восстановлении ДНК, имеет как 5'-3 ', так и 3'-5'-экзонуклеазну активность; ДНК-полимераза II - участвует в репликации поврежденной ДНК. Обладает способностью 5'-3'-элонгации и 3'-5'-экзонуклеазну активность; ДНК-полимераза III - основная полимераза бактерий, имеет также 3'-5'-экзонуклеазну активность; ДНК-полимераза IV - ДНК-полимераза семейства Y; ДНК-полимераза V - ДНК-полимераза семейства Y, участвующего в пропуске поврежденных участков ДНК.

13.12.2017 Свергун В.Т. 23

13.12.2017 Свергун В.Т. 24

13.12.2017 Свергун В.Т. 25 Репликация ДНК

13.12.2017 Свергун В.Т. 26

13.12.2017 Свергун В.Т. 27 Праймер синтезируется специальной РНК-полимеразой, с образованием олигорибонуклеотида, и достраивается ДНК полимеразой–III, до фрагмента с длиной 1000-2000 дезоксирибонуклеотидных звеньев

13.12.2017 Свергун В.Т. 28 Праймер синтезируется специальной РНК-полимеразой, с образованием олигорибонуклеотида, и достраивается ДНК полимеразой–III, до фрагмента с длиной 1000-2000дезоксирибонуклео тидных звеньев

13.12.2017 Свергун В.Т. 29 Семейство B В семейство B в основном входят восстановительные полимеразы, в том числе основные эукариотические ДНК-полимеразы α, δ, и ε. К этому семейству также относят ДНК-полимеразы некоторых бактерий и бактериофагов, например бактериофагов T4, Phi29 and RB69. Эти ферменты используются в синтезе и 3’-5’, и 5’-3’ моноцепей ДНК. Отличительной особенностью полимераз этого семейства является замечательная точность репликации. Многие также обладает сильным 3’-5’-экзонуклеазным действием (за исключением ДНК-полимераз α и ζ, которые ошибки не корректируют

13.12.2017 Свергун В.Т. 30 Семейство C Полимеразы этого семейства — в основном бактериальные хромосомные репликативные ферменты, обладающие, кроме того, 3’-5’-экзонуклеазным действием Семейство D Полимеразы этого семейства недостаточно изучены

13.12.2017 Свергун В.Т. 31 Семейство X К семейству Х относится широко известная эукариотическая ДНК-полимераза β, а также другие, такие как σ, λ, μ и концевая дезоксинуклеотидил- трансфераза (TdT). ДНК-полимераза β необходимого для осуществления процесса восстановления поврежденных участков ДНК. TdT экспрессируется только в лимфоидной ткани и добавляет «n нуклеотиды» к разрывам двойной спирали, образующимся во время В(Р)С-рекомбинации. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae обладают лишь одной полимеразой X, Pol4, участвующей в негомологическом соединении.

13.12.2017 Свергун В.Т. 32 Семейство Y Полимеразы этого семейства отличаются от других низкой скоростью и способностью вести репликацию на шаблонах поврежденных ДНК. Поэтому их называют ферментами семейства (полимеразами) транслезионного синтеза. Характер повреждения (лезии) влияет на ТЛС- полимеразу и восстановление исходной цепочки. Ошибка может и не быть исправленной, что приводит к мутациям.

13.12.2017 Свергун В.Т. 33 Страдающие Xeroderma pigmentosum, например, обладают мутантным геном ДНК-полимеразы η (eta), который толерантен к повреждениям, однако другие полимеразы, например ζ (относящаяся к семейству B), указывают на предрасположенность к онкологическим заболеваниям

13.12.2017 Свергун В.Т. 34 Функции некоторых ДНК полимераз эукариот

13.12.2017 Свергун В.Т. 35 Условия транскрипции 1.Субстратами для РНК- полимераз служат рибонуклеозидтрифосфаты 2. Матрица ДНК 3, Факторы транскрипции — это белки, продукты других, независимых генов. Они являются опосредованно действующими факторами

13.12.2017 Свергун В.Т. 36 Они являются опосредованно действующими факторами. Для процесса транскрипции генов требуются не только РНК- полимераза, но и другие белки, факторы транскрипции. Установлено, что у эукариот таким фактором является ТАТА-Вох Binding Protein, TBP), который взаимодействует с основным регуляторным элементом ТАТА-боксом, присутствующим в большинстве генов

13.12.2017 Свергун В.Т. 37 4. Дополнительные факторы могут влиять на инициацию транскрипции, связываясь с другими регуляторными элементами Они взаимодействуют с основным транскрипционным комплексом, активируя, или ингибируя его Такие факторы активируют, например, комплексы стероидных гормонов с рецепторами.

13.12.2017 Свергун В.Т. 38 Дополнительные факторы, которые влияют на транскрипцию

13.12.2017 Свергун В.Т. 39 Принципы транскрипции 1.Комплементарность 2. Антипараллельность 3. Униполярность 4. Беззатравочность 5. Асимметричность.

13.12.2017 Свергун В.Т. 40 Транскрипция осуществляется ДНК-зависимыми РНК-полимеразами. Они действуют подобно ДНК-полимеразам, за исключением того, что включают в синтезируемую цепь РНК (RNA) рибонуклеотиды, вместо дезоксирибонуклеотидов, и не нуждаются в праймерах. Эукариотические клетки обычно содержат три различных типа РНК-полимераз.

13.12.2017 Свергун В.Т. 41

13.12.2017 Свергун В.Т. 42 РНК-полимераза -1 катализирует синтез РНК с коэффициентом седиментации 45S, которая является предшественником трех различных рибосомных РНК ( 28S rRNA, 18S rRNa, 5,8S rRNA).

13.12.2017 Свергун В.Т. 43 РНК-полимераза-2 синтезирует гяРНК, которые служат предшественниками мРНК и мяРНК. РНК-полимераза- 3 транскрибирует гены, кодирующие тРНК, 5S РНК и некоторые мяРНК

13.12.2017 Свергун В.Т. 44 Типичная последовательность (каноническая) — ...ТАТААА... . Для взаимодействия полимеразы с этим участком необходимы несколько белков, основных факторов транскрипции. Дополнительные факторы могут либо стимулировать, либо ингибировать этот процесс (контроль транскрипции)

13.12.2017 Свергун В.Т. 45 Как уже упоминалось, РНК- полимераза II связывается с 3'-концом промоторного участка. Последовательность, обеспечивающая это связывание, так называемый ТАТА-бокс, короткий А- и Т-обогащенный участок, последовательность которого слегка варьирует у разных генов.

13.12.2017 Свергун В.Т. 46

13.12.2017 Свергун В.Т. 47 После инициации синтеза (2), РНК-полимераза движется в направлении 3'→5' матричной цепи. В процессе инициации фермент разделяет короткий участок двойной спирали ДНК на две отдельные цепочки. Нуклеозидтрифосфаты связываются комплементарно на кодирующей цепочке ДНК водородными связями и шаг за шагом присоединяются к растущей молекуле РНК

13.12.2017 Свергун В.Т. 48 Вскоре после начала элонгации 5'-конец транскрипта защищается «кэпом». Как только транскрипция доходит до сайта полиаденилирования (обычно это последовательность ...ААТААА... полимераза прекращает транскрипцию и диссоциирует от ДНК.

13.12.2017 Свергун В.Т. 49 Контроль транскрипции осуществляется структурами 2х типов. Большинство генов содержат в своем промоторном участке несколько коротких сегментов ДНК (DNA) (регуляторные элементы, цис-действующие элементы), с которыми могут связываться факторы транскрипции

13.12.2017 Свергун В.Т. 50 Регуляторные элементы, стимулирующие транскрипцию связанных с ними генов, называются энхансерами (усилителями, от англ. enhancer) Белки, подавляющие транскрипцию. — сайленсерами (успокоителями, от англ. silencer)

13.12.2017 Свергун В.Т. 51 По завершении транскрипции из гяРНК вырезаются интроны, содержащие некодирующие последовательности

13.12.2017 Свергун В.Т. 52 Созревание РНК Большинство клеток организма содержит полный набор генов Но обычно из этого набора используется крайне незначительный объем информации. Постоянно транскрибируются только те гены, которые кодируют структурные белки и ферменты промежуточного метаболизма. Кроме этих постоянно необходимых генов имеется много других генов, активных только в определенных типах клеток, при определенных метаболических условиях или во время дифференцировки

13.12.2017 Свергун В.Т. 53 Дополнительные факторы могут влиять на инициацию транскрипции, связываясь с другими регуляторными элементами. Отсюда они взаимодействуют с основным транскрипционным комплексом, либо активируя, либо ингибируя его. По завершении транскрипции из гяРНК вырезаются интроны, содержащие некодирующие последовательности.

13.12.2017 Свергун В.Т. 54 Процесс вырезания интронов

13.12.2017 Свергун В.Т. 55 Образование сплайсом

13.12.2017 Свергун В.Т. 56 Сплайсинг РНК катализируется комплексами белков с РНК, известными как «малые ядерные рибонуклеопротеидные частицы» Интроны, входящие в гяРНК (hnRNA), имеют специфические последовательности на 3'- и 5'-концах

13.12.2017 Свергун В.Т. 57 Сплайсинг РНК катализируется комплексами белков с РНК, известными как «малые ядерные рибонуклеопротеидные частицы» Интроны, входящие в гяРНК (hnRNA), имеют специфические последовательности на 3'- и 5'-концах

13.12.2017 Свергун В.Т. 58 В этой реакции принимают участие пять различных мяРНП (U1, U2, U4, U5 и U6). В каждой из реакций задействованы несколько белковых молекул и одна молекула мяРНК (snRNA).

13.12.2017 Свергун В.Т. 59 Во время сплайсинга комплексы из гяРНК и мяРНП образуют сплайсому. мяРНК в сплайсоме образуют канонические пары друг с другом и с гяРНК, фиксируя их реакционные группы. Катализ зависит от РНК-составляющей сплайсомы. Такие каталитические РНК носят название рибозимов

13.12.2017 Свергун В.Т. 60 На первой стадии сплайсинга ОН-группа аденозилового остатка, расположенного в интроне, атакует (при участии мяРНП) и расщепляет фосфодиэфирную связь на 5'-конце интрона (Одновременно в интроне образуется новая связь, которая придает ему форму петли. На второй стадии терминальная ОН-группа 5'-концевого интрона атакует связь в 3'-конце интрона В результате оба экзона соединяются, а интрон освобождается

13.12.2017 Свергун В.Т. 61 В генной инженерии часто требуется выделить отдельный, пока еще не охарактеризованный фрагмент ДНК (DNA), например, с целью определения его полной нуклеотидной последовательности. Такая задача решается путем создании библиотек кДНК. Библиотека ДНК состоит из большого количества векторных молекул ДНК, содержащих различные фрагменты чужеродной ДНК.

13.12.2017 Свергун В.Т. 62 Например, возможно получить все молекулы мРНК клетки в виде фрагментов ДНК - кДНК (англ. complementary DNA, cDNA) — и произвольно внедрить эти копии в векторные молекулы Библиотека генов может быть получена путем расщепления ДНК клетки на небольшие фрагменты рестриктазами и последующего встраивания этих фрагментов в векторную ДНК.

13.12.2017 Свергун В.Т. 63

13.12.2017 Свергун В.Т. 64 В качестве векторов для получения библиотек ДНК используются бактериофаги (сокращенно: фаги). Фаги — это вирусы, которые инфицируют бактерии, где их геном реплицируется вместе с бактериальным геномом. Библиотеки генов удобны тем, что в них легко вести поиск необходимых в данный момент фрагментов.

13.12.2017 Свергун В.Т. 65

13.12.2017 Свергун В.Т. 66 Работу начинают с того, что небольшую порцию ДНК, составляющую библиотеку (105-106 фагов), разбавляют, смешивая с клетками бактерии-хозяина, и помещают на питательную среду. Бактерии определенное время растут, образуя на питательной среде плотный мутный слой клеток. При этом бактерии, зараженные фагом, растут медленнее, чем неинфицированные клетки. Это приводит к образованию прозрачных кольцевых зон, «бляшек».

13.12.2017 Свергун В.Т. 67

13.12.2017 Свергун В.Т. 68 Клетки в «бляшке» содержат потомство фагов из первоначальной библиотеки. Образовавшиеся колонии переносят на нитроцеллюлозные или найлоновые фильтры, накладывая их на поверхность слоя в чашке, и слегка подогревают. Если теперь инкубировать фильтр с меченым олигонуклеотидным зондом, соответствующим нуклеотидной последовательности целевого фрагмента, произойдет гибридизация зонда с гомологичной последовательностью ДНК.

13.12.2017 Свергун В.Т. 69 Место связывания зонда можно определить по радиоактивной или иной метке. После этого выделяют фаг из положительных (несущих метку) бляшек и размножают обычным образом. Большие количества необходимого фрагмента получают с помощью расщепления ДНК рестриктазами.

13.12.2017 Свергун В.Т. 70

13.12.2017 Свергун В.Т. 71

13.12.2017 Свергун В.Т. 72

13.12.2017 Свергун В.Т. 73